CN101818132B - 嵌合狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)的构建及其生物学功能的研究 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重组病毒疫苗领域。本发明涉及一株嵌合狂犬病病毒rLEP333Q-L(H)弱毒疫苗株，其表达的狂犬病病毒rLEP糖蛋白第333位精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺(Gln)，同时将L基因替换为HEP的L基因。本发明还涉及生产所述病毒株的方法，以及所述病毒株的应用。
Description
技术领域
本发明涉及重组疫苗领域，具体地涉及一种用于制备弱毒疫苗的嵌合狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)，本发明还涉及所述病毒株的应用。
引言
狂犬病是一种很重要的人畜共患病，在世界范围内每年约有60,000余人死于狂犬病[1]，引起严重的公共健康问题。狂犬病病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，为不分节段单股负链RNA病毒，其基因组长约12kb，共编码5个结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。依赖RNA的RNA聚合酶L是狂犬病病毒中最大的结构蛋白，是一多功能酶，在病毒基因组复制、转录及转录后的加工，包括甲基化戴帽和多聚腺苷酸化等方面发挥作用。
1940年，Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病毒Flury株，经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传代后，再经鸡胚传代178代以上，无论神经内、外接种都对动物丧失致病力，但新生乳鼠和猴在脑内接种时仍具有残留毒力[2]。在鸡胚传代68代以前的称为“LEP”(鸡胚低代株)，高于136代的称为“HEP”(鸡胚高代株)。LEP脑内感染成年小鼠致死，而HEP脑内感染成年小鼠不致死。Flury-LEP株具有优良的免疫原性，被广泛用作人或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株。WHO对使用狂犬病病毒弱毒活疫苗的要求是小鼠脑内感染不致死，因此，有待对LEP株进行改造，以期获得安全有效的活疫苗推荐株。
为获得安全、高效的狂犬病弱毒活疫苗株，本研究利用反向遗传技术构建了将LEP的糖蛋白第333位精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺(Gln)，同时将L基因替换为HEP的L基因的嵌合病毒rLEP333Q-L(H)。我们鉴定了该嵌合病毒株的生物学特性，并将其与Flury-LEP、HEP进行了比较。结果表明重组病毒rLEP333Q-L(H)具有很好的安全性和免疫原性，适用于作为狂犬病病毒弱毒疫苗的开发。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供一株嵌合狂犬病病毒株，该嵌合病毒是在亲本弱毒疫苗株Flury-LEP基础上，将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因，并拯救获得的感染性病毒颗粒。
在第一个方面的一个实施方案中，其中构建的病毒株为rLEP333Q-L(H)。
在第一个方面的一个实施方案中，所述Flury-LEP的全长基因组cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
在第一个方面的一个实施方案中，其中所述HEP的L基因的序列如SEQ ID NO：8所显示。
在第二个方面中，本发明提供一种构建第一方面的病毒株的方法，所述方法包括下列步骤：
1)构建转录质粒，所述转录质粒包含将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的Flury-LEP全长基因组cDNA序列；
2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒包括编码狂犬病病毒Flury-LEP核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的开放阅读框架的cDNA序列；
3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染允许狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株复制的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
4)收获上清液，获救嵌合病毒株。
在第二个方面的一个实施方案中，其中所述转录质粒为pCI-LEP333Q-L(H)。
在第二个方面的一个实施方案中，其中所述转录辅助质粒分别为pCAGG-N、pCAGG-P或pCAGG-L。
在第二个方面的一个实施方案中，其中所述宿主细胞为真核细胞。
在第二个方面的一个实施方案中，其中所述真核细胞为BHK-21细胞。
在第三个方面中，本发明提供一种载体，其包含将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的Flury-LEP全长基因组cDNA序列。
在在第三个方面的一个实施方案中，所述Flury-LEP的全长基因组cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
在第三方面的一个实施方案中，其中所述HEP的L基因的序列如SEQID NO：8所显示。
在第四个方面中，本发明提供第一个方面的病毒株和第三个方面的载体用于制备弱毒疫苗的应用。
附图说明
图1是rLEP和rLEP333Q-L(h)的基因组图示。黑色方框代表LEP株各个基因的ORF，白色方框代表HEP株L基因的ORF。
图2左图：间接免疫荧光检测拯救病毒rLEP333Q-L(h)感染NA细胞，右图：阴性对照。
图3LEP、HEP和rLEP333Q-L(H)在NA细胞上的生长动力学曲线。
图4每组小鼠的体重变化情况，以接种病毒当天体重为100％，观察21天。
图5HEP、LEP或rLEP333Q-L(h)免疫小鼠后诱导的中和抗体水平以及攻毒结果。A：106FFU的HEP或rLEP333Q-L(h)，或104FFU的HEP、LEP或rLEP333Q-L(h)免疫小鼠3周后诱导的中和抗体水平。B：免疫后小鼠用街毒Guangxi09株进行攻毒试验结果，观察期为4周。
具体实施方式本发明通过具体的实施例来进一步举例说明，但下述实施例不应被理解为对本发明的限制。
实施例1嵌合病毒rLEP333Q-L(H)的构建及其生物学活性鉴定
1 材料与方法
1.1 质粒、细胞株和病毒
质粒pCAGG、pCI-RBz购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，pBluescriptSK(+)购自clonetech。BHK-21细胞(ATCC CCl-10)，293T细胞(CRL-11268)购自ATCC，培养基均为含10％胎牛血清的DMEM(购自GIBCO)。小鼠脑神经瘤细胞NA细胞来自军事医学科学院军事兽医研究所，培养基为含10％胎牛血清的MEM(购自GIBCO)。狂犬病病毒Flury-LEP和HEP购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心，在BHK-21细胞上扩增，-70℃冻存备用。
1.2 主要试剂和仪器
T4DNA连接酶，限制性内切酶Nhe I，Sph I，Mlu I，EcoR I，Kpn I等均购自大连TaKaRa公司。PhusionTM超保真DNA聚合酶，限制性内切酶Rsr II购自NEB公司。RNA提取试剂Trizol，SuperScriptTMIII反转录试剂盒，无血清培养基Opti-MEM，转染试剂LipofectamineTM 2000均购自Invitrogen公司。犊牛血清购自Gibco公司。LB培养基成分均购自OXOID公司。胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)及质粒小量提取试剂盒(Plasmid MiniKit)均购自OMEGA公司。质粒中量提取试剂盒QIAfilter Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室按本领域常规方法制备。FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司。普通显微镜，购自OLYMPUS公司；荧光显微镜，购自ZEISS公司。PCR仪购自AppliedBiosystem公司。核酸测序采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购LABCONCO自公司。二氧化碳培养箱购自Thermo Electron公司。不同型号离心机均购自BECKMAN公司。-70℃超低温冰箱购自NBS公司。普通冰箱冰柜购自海尔公司。全自动净水机MILI-Q购自BIOCEL公司。各种规格细胞培养瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。
1.3 引物
参照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因组序列(Gene Bank序列号AB085828)和Flury-LEP基因序列(Gene Bank序列号DQ099524，Flury-LEP全长基因组cDNA序列见SEQ ID NO：1)，将Flury-LEP基因组分为3段(即，F1，F2和F3)分别设计PCR引物。其中，片段F1为Flury-LEP基因序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，片段F2为Flury-LEP基因序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，片段F3为Flury-LEP基因序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。构建全长基因组cDNA所用引物、引入Pme I酶切位点引物、将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺的引物和将替换L基因的引物(表1)，以及构建辅助质粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技术有限公司合成。
表1 RT-PCR和全长基因组cDNA构建所用的引物
注：cDNA片断与图1相一致。下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜体表示；突变碱基用字符边框表示。
表2 辅助质粒构建所用的引物
注：下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，突变碱基用字符边框表示，Kozak序列用斜体表示。
1.4 构建Flury-LEP基因组全长cDNA克隆和嵌合病毒全长cDNA克隆
1.4.1 病毒基因组的提取、反转录和PCR
取Flury-LEP病毒液250μL，加入750μL Trizol，经常规方法提取基因组RNA。提取的RNA用SuperScriptTMIII反转录试剂盒进行反转录反应(反转录引物见表1)按该试剂盒说明书进行操作，获得末端部分重叠的3个病毒cDNA片段F1、F2和F3片段。
1.4.2 RT-PCR产物的克隆
整个基因组分为末端部分重叠的3个片断进行RT-PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收F1、F2和F3片段，分别克隆至pBluscript II KS(+/-)(Clontech)的EcoR v位点，转化感受态细胞DH5α，选择并提取阳性质粒pBlue-F1，pBlue-F2和pBlue-F3，测序确保克隆的基因组片段与病毒基因组RNA序列完全一致(具体方法见《分子克隆试验指南》，J.萨姆布鲁克编，2008年第三版，科学出版社译)。
1.4.3 Flury-LEP基因组全长cDNA克隆和cDNA片段克隆的构建
利用基因组cDNA片段F1、F2和F3相邻重叠部分存在的限制酶切位点进行连接组装。具体地，首先将F3段cDNA经Nhe I和Rsr II位点克隆进pCI-RBz，所得质粒命名为pCI-F3，再将F1段经Nhe I和Mlu I插入到pCI-F3，所得质粒命名为pCI-F31。最后将F2段经Sph I和Mlu I克隆进pCI-F31，至此Flury-LEP全基因组cDNA组装完成，构建成的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP。
pCI-LEP的基础上，构建在G和L基因之间带有Pme I酶切位点的全长cDNA克隆，具体方法是：以pCI-LEP为模板，利用F2-PF和Pme I-PR为引物，扩增出PCR片段PmeA，以F2-PR和Pme I-PF为引物扩增出PCR片段PmeB；然后再以PCR片段PmeA和PmeB为模板，以F2-PF和F2-PR为引物，扩增出含有Pme I酶切的F2片段，命名为F2-P。将F2-P经Sph I和Mlu I克隆进pCI-F31，从而构建成重组基因组转录载体pCI-LEP-Pme I。
1.4.4 G333突变全长基因组的构建
具体方法是：以构建好pCI-LEP-Pme I为模板，利用F2-PF和RtoQ-PR为引物，扩增出片段MuA；以RtoQ-PF和F2-PR为引物，扩增出片段MuB；然后再以PCR片段MuA和MuB为模板，以F2-PF和F2-PR为引物，扩增出糖蛋白第333位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q的F2片段，命名为F2-Mu。最后将F2-Mu片段经Sph I和Mlu I替换至进在1.4.3中已构建好的pCI-F31，至此Flury-LEP G333突变全基因组cDNA组装完成，构建成的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP333Q。
1.4.5 嵌合病毒全长cDNA克隆pCI-LEPG333Q-L(H)的构建
按照1.4.1中的方法提取Flury-HEP病毒基因组RNA，以5’CLF和3’CLR为引物进行RT-PCR扩增出含有HEP的L基因(SEQ ID NO：8)的PCR片段LHD。再以pCI-LEP333Q为模板，以5’CL+F和3’CL+R为引物，扩增出含有LEP的部分G基因、假基因和部分L基因的片段LHU。然后，以LHD和LHU这2个PCR产物为模板，以5’CL+F和3’CLR为引物扩增出含有HEP的L基因、其余皆为LEP基因序列的片段LH。将片段LH和pCI-LEP333Q分别用Pme I和Rsr II处理后连接，即将LH替换至pCI-LEP333Q的相应位置，至此，嵌合病毒全长cDNA克隆pCI-LEP333Q-L(H)构建成功(图1)。
1.5 构建转录辅助质粒系统
以pCI-LEP为模板，PCR扩增编码核蛋白(N)(SEQ ID NO：5)、磷酸蛋白(P)(SEQ ID NO：6)及聚合酶蛋白(L)基因(SEQ ID NO：7)的开放阅读框架(ORF)cDNA序列，分别克隆在pCAGG质粒的多克隆位点(MCS)。在起始密码子前引入Kozak序列(GCCACC)，以增强蛋白表达；在原有终止密码子后增加一个终止密码子，以有效终止辅助质粒mRNA的转录。构建成的辅助质粒分别命名为pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。
1.6 病毒拯救
在转染前一天，将293T细胞传到35mm 6孔板上，当细胞密度达到80％以上时即可进行转染。将pCI-LEP333Q-L(H)、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L分别以4μg、2μg、1μg、1μg的比例加入到250μl无血清培养基OPTI-MEM中，混匀；取15μl LipofectamineTM 2000溶于250μl OPTI-MEM中，混匀后在室温静置5min；然后将LipofectamineTM 2000与转染质粒(具体是pCI-LEP333Q-L(H)、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L各4μg、2μg、1μg、1μg)混合均匀，室温孵育30min。在此期间用OPTI-MEM洗涤293T细胞两次，然后每孔加入OPTI-MEM 1ml，最后将LipofectamineTM 2000-质粒混合液500μl加入细胞培养孔中，置于37℃CO2培养箱中培养8h后吸弃转染液，加入10％DMEM继续培养。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞。72h后，在BHK-21细胞上用间接免疫荧光(IFA)检测病毒滴度，简言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清为一抗，相同倍数稀释的小鼠阴性血清为对照，荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗，最后用荧光显微镜观察结果。收获上清液，获救突变病毒株，获救病毒株命名为rLEP333Q-L(H)株。
1.7 种毒的制备及滴定
将拯救的病毒在BHK-21细胞上进行扩增，10％DMEM 37℃培养3天。制备好的种毒分别在NA细胞和BHK-21细胞上培养48h后，以IFA(步骤同1.6)确定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成单位(focus forming unit)FFU表示。
1.8 病毒生长动力学曲线的测定
为测定病毒生长动力学曲线，将LEP、HEP和rLEP333Q-L(H)分别以M.O.I.为0.01分别感染单层NA细胞。感作1h后，用无菌PBS洗2次后，分别加含0.2％FBS的MEM 2ml，分别于接种后24h、72h和120h取细胞培养液上清，并在NA细胞测定滴度，绘制病毒生长动力学曲线。
1.9 对小鼠致病力的测定
将105 FFU/30μl的LEP、HEP和rLEP333Q-L(H)分别脑内接种或106FFU/100μl小鼠后腿肌肉注射，5～6周龄的Balb/c雌性小鼠。连续观察21天，记录每组小鼠的平均体重变化和死亡情况。
1.10 嵌合病毒rLEP333Q-L(H)对小鼠的免疫保护试验
为了评价嵌合病毒rLEP333Q-L(H)对小鼠的免疫效果，分别将106FFU/100μl的HEP和rLEP333Q-L(H)，或是104FFU/100μl LEP，HEP和rLEP333Q-L(H)后腿肌肉注射4周龄Balb/c雌性小鼠，每组10只。免疫后3周采血、分离血清，用于中和抗体滴度检测。对免疫后的小鼠进行攻毒试验，以街毒Guangxi09为攻击毒株，每只小鼠后腿肌肉注射50LD50/100μl的Guangxi09，每日观察小鼠，记录其死亡情况，持续观察4周。
1.11 中和试验
血清样品首先56℃水浴处理30min灭活，随后连续5倍至320倍倍比稀释，同时设阴性、标准血清对照。攻击病毒采用标准固定毒CVS株，将稀释好的血清与含100000个FFU的病毒等体积混合，37℃孵育1h，然后取100μl加到过夜生长的24孔BHK-21细胞上。每个样品作3个重复。感染后48h进行IFA检测。被检血清的中和抗体滴度为使荧光灶抑制等于50％的血清最高倍数。标准血清的起始稀释效价为2IU/ml，待测抗体单位(IU/ml)＝待测血清中和滴度/标准血清中和滴度×2。
2.结果
2.1 从全长cDNA克隆拯救嵌合病毒rLEP333Q-L(H)
为了从克隆的cDNA中拯救感染性RV，首先以pCI-LEP333Q-L(H)及表达RV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞。3天后收获细胞液，盲传一代后IFA检测呈阳性结果(图2)。对拯救病毒进行RT-PCR及基因组序列分析结果显示，获救病毒基因组cDNA的第4907的碱基为G，第4910的为T，第4912的为A；G蛋白第333位精氨酸R(CGG)已经突变为谷氨酰胺Q(CAA)；扩增的部分L基因片段与HEP的L基因一致，和预期完全相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，成功拯救出具有感染性的嵌合病毒rLEP333Q-L(H)。
2.2 嵌合病毒rLEP333Q-L(H)生物学特性的鉴定
2.2.1 动力学曲线
rLEP333Q-L(H)在神经元细胞NA上的生长动力学曲线如图所示(图3)，rLEP333Q-L(H)在NA细胞上的生长水平在各个时间点均低于LEP和HEP，到达的最高水平为2×106FFU/ml，分别较LEP和HEP低约30倍和20倍。
2.2.2 嗜神经指数
狂犬病病毒的体外嗜神经指数是指病毒在NA细胞相对于BHK-21细胞上的感染性比例[6]，嗜神经指数为1即表示病毒在神经元细胞上感染的能力比在非神经细胞上的高10倍。致病性毒株与弱毒株相比通常具有较高的嗜神经指数。致病性毒株的嗜神经指数一般大于1，而弱毒株的嗜神经指数通常接近于0[3，4，5]。LEP和HEP的嗜神经指数分别为0.8和0(表3)，嵌合病毒rLEP333Q-L(H)的嗜神经指数已下降与无毒株HEP一样为零。
表3 LEP、rLEP333Q-L(H)和HEP的体外嗜神经性
a同一种毒在NA细胞和BHK-21细胞上的滴度
b体外嗜神经指数＝log(NA上的滴度)-log(BHK-21上的滴度)
2.2.3 对小鼠的致病性
为了确定LEP、HEP以及rLEP333Q-L(H)对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒105FFU/30μl。感染LEP的小鼠表现出麻痹、兴奋，体重减轻等中枢神经系统疾病的临床症状，且所有的老鼠在11天内全部死亡。而HEP和rLEP333Q-L(H)感染的小鼠只表现出轻微的症状如毛微乱、感染初期体重略减，在21天的观察期内没有小鼠死亡(图4)。狂犬病病毒通过肌肉注射感染小鼠可以测定其由外周侵入到CNS的能力即神经侵入能力。LEP 106FFU/100μl后腿肌肉注射小鼠，所有的小鼠同样也在11天内全部死亡；而HEP和rLEP333Q-L(H)感染的小鼠则体重持续增长，没有出现死亡的情况。结果表明，嵌合病毒rLEP333Q-L(H)对成年小鼠不致病，与LEP相比，对小鼠致病性下降。
2.3 嵌合病毒rLEP333Q-L(H)对小鼠的免疫保护性
根据O.I.E标准测定不同毒株诱导小鼠中和抗体水平实验结果显示：106FFU/100μl的rLEP333Q-L(H)免疫小鼠诱导产生的中和抗体为3.6±0.89IU，显著高于HEP诱导的量(图5A)；104FFU/100μl的LEP肌肉注射小鼠是安全的，因此，用104FFU/100μl的LEP、HEP和rLEP333Q-L(H)分别免疫小鼠并进行比较，结果rLEP333Q-L(H)诱导产生的中和抗体为1.9±1.34IU，显著高于LEP和HEP诱导的量；攻毒试验的结果表明，104FFU的rLEP333Q-L(H)免疫可以完全保护小鼠抵抗50LD50的街毒的攻击量，而LEP和HEP免疫小鼠的保护率分别为60％和80％(图5B)。
以上的这些结果表明rLEP333Q-L(H)用于活毒疫苗使用时，与LEP相比，不仅安全性好，而且免疫原性更强，作为弱毒活疫苗开发具有很好的前景。
3 讨论
本研究通过反向遗传技术成功拯救嵌合狂犬病病毒rLEP333Q-L(H)株，该嵌合病毒是在亲本弱毒疫苗株Flury-LEP株反向遗传操作系统基础上，构建了将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的全长cDNA克隆并拯救获得感染性病毒颗粒。
对rLEP333Q-L(H)株的生物学特性分析发现，该病毒株在神经细胞NA细胞上的复制生长水平均低于LEP株和HEP株，可见聚合酶基因L的替换对病毒的生长有着十分重要的影响。rLEP333Q-L(H)的体外嗜神经指数和体内的神经侵入能力均已降至和HEP一样，更为重要的是rLEP333Q-L(H)株脑内感染成年小鼠时，对小鼠不致死，达到WHO对于弱毒活疫苗的使用标准。
对小鼠的免疫试验表明，和同样安全的HEP相比较，嵌合病毒rLEP333Q-L(H)株诱导更高的中和抗体水平，说明rLEP333Q-L(H)株保持了LEP株免疫原性好的特点；和LEP相比较，由于LEP高滴度肌肉注射小鼠致死，我们选择了对小鼠安全的剂量，104FFU剂量下LEP、HEP和rLEP333Q-L(H)诱导的中和抗体水平和保护率的比较，发现rLEP333Q-L(H)诱导的中和抗体水平不仅高于HEP，也同时高于LEP，这可能与rLEP333Q-L(H)诱导较强的凋亡水平相关。
通过以上的试验结果表明了，嵌合病毒rLEP333Q-L(H)不仅安全性好，而且可诱导较高的中和抗体水平，是作为用于开发作为狂犬病病毒弱毒活疫苗的候选毒株。
参考文献
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SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>嵌合狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)的构建
<130>IB100516
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>11925
<212>DNA
<213>狂犬病病毒株
<400>1
acgcttaaca acaaaaccaa agaagaagca gacagcgtca gttgcaaagc aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt gttcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120
gaagcccgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgctatca aagatttgaa 180
aaagccttgt ataaccctag ggaaagcccc cgatttaaac aaagcttaca aatcagtttt 240
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aatgcagttc tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcctgattgc 360
acgaaaagga gacaagatca ccccagactc tctagtggag ataaagcgta ctgatgtaga 420
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cactggtaac tataagacaa acattgcgga tagaatagag cagattttcg agacagcccc 600
ttttgttaag atcgtggaac accataccct gatgacaact cacaagatgt gtgctaattg 660
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gcggaaattg ctcaggaata acggtgtcct cgacctactg ctcaactaat catgattaca 3900
ccatttggat gcctgagaat ctgagactag ggacatcttg tgacattttt accaatagca 3960
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ataagtctct aaagggagca tgcaaactca agttatgtgg agttctcgga cttagactta 4080
tggatggaac atgggtcgcg atgcaaacat cagatgagac caaatggtgc cctccaggtc 4140
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tagtcaagaa aagagaggag tgtctggatg cactagagtc catcatgacc accaagtcag 4260
tgagtttcag acgtctcagt cacttgagaa aacttgtccc tgggtttgga aaagcatata 4320
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<210>2
<211>4063
<212>DNA
<213>狂犬病病毒株
<400>2
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<210>3
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<212>DNA
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<400>3
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aagaaagtag atttgggttc tctcaaagtg ggaggaactg ctgcacaatc aatgatttct 300
ctctggttgt atggagccca ctctgagtca aacaggagcc ggagatgtat aaccgacttg 360
gcccatttct attccaagtc atcccccata gagaagctgt tgaattgtac gttaggaaac 420
agaggcctga gaatcccacc agagggggtg ttaagttgcc ttgagagggt cgattatgat 480
aaggcatttg ggaggtatct ggccaacacg tattcctctt atctgttttt ccatgtaatt 540
accttataca tgaatgccct agactgggaa gaggaaaaaa ccatcctagc attatggaaa 600
gatctaacct cagtggatac cgggaaggac ttggtcaaat tcaaagatca aatatgggga 660
ctgctgattg tgacaaagga ctttgtttac tctcagagtt ctaactgtct ttttgacaga 720
aactatacac tgatgctaaa ggatcttttc ttgtctcgat tcaactcctt gatgattttg 780
ctttctcccc ctgagccccg atactcagat gacttaatat ctcagctgtg ccagctatac 840
atcgccgggg atcaagtctt gtccttgtgt gggaactccg gctatgaagt catcaaaata 900
ttggagccat atgtcgtgaa cagtttggtc cagagggcag agaagtttag gcctctcatc 960
cactccttgg gagactttcc tatgtttata aaagacaagg tgaatcaact tgaagggact 1020
ttcggtccca gtgcaaaaag gttttttagg gttctagatc aattcgacaa catacatgat 1080
ctagtatttg tgtatggctg ttacagacat tgggggcacc cctatataga ttatcggaag 1140
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cctgttccta gcgagaaggt cattatcacg gccctgtctc agccacctgt caatccccga 1560
gagtttttga aatctatcga cctcggagga ttgccagatg atgacttgat aattggcctc 1620
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gacgcactga ctatgacaga caacctgaac aaggtattta aaaagttgat cgacagggtc 1800
accgggcaag ggcttttgga ctattcgagg gtcacatacg catttcacct ggactatgag 1860
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agaaccaaga tactagctca aggagacaac caggttctgt gtccgacata catgttgtca 2220
ccgggattgt ctcaagaggg gcttctctat gagttagaga gcatatcgag gaatgcactc 2280
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tctcaatctc tgatcaaacc tatgagggat tttctgctca tgtcagtaca ggcagttttc 2580
cactacctgc tgtttagccc aatcttaaaa ggcagggttt ataagattct gagtgctgaa 2640
ggggagagct ttctcctagc catgtcgcgg ataatctatc tagatccttc tttgggaggg 2700
gtgtctggaa tgtctctcgg gaggttccat atacgtcagt tctcagaccc tgtctctgaa 2760
gggttgtcat tctggagaga gatctggtta agctcccacg aatcctggat tcacgcgttg 2820
tgtcaagagg ccgggaaccc cgatcttgga gagagaacac tagagagctt cactcgcctt 2880
ttagaagatc ctactacctt aaatatcaaa ggaggggcca gtcctaccat tctactcaag 2940
gatgctatca gaaaggctct gtacgacgag gtggacaagg tggaaaattc agagtttcga 3000
gaggcaatcc tgttgtccaa gacccataga gataacttta tactcttttt aaaatctgtt 3060
gagcctctgt tccctcgatt tctcagtgaa ctcttcagtt cgtccttctt gggaatacca 3120
gagtcaatta ttggactgat acaaaactcc aggacaataa gaaggcagtt tagaaagagt 3180
ctctcaagaa ctttagaaga gtccttctat aactcagaga tccacgggat taatcggatg 3240
acccagacac ctcaaagggt cgggagagtg tggccttgct cttcagagag ggcagatcta 3300
cttagggaga tctcttgggg aaggaaagtg gtgggcacga cagttcctca cccttccgag 3360
atgttggggc tgcttccaaa atcctctatt tcctgcactt gtggagcaac agggggaggc 3420
aatcctagag tttctgtatc agtactcccg tccttcgatc agtcattttt ttcacgaggt 3480
cccctaaagg gatacttggg ctcgtccacc tccatgtcaa cccagctatt ccatgcatgg 3540
gaaaaagtca ctaatgttca tgtggtgaaa agggctatat cgttaaaaga atctataaac 3600
tggttcatca atagaaattc caatttggct caaactctaa ttagaaacat catgtctctg 3660
acaggccctg atttctctct agaagaggct cctgttttca aacggacagg gtcagccttg 3720
cataggttca agtctgccag atacagcgaa ggagggtatt cttctgtttg tcctaacctt 3780
ctctctcata tctctgtcag tacagacact atgtctgatt tgacccaaga cgggaagaac 3840
tatgatttca tgtttcagcc attgatgctt tatgcgcaaa catggacatc agagctggta 3900
cagagagaca caagactgag agactccacg tttcactggc accttcgatg caacagatgt 3960
gtaaggccca ttgaggatat aacactggaa acttctcaga tcttcgagtt cccggatgtg 4020
tcaaaaagga tatccaggat ggtttctgga gccgtccctc actttcagaa gcttcctgat 4080
atccgtctaa gaccaggtga ttttgaatct ctaagtggta gagaaaagtc tcgccacata 4140
gggtcagctc aggggctctt atactcaatc ttagtagcaa ttcacgattc aggatacaat 4200
gatgggacca tcttccctgt caacatatac ggcaaagttt cccctagaga ctatttgaga 4260
gggctcgcaa gagggatctt gataggatcc tcgatttgct tcttgacacg aatgacaaat 4320
attaatatta aaagacctct tgaattgatc tcaggggtaa tttcctatat tctcctgagg 4380
ctggataatc atccctctct gtatataatg cttagagaac cgtctcttag aggagagata 4440
ttctctatcc ctcagaagat ccccgccgct tacccaacca ctatgaaaga aggcaacaga 4500
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ccggagaatg actggctgtg gatcttctca gacttcagaa gtgcgaaaat gacgtacttg 4620
accctcatta cctaccagtc tcacctccta ctccagaggg ttgagcgaaa cttgtctaag 4680
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aggacaaggt gggtagatca agaggtgcgc catgcagcta gaaccatgag tggagattac 4860
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ctatctaaga ggtttcaaaa ccccttgatc tcgggcctaa gagtggttca gtgggcaacc 5040
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cttgttgttg gagacgggtc agggggaata tcaagggcag ttctcaacat gtttccagat 5160
tctaagcttg tgttcaacag cctattggag gtgaatgatc tgatggcttc cggaacacgt 5220
ccactgcctc cttcagcaat catgagtgga ggagatgata tcatctccag agtgatagac 5280
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gatgctgagt acttgacctc ttccaccctt cgggagatga gccttgtgtt attcaattgt 5700
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ggatttcctg aagagatcat atcaaatcct tacaatgaaa tgatcataac tctgattgac 5820
agtgacgtag agtccttcct ggtccacaag atggtggatg atcttgagtt acagagggga 5880
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aacatttcca aacctttgac tgaccccttg ttctatcccc catctgatcc taaaatcctg 6000
aggcacttca acatatgttg cagtactatg atgtatctat ctaccgcttt aggcgacgtc 6060
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aagagggtag cctgtaattc tagcttgagt ctgtcatctc actggatcag gttgatttac 6240
aagatagtga agactaccag actcgttggc agcatagaag atctatcagg agaggtagaa 6300
cgacacctgc atgggtacaa cagatggatc accctcgagg atatccgatc tagatcatcc 6360
ctactagact acagttgttt gtaa 6384
Claims (9)
1.一株嵌合狂犬病病毒株，该嵌合病毒是在亲本弱毒疫苗株Flury-LEP基础上，将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因，并拯救获得的感染性病毒颗粒，其中构建的病毒株为rLEP333Q-L(H)。
2.权利要求1的病毒株，其中所述Flury-LEP的全长基因组cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1的病毒株，其中所述HEP的L基因的序列如SEQ IDNO：8所显示。
4.一种构建权利要求1-3中任一项的病毒株的方法，所述方法包括下列步骤：
1)构建转录质粒，所述转录质粒包含将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的Flury-LEP全长基因组cDNA序列；
2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒包括编码狂犬病病毒Flury-LEP核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的开放阅读框架的cDNA序列；
3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染允许狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株复制的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
4)收获上清液，拯救嵌合病毒株。
5.权利要求4的方法，其中所述转录质粒为pCI-LEP333Q-L(H)。
6.权利要求4的方法，其中所述转录辅助质粒分别为pCAGG-N、pCAGG-P或pCAGG-L。
7.权利要求4的方法，其中所述宿主细胞为BHK-21细胞。
8.一种载体，其包含将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的Flury-LEP全长基因组cDNA序列。
9.权利要求1-3中任一项的病毒株和权利要求8的载体用于制备弱毒疫苗的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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