CN103243105A - 一种旋毛虫重组蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组蛋白的制备方法，特别是一种TsSerpin重组蛋白，以及这种蛋白和它的用途。本发明的TsSerpin重组蛋白的制备方法是：以猪旋毛虫肌幼虫中提取总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₈Primer为引物进行反转录；再用上述所得到的反转录cDNA为模板，用SEQID№1和SEQID№2为引物进行PCR扩增，得到猪旋毛虫TsSerpin基因；再经构建重组质粒、转化大肠杆菌等处理得到目标蛋白。本发明的重组蛋白可用于制备检测旋毛虫病的抗原。

Description

一种旋毛虫重组蛋白及应用

技术领域

 本发明涉及分子生物学领域，主要是旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin重组蛋白用于免疫诊断及疫苗研制，具体设计包括旋毛虫基因TsSerpin的cDNA克隆及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的原核表达和反应原性的鉴定，并对TsSerpin进行分段克隆及原核表达和反应原性的鉴定表达，筛选反应原性比较好的片段用于免疫诊断。将重组蛋白用于小鼠免疫保护实验，确定其免疫保护性。

背景技术

旋毛虫病(Trichinellois)是由旋毛虫（Trichinella spp.）引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病，可在包括人类在内的150多种动物之间广泛传播，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫包囊的肉品而感染，严重时可致人死亡。旋毛虫病是一个非常重要的公共卫生问题，不仅给人类健康造成威胁，而且给畜牧业生产造成巨大经济损失。由于旋毛虫病病原传播途径复杂，宿主地理分布广泛，给该病的防制造成了极大的困难，至今仍然未得到有效的控制，而且流行范围继续扩大，已被列为再度肆虐的疾病。卫生部2001～2004年的全国人体重要寄生虫现状调查资料显示，在调查的旋毛虫病流行区的10个省（区、市）中，旋毛虫病血清阳性率为3.38%，但是西部地区的感染率要比东部地区高69.44%，该病已经成为影响我国食品安全和人民健康的重要因素之一。旋毛虫的抗原成份极其复杂，且不能进行体外的大量培养和繁殖，因此给该病的免疫诊断及预防带来了困难。随着分子生物学技术在寄生虫病研究中的应用，基因重组抗原成了当前研究的焦点。目前通过基因工程方法获得的旋毛虫抗原主要有46 kDa、49 kDa、53 kDa等，其重组抗原具有反应原性，可以被感染动物血清识别，但在旋毛虫感染早期诊断仍然不理想。解决诊断抗原的途径之一就是筛选鉴定旋毛虫不同发育时期的抗原表位进行融合表达以获得特异、敏感的诊断抗原。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前旋毛虫病免疫诊断技术中的不足，即旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ES）抗原大量制备相对较难，从旋毛虫肌幼虫中获得TsSerpin基因，对TsSerpin进行反应原性分析，并确定TsSerpin的抗原表位区域。同时对TsSerpin进行免疫诊断和保护性试验研究，为旋毛虫的诊断和预防奠定基础。

本发明提供了旋毛虫TsSerpin基因的原核表达、蛋白纯化以及反应原性鉴定的方法，其特征在于，包括：

（1）设计引物——设计的TsSerpin表达引物分别为：上游引物SEQ ID №1：（5’-GGC GAATTC ATGGAAACAGAAATTGCAA-3，斜体加黑部分为EcoR I酶切位点）；下游引物SEQ ID №2：5’-CC CTCGAG TTAATTACCAGAAAA ACGTCCA-3（斜体加黑部分为Xho I酶切位点）；

（2）RT-PCR反应——以旋毛虫肌幼虫RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR反应条件为反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。

（3）重组表达菌株的构建——将目的基因与pMD18-T载体连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，并进行鉴定阳性菌株。将阳性菌株送于测序公司测序，将测序正确的菌株提取质粒，经EcoR I和Xho I双酶切后，纯化酶切产物，将目的基因连接到pET30a表达载体上，转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单个菌斑，提取质粒，得到TsSerpin基因的阳性重组表达质粒pET30a-TsSerpin。

（4）重组表达质粒pET30a-TsSerpin 在大肠杆菌中的表达——取pET30a-TsSerpin/BL21(DE3)菌液加入到卡那霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基，37℃，200 rpm过夜培养。第二天转接至新鲜的含卡那霉素的LB培养基（1：50），继续培养至OD₆₀₀为0.6左右。在其它条件不变的前提下，分别在28℃、32℃、37℃和42℃等不同温度诱导表达；同样以0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L IPTG诱导表达；收集诱导后l h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及过夜表达菌液，最后通过SDS-PAGE鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件。

（5）重组蛋白的纯化——采用切胶后电洗脱法纯化重组蛋白。并用紫外分光光度计测定蛋白含量。

（6） Western-blot方法检测重组表达蛋白反应原性——将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜上，以旋毛虫感染猪血清（20000条肌幼虫经口感染160 d）和健康猪血清中作为一抗、碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG为二抗，进行Western-blot分析。

（7）按照以上方法将旋毛虫基因TsSerpin进行分段克隆表达，并进行反应原性的分析。

 (8) 将有反应原性的TsSerpin重组蛋白和分段表达的TsSerpin重组蛋白分别命名为TsSerpin1和TsSerpin5。对TsSerpin1和TsSerpin5分别进行免疫诊断的研究。

（9） 将110只健康昆明小鼠随机的分为四组，分别为TsSerPIN1免疫组（30只）、TsSerPIN5免疫组（30只）、佐剂组（25只）和感染对照组（25只）。TsSerPIN1免疫组用TsSerPIN1重组蛋白（200 μg/mL）加入等体积ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL；TsSerPIN5免疫组用TsSerPIN5重组蛋白（200 μg/mL）加入等体积的ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。佐剂组用PBS加入等体积的ISA206油佐剂乳化后每只小鼠腹腔注射0.2 mL。感染对照组用PBS代替免疫原直接进行腹腔注射，每只小鼠0.2 mL。各组均进行3次免疫注射，每周1次，第3次免疫后1周攻击感染，每只小鼠经口攻击感染旋毛虫肌幼虫200条。其中TsSerPIN1免疫组和TsSerPIN5免疫组各有10只小鼠作为免疫对照（即只进行免疫而不攻击感染旋毛虫）。

本发明人以旋毛虫为研究对象，从旋毛虫肌幼虫中克隆到旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin。

完成了该基因全长序列的克隆及序列分析，并对其进行原核表达及反应原性的鉴定，同时对TsSerpin进行了分段克隆及原核表达和反应原性鉴定，并对反应原性较好的重组蛋白进行免疫诊断与免疫保护性的研究，以筛选鉴定旋毛虫TsSerpin基因的抗原表位，获得特异性，敏感性好的诊断用抗原及疫苗研制候选抗原，为旋毛虫病的诊断和预防奠定基础。

本发明的优点在于克隆到了旋毛虫肌幼虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin，western-blot检测结果显示TsSerpin重组蛋白具有很好的反应原性，分段表达TsSerpin，western-blot检测结果显示TsSerpin5重组蛋白具有很好的反应原性，动物实验证明该重组蛋白具有一定的保护性。选择TsSerpin5重组蛋白做为旋毛虫病的诊断抗原和疫苗研制候选抗原，为旋毛虫基因重组抗原的研制奠定了基础。

附图说明

图1  TsSerpin基因RT-PCR扩增产物，其中：

M：DNA分子质量标准 (DL2000)；1：RT-PCR扩增产物；2：空白对照。

图2  重组质粒pET30a-TsSerpin的鉴定，其中：

M：DNA分子质量标准 (DL2000)；1：重组质粒的PCR产物；

2：pET30a空质粒；3：pET30a空质粒的双酶切结果；4：pET30a-TsSerpin重组质粒；5：pET30a-TsSerpin重组质粒的双酶切结果。

图3  重组表达质粒诱导表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果，其中：

M：蛋白质分子质量标准；1：未加诱导剂的菌体蛋白；2：IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4h的菌体蛋白；3：表达菌体裂解液的上清液；4：表达菌体裂解液2 mol/L尿素溶解沉淀；5：表达菌体裂解液2 mol/L尿素溶解沉淀；6：表达菌体裂解液8 mol/L尿素溶解沉淀。

图4  纯化蛋白质的SDS-PAGE电泳结果，其中：

M：蛋白质分子质量标准；1：诱导表达产物；2：纯化后的重组蛋白。

图5  重组蛋白的Western-blot 分析，其中：

M：蛋白质分子质量标准；1：旋毛虫感染猪血清；2：健康猪血清。

图6  TsSerpin基因片段PCR扩增产物的鉴定，其中：

M：DNA分子质量标准DL2000；1：TsSerpin1号PCR扩增产物；2：TsSerpin2号PCR扩增产物；3：TsSerpin 3号PCR扩增产物；4：TsSerpin4号PCR扩增产物；5：TsSerpin5号PCR扩增产物；6：空白对照。

图7  pET30a-TsSerpin5重组质粒的PCR和酶切鉴定，其中：

M：DNA分子质量标准；1：PCR产物；2：pET30a空质粒；3：pET30a空质粒的双酶切结果；4：pET30a-TsSerpin5重组质粒；5：pET30a-TsSerpin5重组质粒的EcoR I/Xho I双酶切结果。

图8  TsSerpin2、TsSerpin3和TsSerpin4表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中：

M：蛋白质分子质量标准；1：IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h的TsSerpin2菌体蛋白；2：未加诱导剂的TsSerpin2菌体蛋白；3：IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4h的TsSerpin3菌体蛋白；4：未加诱导剂的TsSerpin3菌体蛋白；5：IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4h的TsSerpin4菌体蛋白；6：未加诱导剂的TsSerpin4菌体蛋白。

图9  TsSerpin5表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中：

M：蛋白质分子质量标准；1：未加诱导剂的TsSerpin5菌体蛋白；2：IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h的TsSerpin5菌体蛋白。

图10  TsSerpin重组菌体蛋白的Western-blot鉴定，其中：

1,8：TsSerpin1重组蛋白；2,9：TsSerpin2重组蛋白；3,10：TsSerpin3重组蛋白；4,11：TsSerpin4重组蛋白；5,12：TsSerpin5重组蛋白；6,13：IPTG 诱导的BL21(DE3)菌液；7,14：IPTG 诱导的pET30a空载体菌液；1-7：旋毛虫感染猪血清；8-14：健康猪血清。

图11  ES抗原和TsSerpin5重组蛋白检测感染200条旋毛虫猪血清结果。

图12  ES抗原和TsSerpin5重组蛋白检测感染2000条旋毛虫猪血清结果。

图13  ES抗原和TsSerpin5重组蛋白检测感染20000条旋毛虫猪血清结果。

具体实施方式：

实施例1 旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin的克隆

1.      旋毛虫总RNA的提取

用Trizol（invitrogen）提取，操作如下：

（1）将感染旋毛虫35 d后的小鼠剖杀，取骨骼肌搅碎，人工消化法回收旋毛虫肌幼虫，取新鲜的虫体约100 mg，置于微型匀浆器中，同时加入1mL的Trizol，在冰浴中迅速超声至无可见组织块。

（2）转移液体至DEPC处理的微量离心管中，室温静置5 min；加0.2 mL酚-氯仿抽提液，剧烈震荡约15 s，室温孵育2~3 min。

（3）12 000×g，4 ℃离心15 min后，将上层液体转至另一干净离心管中，加入200 μL氯仿再抽提一次。

（4）将抽提后的上层液体转至干净离心管中，加入500 μL异丙醇，室温静置10 min，吸去上清液体，加入1 mL 75%乙醇洗涤、混匀样品。

（6）7 500×g，4 ℃离心5 min，彻底吸弃上清。

（7）真空干燥RNA沉淀5 min，用100 μL无核酸酶水溶解RNA，置56 ℃孵育10 min后，进行反转录。

2.反转录

按照Roche公司的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit，操作如下：（1）依次加入表1的试剂：

（2）置于65℃水浴锅中10 min，再冰浴5 min；

（3）再依次加入表2的试剂

加入超纯水至20 μL；

（4）置于55℃水浴锅中10 min；

（5）置于85℃水浴锅中5 min；

（6）置于冰上，最终合成cDNA；

3. 旋毛虫TsSerpin 基因的PCR扩增与纯化回收

以反转录cDNA为模板，用上游引物（5’-GGCGAATTCATGGAAACAGAAATTGCAA-3）和下游引物（5’-CCCTCGAGTTAATTACCAGAAAA ACGTCCA-3）进行PCR扩增。反应体系为：反转录产物10 μL，10×PCR buffer（Mg²⁺ free）5 μL，2.5 mM dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物(100μM)各0.3 μL，25mM MgCl₂ 3 μL，灭菌双蒸水加至50μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min后加入0.5 μL (5 U/μL) Taq DNA聚合酶，进行35个循环（94℃ 1 min，55℃ 1min，72 ℃ 1min），最后72℃延伸10 min。扩增完成后，取PCR产物5 μL用1.0% 琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL溴化乙锭，EB)电泳分析，结果显示扩增到一条大小约1.1 kb的基因片段（图1）；PCR产物经 PCR产物快速纯化试剂盒纯化。

4. 旋毛虫TsSerpin 基因与pMD-18T克隆载体的连接得到质粒pMD18- TsSerpin。

连接体系为：pMD18-T克隆载体1μL(50 ng/μL)，目的DNA4 μL，2×rapid ligase buffer 5 μL，T₄ DNA连接酶1μL(3 U/μL)，混匀后置4℃过夜连接；转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆子，碱裂解法小量提取质粒，经1.0% 琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及限制性内切酶酶切鉴定后，证实其大小与预期相符，将阳性克隆过夜培养，菌液送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。用分子生物学软件对序列进行分析，与GenBank数据库中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（DQ864973, EU263307, AF231948）的相似性为99%，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD18- TsSerpin。

实施例2 旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin在大肠杆菌中的表达

1.原核表达pET30a –TsSerpin重组质粒的构建  

pMD18-T-TsSerpin重组质粒经EcoR I和Xho I双酶切后，切胶回收目的基因片段。将回收的目的基因片段和pET30a载体质粒分别用EcoR I和Xho I双酶切，二者的酶切体系分别为：（1）目的基因片段20 μL，10× H buffer 4 μL，EcoR I 2 μL，Xho I 2 μL，BSA 2 μL，Triton 2 μL，灭菌双蒸水8 μL；（2）载体质粒12 μL，10× H buffer 4 μL，EcoR I 2 μL，Xho I 2 μL，BSA 2 μL，Triton 2 μL，灭菌双蒸水16 μL。将酶切混合物离心混匀后，置37℃水浴酶切4 h。

酶切产物用胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Extraction Kit回收纯化后，进行产物连接。连接体系为：酶切目的片段7 μL、酶切载体pET30a 1 μL，10×Ligation buffer 1 μL、T₄ DNA（3 U/μL）连接酶1 μL，混匀置16 ℃连接16 h，转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中（CaCl₂法制备），置37 ℃培养12～18 h后，挑取菌落增菌后用碱裂解法小量提取质粒，并经PCR扩增及限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定后，出现约1.1 kp的特异性条带，与预期的目的片段的大小相符（图2）。将酶切鉴定为阳性的重组菌株送上海英俊生物工程有限公司测序，结果与预期完全吻合，将鉴定为阳性的重组表达载体质粒命名为pET30a-TsSerpin。

2. TsSerpin重组蛋白的原核表达

取50 μL pET30a-TsSerpin品/BL21(DE3)菌液加入到5 mL含卡那霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基，37 ℃，200 rpm过夜培养。第二天转接至新鲜的含卡那霉素的LB培养基（1：50），继续培养至OD₆₀₀为0.6左右，在其它条件不变的前提下，分别在28 ℃、32 ℃、37 ℃和42 ℃等不同温度诱导表达；同样以0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L IPTG诱导表达；收集诱导后l h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及过夜表达菌液，最后通过SDS-PAGE鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件。收集优化条件下大量诱导表达的菌液，在4 ℃以4000×g离心15 min，弃上清，按照1 g菌体加5 mL的比例向菌体沉淀中加入TE溶液，充分混匀后反复冻融3次。冰浴超声破碎30 min，4℃，10 000×g离心15 min，收集上清保存。向沉淀内加入适量2 mol/L的尿素溶液，重新悬浮沉淀4 ℃静置5 min，同上离心收集上清；再重复一次，最后向沉淀中加入8 mol/L的尿素溶液完全溶解。分别将上清样品及尿素溶液溶解的沉淀样品进行SDS-PAGE分析，确定重组蛋白的表达形式。SDS-PAGE分析表明诱导后的重组菌有一条大小约为48.5 kDa的特异条带，此条带与理论推测TsSerpin重组蛋白分子量大小相符，表明此pET30a-TsSerpin重组质粒表达了目的基因的重组蛋白，见图3。

 

实施例3 重组蛋白TsSerpin的纯化以及反应原性的鉴定

1.重组蛋白的纯化

按实施例2方法共诱导菌液1 L，采用定性分析的方法获得以包涵体形式存在的重组蛋白，采用切胶后电洗脱法纯化包涵体蛋白，利用紫外分光光度计测定蛋白含量，校正公式如下：

蛋白含量(mg/mL)=(1.45×A₂₈₀－0.74×A₂₆₀)×稀释倍数

测定蛋白回收量为每1 L培养物上清可得到纯化蛋白约为6.58 mg。纯化后的TsSerpin重组蛋白经SDS－PAGE后只有在48.5 kDa处有1条明显的蛋白条带，没有其它细菌杂蛋白，见图4。

2.重组蛋白Western-blot鉴定

将纯化后的重组蛋白TsSerpin先进行SDS-PAGE电泳，然后在50 V电压下转移到硝酸纤维膜；3 h后将硝酸纤维膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭1 h，TBST洗3次(5 min/次)；将硝酸纤维膜分别浸于1：100稀释的旋毛虫感染猪血清（20000条肌幼虫经口感染160 d）和健康猪血清中，室温孵育1 h，TBST洗膜3次加入二抗(1：8000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后加入BCIP/NBT底物显色液显色。Western-blot分析表明，纯化后的TsSerpin重组蛋白在48.5 kDa处有能被感染旋毛虫猪血清特异性识别的蛋白带，但与健康猪血清无反应，见图5。

 

实施例4 旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin的分段克隆表达

1.旋毛虫TsSerpin 基因不同片段的PCR扩增与纯化回收

将TsSerpin基因分成不同的片段。设计引物如下：

SEQ ID №1(PF)：5’-GGCGAATTCATGGAAACAGAAATTGCAA-3’

SEQ ID №2(PR)：5’-CCCTCGAGTTAATTACCAGAAAA ACGTCCA-3’

SEQ ID №3(PF159)：5’-GGCGAATTCATCGCCGTCAACGCAA-3’

SEQ ID №4(PR165)：5’-CCCTCGAGATTGCGTTGACGGCGA-3’

SEQ ID №5(PF309)：5’-GGCGAATTCATTGTTCACAAAGCGTA-3’

SEQ ID №6(PR318)：5’-CCCTCGAGTTGAACTCTAGATACG-3’

引物由上海英骏生物技术有限公司合成。并进行标号如下： PF/PR为丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的全长，将其设定为1号，已经克隆表达；PF/PR165为2号；PF159/PR318为3号；PF309/PR为4号；PF159/PR为5号（备注：5号为3号和4号的联合片段）。反应体系为：pET30a-TsSerpin重组质粒1 μL，10×PCR buffer（Mg2+ free）5 μL，2.5 mM dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物(100 μM)各0.3 μL，25 mM MgCl2 3 μL，灭菌双蒸水加至50 μL。

PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min后加入0.5 μL (5 U/μL) Taq DNA聚合酶，进行35个循环（94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min），最后72 ℃延伸10 min。扩增完成后，取PCR产物5μL用1.0% 琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳分析，结果显示TsSerpin2获得约0.5 kb的特异性片断，TsSerpin3获得约0.5 kb的特异性片断，TsSerpin4获得约0.15 kb的特异性片断，TsSerpin5获得约0.7 kb的特异性片断，与理论值一致（图6）；PCR产物经E.N.Z.A. PCR产物快速纯化试剂盒纯化。

2. 原核表达重组质粒的构建

按照实施例2中1的方法构建不同片段的重组质粒。成功构建了pET30a-TsSerpin2，pET30a-TsSerpin3，pET30a-TsSerpin4，pET30a-TsSerpin5重组表达质粒构，经PCR和双酶切鉴定，与预期一致。其中pET30a-TsSerpin5重组表达质粒经PCR和双酶切鉴定，获得约0.7 kb的插入片段，与理论值一致，测序结果表明，插入片段为714 bp，编码225个氨基酸，而且开放阅读框正确，可以表达重组蛋白，见图7

3. 旋毛虫TsSerpin基因的分段表达

按照实施例2中2的方法将不同的重组质粒进行原核表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定不同基因片段的表达产物，可见TsSerpin2和TsSerpin3重组菌诱导后较诱导前出现一个大小约为24.5 kDa的明显条带；TsSerpin4重组菌诱导后较诱导前出现一个大小约为13.3 kDa的明显条带；TsSerpin5重组菌诱导后与对照相比有一约为31.8 kDa的条带，这些条带均与理论值相符，表明不同的重组质粒均成功表达了重组蛋白，见图8，图9。

 

实施例5 不同TsSerpin重组蛋白的纯化以及反应原性的鉴定

1. TsSerpin所有片段重组蛋白的纯化

按照实施例3中1的方法对不同TsSerpin重组蛋白进行纯化。纯化后的蛋白利用紫外分光光度计测定蛋白含量，校正公式如下：

蛋白含量(mg/mL)=(1.45×A₂₈₀－0.74×A₂₆₀)×稀释倍数

测定蛋白回收量为每1 L培养物上清均可得到纯化蛋白约为5.0 mg。纯化后的TsSerpin2和TsSerpin3重组蛋白经SDS－PAGE后在24.5 kDa处有1条明显的蛋白条带，没有其它细菌杂蛋白， TsSerpin4和TsSerpin5重组蛋白经SDS－PAGE后分别在13.3 kDa 和31.8 kDa处有1条明显的蛋白条带，没有其它细菌杂蛋白。

2. TsSerpin所有片段重组蛋白Western-blot鉴定

按照实施例3中1的方法将纯化后的重组蛋白TsSerpin1—TsSerpin5先进行SDS-PAGE电泳，然后在50 V电压下转移到硝酸纤维膜；3 h后将硝酸纤维膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭1 h，TBST洗3次(5 min/次)；将硝酸纤维膜分别浸于1：100稀释的旋毛虫感染猪血清（20000条肌幼虫经口感染160 d）和健康猪血清中，室温孵育1 h，TBST洗膜3次加入二抗(1：8000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗猪IgG)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后加入BCIP/NBT底物显色液显色。结果显示只有在TsSerpin1和TsSerpin5重组菌体蛋白处有蛋白条带能被感染旋毛虫的猪血清特异性识别，其它的重组菌体蛋白不能被感染旋毛虫的猪血清特异性识别，同时与健康猪血清无反应，见图10。

 

实施例6 筛选抗原

TsSerPin1和TsSerPin5反应原性比较

以纯化后的TsSerpin1和TsSerpin5重组蛋白为抗原，对20份旋毛虫感染猪血清样品和10份健康猪血清样品进行间接ELISA检测。具体操作如下：

（1）包被抗原  用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的TsSerpin1和TsSerpin5重组蛋白至终浓度1 μg/mL，每孔200 μL包被酶标板，37℃湿盒静置2 h后，再放入4℃静置过夜；

（2）洗板  用全自动高速酶标洗板机清洗，以pH 7.4的PBS-T洗4次(停10 s/次)，滤纸上拍尽孔内残液；

（3）加一抗  加入以1：200稀释的待测猪血清，200 μL/孔，37℃温育1 h；

（4）洗板  用全自动高速酶标洗板机清洗，以pH 7.4的PBS-T洗4次(停10s/次)，滤纸上拍尽孔内残液；

（5）加二抗  加入1：16 000稀释的HRP-兔抗猪IgG，200 μL/孔，37℃温育1 h；

（6）洗板  用全自动高速酶标洗板机清洗，以pH 7.4的PBS-T洗4次(停10s/次)，滤纸上拍尽孔内残液；

（7）显色  现配底物显色液（OPD），200 μL/孔，37℃温育30 min；

（8）终止反应  加2 mol/L H₂SO₄ 50 μL/孔终止反应，变为橙黄色；

（9）结果判定  酶标仪A490值处，空白对照孔调零后，测各孔OD值。

间接ELISA检测结果显示，TsSerpin1重组蛋白检测健康猪的OD₄₉₀值均在0.25~0.35，而感染旋毛虫的猪血清的OD₄₉₀值在1.05~1.86之间，全部显阳性反应。而TsSerpin5号重组蛋白检测健康猪的OD₄₉₀值均在0.15~0.35，而感染旋毛虫的猪血清的OD₄₉₀值在1.20~1.80之间，全部显阳性反应。两种重组蛋白的反应原性相似，说明TsSerpin5具有此蛋白的主要抗原表位。

 

实施例7 TsSerpin5重组蛋白免疫诊断

1.ES抗原和TsSerpin5重组蛋白反应原性的比较

分别用200条/头，2000条/头，20000条/头感染猪后每周采血，感染147 d后将猪剖杀。用ES抗原和TsSerpin5重组蛋白分别进行对猪血清进行间接检测ELISA检测，结果见图11，12，13。感染200条旋毛虫猪血清在35~42 d后血清转为阳性；感染2000条旋毛虫猪血清在28~35 d后血清转为阳性；感染20000条旋毛虫猪血清在21~28 d后血清转为阳性。TsSerpin5重组蛋白检测OD₄₉₀值要低于ES抗原，但是血清转阳时间基本一致。

2.猪田间血清样品的间接ELISA检测

将ES抗原检测阳性血清55份，阴性血清20份用TsSerpin5重组蛋白进行间接ELISA检测。ES检测健康猪的OD₄₉₀值均在0.131~0.336之间，而感染旋毛虫的猪血清的OD₄₉₀值在1.099~3.230之间，纯化的TsSerpin5重组蛋白检测健康猪的OD₄₉₀值均在0.232~0.487之间，而感染旋毛虫的猪血清的OD₄₉₀值在1.055~2.923之间。

 

实施例8 TsSerPin1和TsSerPin5重组蛋白的免疫保护性

将110只健康昆明小鼠随机的分为四组，分别为TsSerPIN1免疫组（30只）、TsSerPIN5免疫组（30只）、佐剂组（25只）和感染对照组（25只）。TsSerPIN1免疫组用TsSerPIN1重组蛋白（200 μg/mL）加入等体积ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL；TsSerPIN5免疫组用TsSerPIN5重组蛋白（200 μg/mL）加入等体积的ISA206油佐剂乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。佐剂组用PBS加入等体积的ISA206油佐剂乳化后每只小鼠腹腔注射0.2 mL。感染对照组用PBS代替免疫原直接进行腹腔注射，每只小鼠0.2 mL。各组均进行3次免疫注射，每周1次，第3次免疫后1周攻击感染，每只小鼠经口攻击感染旋毛虫肌幼虫200条。其中TsSerPIN1免疫组和TsSerPIN5免疫组各有10只小鼠作为免疫对照（即只进行免疫而不攻击感染旋毛虫）。

旋毛虫攻击感染后1周，每组剖杀10只小鼠，取出小肠剖开，无菌生理盐水洗后剪成小段，放入含500 U/mL青霉素/链霉素生理盐水的培养皿中，37℃孵育3 h左右，取出小肠，收集旋毛虫7日龄成虫(Ad)，洗涤干净后在解剖显微镜下镜检计数，计算成虫的减虫率。分别从每只小鼠挑取10条雌虫，混匀后放入细胞培养板中，每孔加入0.8 mL RPMI1640培养液（含青霉素和链霉素各500 U/mL），37℃培养24 h，收集新生幼虫显微镜下镜检计数，计算雌虫体外培养产新生幼虫的减虫率。攻击感染后35 d，将其余小鼠全部断颈处死，取全身骨骼肌绞碎，用人工消化液（1%浓盐酸，1%胃蛋白酶）42℃消化肌肉样品，消化完成后收集旋毛虫肌幼虫（ML），洗涤干净后显微镜镜检计数，计算肌幼虫减虫率。攻击感染35 d后TsSerPIN1重组蛋白免疫组和TsSerPIN5重组蛋白免疫组小鼠每克肌肉含虫数（LPG）与感染对照组和佐剂组相比均差异极显著（P＜0.05），成虫减虫率分别为40.7％和54.5％。

旋毛虫攻击感染后1周，每组剖杀10只小鼠，取出小肠剖开，无菌生理盐水洗后剪成小段，放入含500 U/mL青霉素/链霉素生理盐水的培养皿中，37℃孵育3 h左右，取出小肠，收集旋毛虫7日龄成虫(Ad)，洗涤干净后在解剖显微镜下镜检计数，计算成虫的减虫率。分别从每只小鼠挑取10条雌虫，混匀后放入细胞培养板中，每孔加入0.8 mL RPMI1640培养液（含青霉素和链霉素各500 U/mL），37℃培养24 h，收集新生幼虫显微镜下镜检计数，计算雌虫体外培养产新生幼虫的减虫率。攻击感染后35 d，将其余小鼠全部断颈处死，取全身骨骼肌绞碎，用人工消化液（1%浓盐酸，1%胃蛋白酶）42℃消化肌肉样品，消化完成后收集旋毛虫肌幼虫（ML），洗涤干净后显微镜镜检计数，计算肌幼虫减虫率。

免疫小鼠成虫减虫率、雌虫体外培养产新生幼虫的减虫率以及肌幼虫减虫率见表3、表4和表5。

。

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  一种旋毛虫重组蛋白及应用

<160>  序列表中序列的个数 （如18） （注：CN1至CN8的基因序列与其氨基酸序列）

 

 

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列(上游引物PF)

<400> 

ggcgaattca tggaaacaga aattgcaa                                         28

 

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列(下游引物PR)

<400>

ccctcgagtt aattaccaga aaaacgtcca                                       30

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列(PF159)

<400>

ggcgaattca tcgccgtcaa cgcaa                                            25

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列(PR1659)

<400>

ccctcgagat tgcgttgacg gcga                                             24

 

<210>  5

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列(PF309)

<400>

ggcgaattca ttgttcacaa agcgta                                           26

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列(PF318)

<400>

ccctcgagtt gaactctaga tacg                                             24

Claims (3)

1.TsSerpin重组蛋白的制备方法，其特征是：

1）从猪旋毛虫肌幼虫中提取总RNA；

2）以Oligo(dT)₁₈ Primer为引物，总RNA为模板进行反转录；

3）用上述2）所得到的反转录cDNA为模板，用SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物进行PCR扩增，得到猪旋毛虫TsSerpin基因；

4）将所得到的旋毛虫TsSerpin基因与pMD18-T克隆载体连接，构建pMD18-TsSerpin重组质粒；

5）测序正确的重组质粒经过EcoR I 和Xho I进行双酶切，酶切产物进行纯化后与载体pET30a连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建原核表达重组质粒pET30a-TsSerpin；

6）将旋毛虫pET30a-TsSerpin重组质粒进行诱导表达；

7）对经诱导表达的旋毛虫TsSerpin重组蛋白进行纯化处理。

2.权利要求1所述方法制备的TsSerpin重组蛋白。

3.权利要求2的TsSerpin重组蛋白用于制备检测旋毛虫病的抗原。

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