JPH05509225A - Ｃ型ロタウイルス培養体およびその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型ロタウィルス培養体およびその利用法関連する出願 Ｍａｒｋ　Ｗ、　Ｗｅｌｔｅｒ、Ｄａｖｉｄ　Ｍ、　Ｃｈａｍｂｅｒｓ　Ｃ，な らびにＪｏｓｅｐｈ　ＷｅｌｔｅｒはＢ型ロタウィルスの培養体およびその利用 法という名称に係る発明につき１９８９年１１月１３日付出願番号第０７／４３ ４．２０９号にて共同出願している。

発明の分野 本発明は濃度を薄めたタンパク質分解酵素により二倍体の細胞培養体にＣ型ロタ ウィルスを増殖し、診断用キットに側層する抗原および抗血清を産生じ、そして Ｃ型ロタウィルス感染予防用の修飾生菌ワクチンならびにホルマリン殺の死菌ワ クチンを産生ずることに関する。

発明の背景 ロタウィルスは乳幼児や子ブタのウィルス性胃腸炎の主原因となっている（２． ３．４．７．８．９．１７．２０．２７．３７．）。きわめて多くの動物種に発 見されているロタウィルスは、電子顕微鏡で見たときのその特徴的な車輪状外観 から命名されたものである。ロタウィルスのゲノムは、１１個の二重鎖ＲＮＡセ グメントにゲノムが分裂しているためレオウィルスやオルビウイルスからは区別 されるが、その他のＦｌｅｏｖｉｒｉｄａｅと同様、二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ形を している。

１９８３年にＰｅｄｌｅｙ（２４）は１次元ターミナルフィンガープリント分析 で特徴付けることにより血清学的差異、蛍光抗体、および核酸上の差異に基づき ロタウィルスを数個のグループに分類した。ＲＮＡエレクトロフェロタイプもこ の分類の基礎として用いられた（２９〕。グループへのロタウィルスは「典型的 」と考えられ、それ以外のものは全て（Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ）　ｒ非典型的」とされ た。このうちパラロタウィルスと呼ばれることもあるＣ型（グループＣ）ロタウ ィルスは、ニワトリ、ブタおよびヒトに胃腸炎を起こすことが分かった（１．４ ．５．７．１０．１１．１２．１３、１４．２０．２１．２２．２５．２６．３ ３．３４）。１６個の単クローン性抗体のパネル［ｐａｎｅｌ］かブタＣ型ロタ ウィルスに作られ（Ｃｏｗｄｅｎ株）、そのうち４つは中和力を持つものであっ た。Ｃ型の抗原だけがこの単クローン性抗体によって検出され、Ａ型またはＢ型 のロタウィルスには何の反応も見られなかった（２３）。

ウェスタンプロット法によるブタＣ型ロタウィルスの構造ポリペプチドの分析は 、ブタロタウィルスＡ型の構造ポリペプチドとの間に交差反応の欠如があること を明らかにしたが、これは両者が互いに明確に異なり、したがって異なる血清グ ループの分類に属するという事実を支持するものである（６．１８．２３）。

Ｃ型ロタウィルスは、授乳ブタや弱ったブタにおける下痢の原因に関係している とされている（４．８．１５．　’１７．２１）。数年に亙って行われた診断調 査によれば、ロタウィルスが作因と考えられる場合、Ｃ型ロタウィルス感染が離 乳前の試験体の２５％を占め、離乳後の試験体の４０％を占めていることが分か った（１７）。オーストラリアではロタウィルス性下痢症の２３５原因中７つが Ｃ型ロタウィルスに関係していることがゲル電気泳動で分かっている（２１）。

Ｃ型ロタウィルスの流行にはＣ型特異的血清抗体によって測定されたもう一つの 証拠がある。オハイオ州で血清抗体レベルで測定したとき、成熟ブタの１００％ 、離乳ブタの５９％、授乳ブタの８６％がＣ型ロタウィルスに暴Ｈ［ｅｘｐｏｓ ｕｒｅ］されていることを示した（特異的間接蛍光抗体；ＩＦＡ、３１）。英国 ではＩＦＡで測定したとき、３〜２６週齢の子ブタの５８〜９０％がプラスのＣ 型抗体力価を持っていたが、ＩＦＡ測定で成熟ブタの７７％はＣ型に従前から暴 露されていることを示した（９．１１）。

ブタＣ型ロタウィルスは、免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）およびＩＦＡ血清学分析に よりヒトＣ型ロタウィルスの少なくとも８つの異なる単離体［１ｓｏｌａｔｅｓ ］と交差反応することが分かったが、これはある一つの共通するグループ抗原が ブタＣ型ロタウィルスの株とヒトＣ型ロタウィルスの株とに存在することを示唆 するものと思われる（７．１０．１２．２０．２５．２６．２７．３３．３４） 。

Ａ型ロタウィルスについてはいくっがの異なる細胞系で増殖が成功しているが、 タンパク質分解酵素、ＤＥＡＥデキストラン、あるいはこれら両者の組合せのい ずれかと共に使うことを必要としている。増加したウィルスの接種量を使うこと もまたＡ型ヒトロタウィルス株のあるものを成長させるのに貢献した（４２）。

Ａ型ロタウィルスの診断キット、および子ウシやブタのＡ型ロタウィルスの修飾 生ウイルスワクチンが市販されている（３８．３９．４０．１５１６．３５．３ ６）。しかしヒトのワクチンは開発されてはいるが商業化されていない。

ブタＣ型ロタウィルスの僅かながらの複製（ｃｍｗｄｅｎ株）は、二種類の細胞 培養体、すなわち初生のブタ腎臓（以下、ＰＫ）と胎児アカゲザル腎臓Ｃ以下、 Ｍａ−１０４）で成功している（２８．３０）。高（細胞障害）レベル、例えば ８０〜１２０μｇ／ｍｌという高レベルのタンパク質分解酵素（パンクレアチン 、３０）を取り入れることによって、腸由来のＣ型ロタウィルスをＰＫ細胞中に １７代維持することができた。パンクレアチンは、プロテアー七（例えばトリプ シン、キモトリプシン、αトリプシン、等）、リパーゼ、およびアミラーゼなど からなるいくつかの酵素の混合物である。Ｃ型ロタウィルスのＰＫでの第９代を Ｍａ−１０４での次継代［ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ］の接種物［ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｌとして使った。すると再び高レベルのパンクレアチンがウィルスを維持するた めめられた。

しかしこのようなパンクレアチンの高レベルでは、細胞培養体に及ぼすタンパク 質分解酵素の細胞毒性効果（例えば細胞の分離）があるので、ウィルスの細胞変 性効果（ＣＰ　Ｅ）を観察することは容易でなかった。（４０μｇ／ｎｌだけし かパンクレアチンを使わなかったときは、ウィルスの成長は３代後に止まってい る）。ＰＫ継代したＣ型ロタウィルスを次にＭａ−１０４で１８代継代すると、 第１６代で５　ｘ　１０６ＦＦＵ／ｍ１（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｆｏｃｉ　 Ｕｐｉｔｓ、　Ｒ光焦点ユニット）のピーク力価をもたらした。

これまで細胞培養継代のどれも５　Ｘ　１０　’ＦＦＵ／ｍｌより高いウィルス 力価を有していることが報告されたことはない。さらに、第２２代および第２６ 代の細胞培養継代休をノドパイオートのブタに食餌したか、なお病原性であるこ とか分かった。動物たちは下痢を発展させ急速に衰弱していった。感染したブタ の腸内物から直接にブタＣ型ロタウィルスをＭａ−１０４細胞培養で増殖するこ とは成功しなかった（２８）。報告されたＣ型ロタウィルス技術とか、Ａ型ロタ ウィルスの成長に使われているこれまで報告されている技術を使ってＣ型ロタウ ィルスを細胞培養で増殖し７ようとする試みはどれも失敗に終わった（２８．３ ０．３１．３３）。ウィルスの成長のため初代の組織培養体（Ｐ　Ｋ）を用いる ということは、初代組織培養体が簡単に検出され得ないウィルスで汚染されやす いという欠点、そＩ７て初代組織を実際に使用する前にそフした蓄熱性を徹底的 に確立（−得ないきいう点において不利である。このように初代Ｍｉ＆ｉにより ワクチンを生成することは、そのｌツクチン成分の調製後長時間経過して初め・ て検出されるような外来ウィルスに汚染される危険にさらされている。

ブタの流行病学から（８，９，，１，７，３１）、効果的なワクチンは不活性イ Ｌされ、あるいは薄められる必要があることが明らかとなっている。Ｃ型ロタウ ィルス感染予防のための診断補助の開発の必要性もある。したがって好ましくは 免疫原性を著しく喪失させずに高いウィルス力価で何代も継代してＣ型ロタウィ ルスの病毒力を減衰して、Ｃ型ロタウィルスを培養する方法がめられている。

ここに記載の参考文献は全てここに言及したことで必要な限りにおいて明細書に 組み込むものとする。しかしこれら参考文献はいずれも従来技術としての位置付 けをされるものではない。

発明の概要 本発明は、上記した従来技術の欠点を克服することを目的とする。

また、病毒力のあるＣ型ロタウィルスを培養体中に成長させるため取り入れるこ とも本発明のもう一つの目的である。

本発明の目的である。

Ｃ型ロタウィルスの診断キットに使う抗血清を生成することも本発明の目的であ る。

さらにまた、Ｃ型ロタウィルス感染予防のため修飾した性菌ワクチンを産生ずる ことも本発明の目的である。

さらにまた、Ｃ型ロタウィルス感染防止のためホルマリンで殺した死菌ワクチン を産生ずることも本発明の目的である。

そ（７てさらに、診断テスト用またはワクチン用の多量のウィルス抗原を産生ず るため、低減（非細胞変性的）量のタンパク質分解酵素の存在下’Ｃブタ翠丸［ ５ｗ１ｎｅ　ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ］　（以下、ＳＴ（！：いう）細胞中にＣ型 ロタウィルスを連続的に増殖することも本発明の目的である。

その結果もたらされた修飾生ウィルスを、もとの宿主種牛に逆継代［ｂａｃｋｐ ａｓｓａｇｅ］　したときでも非病原性であるが、それにもかかわらずＳＴ細胞 中では少なくとも追加的な５５継代だけ免疫原性である。

本発明によれば、感染ブタの腸内物由来病原性ブタＣ型ロタウィルスは、樹立し たブタ二倍体細胞系、つまりＳＴ細胞中で成長させられる。この方法は高い力価 のＣ型ロタウィルスの成長および細胞培養での維持を可能にする。

Ｃ型ロタウィルスの成長は、ＳＴ細胞がＡ型ロタウィルスに感染したときに見せ る細胞変性効果に類似の細胞変性効果をＳＴ細胞に表出する。この細胞変性効果 は細胞破壊片［ｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｂｒｉｓ］の細い糸によって単分子層に感 染細胞のあるものか所々くっついた細胞とその後の細胞溶解で特徴つけられるも のである。こうした現象は細胞フラッギング［ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｌａｇｇｉ ｎｇ］と呼ばれる。

ＳＴ細胞のＣ型ロタウィルス感染は、感染した培養体を特殊な間接免疫蛍光染色 法［１ｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　（Ｉ　Ｆ　Ａ） ５ｔａｉｎｉｎｇ］で調べるか、または回収液をＲＮＡ抽出およびポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）評価することによって確認された。

初生のブタ腎臓およびＭａ−１０４（胎児アカゲザル腎臓）の細胞におけるＣ型 ロタウィルスの成長は以前にも報告されているが（２８，３０）、これら参考文 献中に記載の成長は高レベルのタンパク譬分解酵素を必要とするもので、ウィル ス収量は比較的低く、ウィルスの細胞変性効果はバンクレアチン自体のＣＰＥに よって不明瞭にされてしまう。

本発明はＣ型ロタウィルスを非毒量（１０〜２０μｇ／ｒｎｌ）　トリプシン単 独の存在下で≦Ｔ細胞に取り込むもので、ＳＴ細胞に対する細胞変性効果により ウィルスの生成量を好都合に測量することができるもので、またウィルス生成量 を有為に増加するものである。本発明は診断薬あるいはワクチンとして使用する ことができるウィルス抗原を大量に産生ずるため、比較的少量の（好ましくは８ ０μｇ／ｍ１以下１．より好ましくは２０μｇ／ｍｌ）タンパク質分解酵素の存 在下でＳＴ細胞中にＣ型ロタウィルスを連続的に増殖する方法に関する。

ヒトＣ型ロタウィルスに対する快復期血清［ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ　ｓｅｒ ｕｍ］およびブタＣ型ロタウィルスに対する快復期血清は互いに交差反応するこ とが発見されているが、これはこれらＣ型ロタウィルスの２株間に関係があるこ とを示唆している。また、ブタＣ型ロタウィルスに対する高度免疫血清もヒトＣ 型ロタウィルスの幾つかの株と交差反応することが報告されている（６）。

このような現象があるため、本発明の細胞培養で採取したブタＣ型ロタウィルス は抗血清生成の検出ウィルスとして、また診断用キットに使う抗原ソースとして 役立てることができる。さらに、ここに記載の細胞培養から採ったブタＣ型ロタ ウィルスはまた、その他の非ブタ種によるＣ型ロタウィルス感染に対するワクチ ンとしても有効である。

ＳＴ細胞へ繰り返し継代することにより、Ｃ型ロタウィルスはその病毒力を喪失 するが、宿主動物でテストした結果では抗原性（修飾生ウィルス）を維持する。

以下の例は、Ｃ型ロタウィルス修飾の生ロタウィルス（ＭＬＶ）が予想されるよ うな病毒力なしにウィルス接種された動物中に複製されることを明らかに示して おり、後で有毒なブタＣ型ロタウィルスでチャレンジしでも保護される（能動免 疫）。

また、ＳＴ細胞中での継代により生成されたＭＬＶのＣ型ロタウィルスとホルマ リンで殺したＣ型ロタウィルスは共にＣ型ロタウィルスに対し有効に妊娠ブタを 免疫させるために使われたが、これてＣ型ロタウィルスに感染しかちな出生動物 の乳児ブタに供給される初乳抗体および乳抗体を増加することができる。こうし て得られた免疫は受動免疫と呼ばれ、乳抗体力価が十分高く、またその動物が乳 を飲み続ける限り乳児動物を感染から守るのである。

細胞培養体におけるブタＣ型ロタウィルスの増殖を具体的に例証したが、この方 法はヒト、子ウシその他の種のＣ型ロタウィルスにも採用することができること か理解されなければならない。

このように本発明は、ヒトおよび動物をＣ型ロタウィルス由来の病気から守るた めに使うことができる修飾生菌ワクチンまたは死菌ワクチンのいずれをも産生ず るＣ型ロタウィルスの連続的増殖法を提供することを目的とする。

図面の簡単な説明 図１はＲＮＡ抽出およびＰＡＧＥ分析（３２）により単離したブタＣ型ロタウィ ルスのウィルスゲノム（フィンガープリント）である。有毒（腸由来の母体）単 離体さ、細胞培養採取（第５０代）の単離体の双方とも同様のフィンガープリン トを示す。

細胞培養継代はＳＴ細胞を使った。

図２はＳＴ細胞内におけるブタＣ型ロタウィルスの第５０代の免疫電子顕微鏡写 真で、細胞培養継代を経ても抗原性を維持しているものを示す。

発明の詳細な説明 本発明の上記目的および効果は以下に述へる実施例によって実現される。

無限増殖性［ｃｏｏｔｉｎｕｏｕｓ］細胞系（Ｍａ−１０４）は通常、サブ四倍 体の抜型のある異数体で、構造上例外的性質を示す染色体を有している。無限増 殖性細胞系は理論上無限の生命をもつか、「形質転換」するので、つまりその染 色体成分は逸脱し内部に腫瘍遺伝子特性または発癌性特性の可能性を秘めている のでウィルス増殖のためには好ましくない。

ＳＴ細胞は、汚染物（細菌ウィルス、マイコプラズマウィルス、外来ウィルス） のない純性および染色体安定性（染色体的に例外がないこま）が政府のガイドラ インで決定されているブタ二倍体の細胞系である。これら細胞はワクチン生成の ためＵ。

Ｓ、　Ｄ、　Ａ、により登録されている。

ＳＴ二倍体細胞系は広範囲のブタウィルスに極めて感染性が高いことが分かって いる。たとえばパルボウイルス、転移性胃腸炎、アデノウィルス、およびＡ型、 Ｂ型そしてＣ型ロタウィルスなどである。ＰＫまたはＭａ−１０４の培養体にＳ Ｔ細胞を使うことの上に列挙した利点に加えて、きわめて著しい利点は既に報告 されている通り、ここに記載の過程を経たＳＴ中の僅か２５代後、Ｃ型ロタウィ ルスはブタに対する病原性を失うか抗原を残していることである。

これまでＣ型ロタウィルスはうまく生成されてこなかったし、二倍体細胞中すな わちＳＴ細胞中で継代されたことはなかった。

細胞培養生成されたＣ型ロタウィルスは病原性がないためヒト株より著しく大き な利益をもたらす。感染した細胞培養体を間接免疫蛍光染色法で調べた結果、明 らかにこれら２株間に抗原関係［ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ ｐ］かあることが確立された。

ＳＴ二倍体細胞系の利点の少なくともいくつかはほかの二倍体細胞系にも拡大さ れるもので、その他の二倍体細胞系の使用限度はそれらがＣ型ロタウィルスの成 長を支持できる限りまでと考えてよい。もし無限増殖性の（安定な）細胞系がこ のような成長を支持することができるなら、前に注意したことはあるものの、こ れもまた使用可能とすることができるであろう。

本発明の実施に当たっては上記の材料に同等の材料および上記の方法に同等の方 法を用いることもできるが、以下には好ましいものにつき説明する。

ここにアンピコＣ型ロタウィルス株−１（以下、ＡｍＣ−１という）と記載の単 離体は、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎがらＡＴＣＣＵＲ−９５８として入手可能のものである。これは叶、　Ｅ、Ｈ ，Ｂｏｈｌによりウィルス単離体を接種したノドパイオートブタ由来の腸内物（ ｂｕｌｋ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｆｌ、ｕｉｄｓ）の２０％懸濁液としてＡＴ ＣＣに提出されている。Ｃ型ロタウィルスに感染した動物なら何でもＣ型ロタウ ィルス単離体に代わるソースとして用いることかできる。

この単離体をノドハイオートブタに３代継代したが、そのとき感染した腸内物か ら大量の液体か取り出された。この単離体を遠心および濾過殺菌により精製した 。そしてＣ型ロタウィルスだけを第３伏目の継代てブタ内に同定した。その純性 および同定は次の方法で明らかにされた。（ａ）チャレンジした試験動物（チャ レンジ後１６時間）の小腸セクションの特殊な間接ＩＦＡ染色法、（ｂ）図１に 示した腸内物のＲＮＡ抽出ＰＡＧＥ評価によるウィルスケツムのプロフィル、（ Ｃ）腸内物の免疫電子顕微鏡写真、である。この腸内物を使って、初乳を奪った 帝王切開［Ｃ○ｌｏｓｔｒｕｍ　ｄｅｐｒｉｖｅｄ　Ｃｅ５ａｒｅａｎ　ｄｅｒ ｉｖｅｄ］　（以下、ＣＤＣＤという）ブタ内で高度免疫血清を生成したのて純 性はさらに高められ、Ｃ型ロタウィルスに対する反応だけが高度免疫後の血清中 に認められた。

この実施例は前以てノドパイオートブタて継代したウィルス単離体をＳＴ細胞内 で増殖する方法に係るが、さらに実験した結果、Ｃ型ロタウィルスの野株［ｆｉ ｅｌｄ　５ｔｒａｉｎｓ］を直接ＳＴ細胞内て継代してもよいことが分かった。

生きている動物内で前以て継代しておくことはウィルス力価を高めるため、また 、偶発的感染を排除するため、好ましいであろう。

Ｃ型のバルクウィルスの毒性をＣＤＣＤブタで試験した。チャレンジされたブタ は接種後２４時間以内に水様下痢を起こし、接種後５〜７日で死亡した。この死 亡するブタの接種後１６〜１８時間から採取した小腸セグメントは小腸の絨毛を 萎縮させる症状（絨毛萎縮）を示した。ＩＦＡ染色した冷凍セグメントは、その 絨毛の末端部にその小腸の十二指腸および空腸に発生した支配的に感染か広かっ た領域を見せた。小腸の管腔には水が充満し、チャレンジを受けた動物はチャレ ンジされなかった対照に比し平均的に体重減少か見られた。ブタにとっての感染 ｆｉ［ｐｉｇ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｏｓｅ］　（以下、ＰＩＤ）は５〜７ 日の持続時間［ｄｕｒａｔｉｏｎ］をもつ１０３ＰＩＤ５ｏ／ｍｌであると決定 された。

上記のバルク腸液を細胞培養の成長の出発物質として使用した。ＳＴ細胞（第５ ４代レベル）をＮａｔｉｏｎａｌ　ＡｎｉＩ［ｌａｌ　ＤｉｓｅａｓｅＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙの叶、　Ａｒ１１ｎ　ＭｃＣＩｕｒｋｉｏから得た。第１１４代レ ベルのＳＴ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎからＡＴＣＣＣＲＬ　１７４６として入手できる。これらのＳＴ細胞は Ｄｒ、　ＭｃＣｌｕｒｋｉｎによりＡＴＣＣへ提出されている。

Ｃ型ロタウィルスを第１次のＰＫ細胞およびＭａ−１０４細胞に取り込む手法は 既に報告されている通りである（２８．３０）。これらの研究ではタンパク質分 解酵素（パンクレアチン）の毒性量または次毒性量が成長を促進するために要求 された。ＳＴ細胞へ取り込むため、トリプシンだけを濃度約５〜８０μｇ／ｍｌ 、好ましくは約１０〜２０μｇ／ａ＋１のウィルス維持培地に組み込んだ。Ｍａ −１０４細胞のＣ型ロタウィルス細胞変性効果が、使用パンクレアチン量の細胞 障害効果によって曖昧にされるということか報告されているが、それに比しこれ は著しい進歩である。１０〜２０μｇ／ａ＋ルベルでトリプシンを組み込むと、 ウィルスの細胞変性効果が容易に観察できるのである。ＳＴ細胞での最初の５回 の連続継代にとっては継代間でウィルスを濃縮することか好ましかった。要する に上記の有毒ウィルスのバルクを例１として記載した方法でＳＴ細胞の回転瓶中 に接種した。接種後４８時間では細胞変性効果は明らかにならなかった。細胞お よびウィルスの増殖培地を３回冷凍および解凍し、それから瓶中の全内容物を１ ００．０００ｘ　ｇで遠心した。そうして得たペレットを新たなウィルス増殖培 地に再接種した。この過程をＳＴ細胞中で５代連続して継代を繰り返した。第５ 伏目では細胞変性効果が明白になり、Ｃ型ロタウィルスかＲＮＡ抽出、ＰＡＧＥ 分析によりウィルス増殖培地中に同定された。この時点てＳＴ細胞内での継代を 続けるためそれ以上ウィルスバルクを濃縮する必要はなくなった。

例１ 樹立した二倍体ブタ翠丸（Ｓ　Ｔ）細胞系中でのウィルス増殖および連続継代 ウィルス増殖に使われた培地は非必須アミノ酸のイーグルの最少必須培地および ｐｎを炭酸水素ナトリウムで７．２に調整したアールＢＳＳ、０．１Ｍのピルビ ン酸ナトリウム中のＬグルタミンで構成した。使用する直前にこの基礎培地に０ ．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、５０　μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０〜２０μ ｇ／ｍｌのトリプシンをさらに補充し、ｐｎをＩＯＮの水酸化ナトリウムで７． ４に調整した。トリプシンの代わりに、あるいはトリプシンに加えて他のタンパ ク質分解酵素を組み合わせることも、それらの細胞変性効果がウィルス細胞病理 学を曖昧なものにしないレベルに限定されている限り許される。例えば１〜２０ μｇ／ｍルベル、好ましくは１０μｇ／＋ｎｌレベルのパンクレアチンかある。

ウィルス吸収中にＤＥＡＥデキシトランを使用し、そのウィルス増殖培地中に組 む込むことは細胞変性効果の効率を向上させることが知見されたが、ウィルス力 価を有為に高めることはなかった。使用したＤＥＡＥデキシトランのレベルは０ ゜０５〜０．１μｇ／ａ＋１であった。細胞培養体をウィルス増殖培地で３回洗 浄し、接種する前に３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。これらウィル ス増殖に使用した細胞培養容器は、ミクロチター皿、組織培養管、レイトン管、 ３２オンス瓶、６４０ｃＩｎ２回転瓶である。回転培養こそウィルス産生に最も 効果的な方法であることか分かった。静置培養は一般に細胞質効果を示さなかっ たが、ＩＦＡ評価すると感染していることが観察され、典型的な細胞質の蛍光を 示した。

接種用のウィルス液は５００ｍｇものトリプシン、または０．１％ドデシル硫酸 ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）で、接種前に前処理することができる。前処理しても ウィルスの複製を阻害することはなく、ウィルス力価あるいは細胞培養へのウィ ルス適用を有為に増加もしくは減少するようなことは発見されなかった。

洗浄媒体を除去後、培養体にＣ型ロタウィルスを接種し、３７〜３９°Ｃて１〜 ２時間インキュベートした。接種物は洗浄され流されてしまうか、または新たな ウィルス増殖培地で希釈されてしまった。培養体は、回転培養、静置培養のいず れの場合も、３７〜３９°Ｃで１〜２日インキュベートした。感染した培養体は 接種後わずか１４時間で感染による巣状域を時間とともに増大して細胞変性効果 を示した。

細胞変性効果は、感染細胞のあるものが細胞の破壊片の細い糸で単分子層に所々 で絡み付き、細胞のストランディング、そしてその後、細胞溶解するという特徴 があった。この細胞変性効果は全部の細胞が関与し、細胞溶解か単分子層の全体 に見られる点にまで進展する。この細胞変性効果が繰り返された結果多数のウィ ルスが収穫された。ここでウィルスを液体、冷凍、または減圧凍結乾燥で保存し た。この方法で得たウィルスの典型的な力価は１ｍｌ当たり約１０７５〜１０９ ５組織培養感染量［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄ ｏｓｅｓｏ］　（Ｔ　ＣＩ　Ｆ　ｓｏ）である。好ましくは、このウィルスを少 なくとも３０回継代する。病原性は大概２２継代目までて喪失する。こうした細 胞培養体の接種、インキュベーションおよび収穫は、ウィルスゲノムまたはその 抗原性に影響することなく５０回続けられた。図１および図２に示した通りであ る。

ＳＴ細胞中での　ウィルス存在量　Ｃ型ロタウィルスＣ型ロタウィルス　（ＴＣ ＩＤｓｏ／ｍｌ）　の同定の継代レベル　ＩＦＡ’　ＧＥ２ Ａ＋ｎＣ−ａ／５Ｔ−Ｉ　ＣＰ　Ｅなし　＋　＋ＡｍＣ−１／５Ｔ−１０　１０ ５−１０　’　＋＋Ａａ＋Ｃ−１／５Ｔ−２５　１０８−１０　’　＋　＋Ａｍ Ｃ−１／５Ｔ−５０　１０８−１０９＋　＋＠　ＩＦＡ：間接免疫蛍光染色法 ＧＥ・ＲＮＡ抽出ＰＡＧＥ評価：ロタウィルスのフィンカープリント分析 例２ 特殊なＩＦＡおよび免疫電子顕微鏡写真（ＩＥＭ）分析で評価してみると、ヒト Ｃ型ロタウィルスに対する抗血清はブタＣ型ロタウィルスと交差反応し、ブタＣ 型抗血清はヒトＣ型ロタウィルスと交差反応する。さらに公表されている報告に よると、複数の国からのヒトＣ型ロタウィルスの少なくとも８つの単離体はブタ Ｃ型ロタウィルスと交差反応することか知られている（７．１０．１２．２０． ２５．２６．２７．３３．３４）。

ヒトＣ型ロタウィルスの抗血清には２つの源かつきとめられた。快復期にある血 清［ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ　ｓｅｒｕｍ］はスタッフォード大学退役軍人病 院のＤｒ、　Ｌｅｎｎａｒｔ　５ｖｅｎｓｓｏｎから提供してもらった。ミクロ チター皿上に成長したＳＴ細胞には例１て記載の通りＡｍＣ−１継代５２を接種 した。この感染細胞をアセトンに固定し、ヒトＣ型ロタウィルス抗血清の種々の 希釈液を使って間接蛍光抗体法により染色した。Ｃ型ロタウィルスは細胞変性的 であるので、固定した材料には抗体に結合され得る無細胞のウィルス破片が含ま れている。このほかに考えられる固定液きしては、メタノール、エタノール、プ ロパツール、ブインズ、ゼンカーズ、グルタルアルデヒド、およびホルマリンな どがある。

固定液は抗原性を著しく減少させるようなものであってはならない。抗ヒトＩｇ Ｇ蛍光イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を抱合体として使った。ローダミンのよ うなその他の蛍光標識をＦＩＴＣの代わりに使用してもよい。

特異的な細胞質蛍光か１／１０希釈液および１／１００希釈液で見られたが、１ ／１０００希釈液ては見られなかった。このように、ヒトＣ型ロタウィルス感染 に反応するヒト抗体の存在をブタＣ型ロタウィルスに感染させたＳＴ細胞から調 製した抗原試薬を使って検出することか可能であった。

ヤギおよびギニャブタで調製したＣ型ロタウィルスに対する抗血清を用いて抗原 捕獲ＥＬ　Ｉ　ＳＡを評価した。例１て記載したようにＳＴ細胞中で増殖させた Ｃ型ロタウィルスのバルク液を、抗血清産物の免疫剤［ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ　 ａｇｅｎｔ］として使用した。

このウィルス液を３回、冷凍と解凍を繰り返し、細胞破片を１０゜０００Ｘｇて ３０分遠心して分離した。このウィルスをさらにショ糖密度勾配超遠心法（１０ ０，０００ｘ　ｇ、２時間）で精製した。ウィルスを集め殺菌水中で反復懸濁し た。余分なショ糖を排除するためウィルスを再度上述の方法で超遠心し、そうし て得たウィルスのペレットを殺菌水中で繰り返し懸濁した。

６週間、フロイントの完全アジュバント中でアジュバントしたウィルスで１週間 、３週問および５週間注射して動物を高質免疫した。

Ｃ型ロタウィルスに対する抗血清力価を、抗ギニャブタまたは抗ヤギのＩｇＧペ ルオキシダーゼ抱合体とＡＢＴＳ基質を使って精製した上記方法によるＣ型ロタ ウィルス抗原に対しＥＬＩＳＡブロック滴定によって判定した。

Ｃ型ロタウィルス検出に使った分析法は、ミクロチター皿をヤギ抗Ｃ型ロタウィ ルスの所望の希釈液で塗布し４°Ｃで−晩インキュベートしたサンドイッチＥＬ ＩＳＡである。その皿を生理食塩水で洗浄し、２％ウシ胎児血清を使って非結合 部位を阻止した。その皿を再び生理食塩水で洗浄した後、例１に記載の方法で産 生したＣ型ロタウィルスのバルク液の（生理食塩水中への）４倍希釈液を接種し た。対照として各面の最後列にＡ型ロタウィルスの４倍希釈液を接種した。室温 で１時間インキュベート後、皿を生理食塩水で洗浄してウサギの抗ギニャブタわ さびベルオキシダーセを容器全部に加えた。室温で１時間インキュベート後、皿 を生理食塩水で洗浄してＡＢＴＳ基質を各面に加えた。室温で暗闇中で１時間イ ンキュベート後、皿を４１０ｎｍフィルタのあるＥＬＩＳＡリーダーにて読み取 った。プラスの読み取り値は特異的色彩反応≧０．１光学密度単位を示すサンプ ルで決定した。

Ｍａｕｎｕｌａらの「ロタウィルスＣに起因する系の破壊」　（フィンランドの ヘルシンキ大学ウィルス学部のＬｅｅｎａ　Ｍａｕｎｕｌａから入手した再刻版 ）は、我々の細胞培養植え付けのブタＣ型ロタウィルスを中和試験およびヒトの 体内のヒト抗Ｃ群ロタウィルスの有無についての免疫蛍光抗体試験で首尾よく使 用できたとしている。

例３ 組織培養植え付けのＣ型ロタウィルスのワクチンとしての評価：能動免疫 Ｃ型細胞培養植え付けのロタウィルスがブタに対しなお有毒であるかを決定する ため実験を行った。全部で５回ＣＤＣＤブタにウィルスを逆継代［ｂａｃｋｐａ ｓｓａｇｅ］　した研究では毒性への逆行を示さなかった。ワクチンの安全性は 、ギニャブタ、マウス、ウサギ、乳幼児ブタ、および妊娠ブタへ接種することに より試験された。ワクチン接種による不都合な反応はとの動物にも見られなかっ た。

ワクチンの動物実験は、細胞培養適合したブタＣ型ロタウィルスがこの方法によ るＳＴ細胞中ての５０継代後にその免疫原性をなお維持するか否かを見極めるた めに行った。適合されたブタＣ型ロタウィルスの種々の細胞培養継代レベルを評 価するため、１０頭のＣＤＣＤブタを使用した。２頭はワクチン接種しない対照 で、４頭はＣ型ロタウィルスＳＴ継代２５てワクチン接種し、残り４頭はＣ型ロ タウィルスＳＴ継代５０でワクチン接種した。ＡｍＣ−１／５Ｔ−２５ワクチン の力価は１０８０ＴＣＩ　Ｄ、、。

／ブタであった。それらブタに１ｆｆ＋１を経口接種、１ｍｌを筋肉的接種した 。そして接種後２週間目に全動物に毒性Ｃ型ロタウィルスをチャレンジした。接 種時、チャレンジ時（ワクチン接種後２週間経過時）、およびチャレンジ後３週 間経過時に各々、血液サンプルを集めた。

Ｃ型ロタウィルスに対する血清中和抗体レベルを血清定数を変更するウィルス分 析で決定した。要約すると、血清希釈液を調製し、同量のレファレンスのＣ型ロ タウィルスを各希釈液に加えた。血清中和に使ったウィルス量は血清希釈液当た り３００〜１０００ＴＣＩ　Ｄｓｏであった。さらに標準プラス血清および標準 マイナス血清を各分析に行った。ウィルス血清混合物を３７°Ｃて６０分インキ ュベートし、その後側１に記載の方法て集密的なＳＴ細胞培養に接種した。細胞 変性効果の有無如何を見るため５〜７日後に培養体を調べた。細胞変性効果を示 した血清希釈液を（＋）とし、血清中和力価をＳｐｅａｒｍａｎ　Ｋａｒｂｅｒ 法で計算した。そのデータを表１に記す。

表１　ワクチン接種したＣＤＣＤブタにおけるブタ抗Ｃ型ロタウィルス血清の中 和抗体反応ブタ　接種物　Ｃ型ロタウィルス　チャレンジ　チャレンジ頭数　血 清の中和抗体力価ネ１　前の接種口ネ２　後３週間百４　Ｃ型ロタ／５Ｔ−２５ ３５５５０６４０４Ｃ型ロタ／５Ｔ−５０−３５２８０６４０２無接種　４０　 ３５　２８０ 本１グループの幾何平均血清中和力価 ネ２チャレンジの日、接種後３週間目 Ｃ型ロタウィルスのワクチン接種を受けたグループは共に接種後に血清転換［５ ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ］を示した。これらワクチン接種されたグループの 抗体レベルは、接種を受けなかった対照の抗体レベルより少なくとも８倍または それ以上であった。

動物たちを日に２回、ロタウィルス感染の症状かないか診断した。どの動物も接 種後には何らの症状も示さなかったので、このＣ型組織培養継代休は非病原性で あることが分かった。これらのデータはウィルスが病気に関与する病毒因子なし に免疫応答できるように修飾されていることを示している。これらワクチン接種 されたブタにおけるこうした免疫応答は、表２に示すようにワクチン接種しなか った対照に比しＣ型ロタウィルスの罹患率［ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ］において著し い減少を示した。

表２　チャレンジ後の罹患率および耐久期間グループ　ＭＩＤ零１　％　減少　 対照比非接種　１１／１４　７９ Ｃ型／ＭＡ−２５０／２８　０　１００％Ｃ型／ＭＡ−５０５／２８　１８　７ ７％本Ｉ　Ｍ　Ｉ　Ｄ　：　Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ 　Ｄｕｒａｔｉｏｎの略、即ち罹患率および耐久期間。ブタ延日数全体に対し下 痢症状を示したブタ延日数で表す。

上記データは、ここに記載の方法でＣ型ロタウィルスをブタ毫丸細胞へ適応する こと［ａｄａｐｔａｔｉｏｎ］がその免疫原性にとって有害でないことを明白に しているし、また、二倍体のブタ寒丸細胞系に増殖させたウィルスは、ブタを実 際に免疫することができる有効なワクチンになることを示している。ブタ翠丸細 胞における継代は、したがってその免疫原性を変えることなくＣ型ロタウィルス の病毒力を減衰もしくは除去することをか分かった。

○５Ｕ（Ａ−１、血清型）およびＩｏｗａ（Ａ−２、血清型）として同定される ２つの主たるブタロタウィルスのＡ型断片を含む多価ロタウィルスワクチン中に 取り込んだ細胞培養適応させたＣ型ロタウィルスの安全性および有効性を評価す るため動物実験を行った。ＭＬＶのＡ型ロタウィルスはロタウィルス感染予防の 米国り、　Ａ、ライセンスを受けたワクチンであるが、これを好振動物および幼 児ブタに接種した。このＡ型ロタウィルスワクチンの安全性および有効性につい ては既に報告されている（１５．１６．３４．３５）。

この実験の目的は多価ロタウィルスワクチン接種した動物がなおＣ型ロタウィル スへ血清転換［５ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔ］するが、またこの動物がＣ型ロタウィ ルスでチャレンジされたときこれを予防し得るかを見ることであった。

１０匹のＣＤＣＤブタをこの多価ＭＬＶロタウィルスワクチンの有効性評価のた めに使用した。そのうち４匹は接種せず６匹にだけ接種した。使ったロタウィル ス量は次の通りである。

Ａ−１ブタの１０”ＴＣＩＤｓｏｌＡ　２／ブタの１０７３ＴＣ■Ｄ５ｏ、ブタ 当たりＡｍＣ−１（ＳＴ継代２５）の１０８３ＴＣＩＤ５゜である。ブタたちに は経口で１田１投与し、１ｆｌ！１は筋肉内接種した。ワクチン接種後１４日で 動物全てに病毒性Ｃ型ロタウィルスを経口チャレンジした。

ワクチン接種時およびＣ型ロタウィルスチャレンジ時（接種後１４日目）に血液 サンプルを収集した。全ロタウィルス断片につき血清中和抗体レベルを既述の血 清変化・ウィルス固定の分析法で判定した。その結果を表３に示す。

表３・多価ＭＬＶロタウィルスワクチンに対するＣＤＣＤブタ血清中和抗体応答 ブタ数　接種物　Ｃ型　Ａ型Ｉ　Ａ型。

１４−ＤＰＶ　１４−ＤＰＶ　１４−ＤＰＶ６　ＭＬＶｏ夕４０　３６３（９Ｘ ）　３５　２０９０（６０Ｘ）　４０　８３２（２１Ｘ）４　非接種　２３　４ ０（ＯＸ）　３５　４０（ＯＸ）　２３　２３（ＯＸ）＠　１４−ＤＰＶ　ワク チン接種後１４日（Ｃ型ロタウィルスチャレンジの日）０内は血清中和力価の増 加倍率 Ｃ型ロタウィルスをＭＬＶＡ型ロタウィルスワクチンと組合せて使用したとき、 その血清転換招来能如何で測定した限りワクチン接種した動物にとってなお有効 であることが明らかである。

接種後、動物たち全てにつき日に２回ロタウィルス感染の症状如何を診断した。

しかし動物はどれひとつとして感染症状を示さず、したがってＡ型とＣ型を組合 せたＭＬＶワクチンの安全性か明確になった。ワクチン能の他の証明は、表４に 示すように病毒性のＣ型、Ａ１、Ａ２の各ロタウィルスでワクチン接種したブタ と対照の非接種ブタとにチャレンジした後の観察により明らかにされた。

表４＝チャレンジ後の症状とロタウィルス排泄便ロタウィルス排泄便零２ チャレンジ後のＭ　Ｉ　Ｄ＊１　チャレンジ後のグループ　Ｃ型　Ａ型、　Ａ型 ２　Ｃ型　Ａ型、Ａ型２対照（非接Ｅ　２０／２８（７１％）　２４／２ｇ（８ ６％）　１６／２８（５７％）＋＋＋ロタの成分　２／４２（４％）　Ｏ／４２ （０％）　Ｏ／４２（０％）−一一％減少（比対」　９４％　１００％　１００ ％　１００％　１００％　１００％＄Ｉ　Ｍ　［Ｄ　：　１ｉｏｒｂｉｄｉｔｙ 　Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｄｕｒａｔｉｏｎの略。下痢症状のブタ延日数 ／全ブタ延日数で表す。

零２感染細胞のＩＦＡ染色法及び／又は大便サンプルのＲＮＡ抽出とＰＡＧＥ分 析で判定。

このデータはロタウィルス病および大便によるウィルス排泄の症状から見る限り 、はぼ１００％の予防ができることを明らかにしている。また、Ｃ型のＳＴ細胞 培養適応されたロタウィルスか、たとえ多価Ａ型ロタウィルスワクチンに添加し たとしてもなお、病毒性のＣ型ロタウィルス感染に対する安全かつ有効な予防ワ クチンとして使用することかできることも示している。

本発明は活性免疫感作のための具体的な手続に限定されるようなものではない。

このワクチンは経口投与でも、筋肉内接種、皮下注射ないし血管的注射ても、あ るいは鼻骨的接種でも行うことかできる。

例４ ＳＴ細胞培養適応のＭＬＶ− Ｃ型ロタウィルスのワクチン評価−受動免疫単独あるいは多価ワクチンの１成分 としてのＭＬＶ−Ｃ型ロタウィルスの安全性および有効性を評価するため妊娠ブ タ［ｇ１１ｔ］について動物実験を行った。２８頭の妊娠ブタ全部をこの実験に 使った。１０頭は接種せず、１０頭は多価ワクチン中のＣ型ロタウィルスで接種 、残り８頭はＣ型ロタウィルス単独で接種した。この多価ワクチンは、ＭＬＶ− Ｃ型ロタウィルス、ＭＬＶ−Ａ型ロタウィルス、Ｍ　Ｌ　Ｖ−Ｔ　Ｇ　Ｅ　（Ｔ ｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ　Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓの略。伝染性胃腸 炎）　、Ｃ１ｏｓｔｒゆ、ｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎ　ｅｎｓＣ型、およびＥｓｃｈ ｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉを含有していた。Ｃ型ワクチンは例１に記載の方法で 作り、妊娠ブタに次の２方法のうちのいずれかで投与した。（ａ）ワクチンを分 娩１週間前に行った筋肉的投与に引き続き、分娩５週間前および３週間前に経口 投与する。または（ｂ）分娩５週間前または２週間前にワクチンを筋肉的投与す る。

ワクチン接種前および分娩日に各々動物たちから採血した。

さらに乳サンプル（初乳）を分娩日および分娩後７〜１４日に採取した。血清サ ンプルおよび乳サンプルを例３に記載の方法て抗Ｃ型血清中和抗体につき分析し た。ワクチン接種したブタ［ｇｉｌｔ３］たちは正常の健康な子供を分娩し、有 害なワクチン反応は何も観察されなかった。表５に示すように、Ｃ型ＭＬＶＤタ ウイルスを多価ワクチンに添加してもＣ型ロタウィルスの有効性を減衰すること はなかった。

表５−妊娠ブタにおけるＭＬＶ−Ｃ型 ロタウィルスワクチンの有効性の評価 グループの幾何平均Ｃ型ロタウィルス中和抗体力価予防接種　分娩日　分娩後 動物数　接種物　の血清　の血清ネ１　初乳零２　７〜１４日の乳零３１０　非 接種　１２６　１８９（ＯＸ）　６４０　７１１０　Ｃ型ロタ／多価　６９　６ ４０（９Ｘ）　３６４８（６Ｘ）　３６３（５Ｘ）８　Ｃ型ロタ／単独　５７　 ３６３（６Ｘ）　３０３０（５Ｘ）　２４５（３Ｘ）＠　１１　０内は予防接種 力価からの倍率零２０内は非接種の対照グループに比較したときの初乳の幾何平 均力価（ＧＭＴ）［ＧｅｏＩｏｅｔｒｉｃ　Ｍｅａｎ　Ｔｉｔｅｒ］の増加倍率 。

零３０内は非接種の対照グループに比較したときの乳の幾何平均力価（ＧＡＩＴ ）の増加倍率。

ワクチン接種した動物たちはＣ型ロタウィルスへ血清転換し、たちに比較しより 高いレベルを示した。これは妊娠ブタに一価ＭＬＶ−Ｃ型ロタウィルスワクチン またはＭＬＶ−Ｃ型ロタウィルス含有の多価ワクチンを接種することにより、乳 児ブタかＣ型ロタウィルスに対する受動免疫を得ることができることを示してい る。

本発明は受動免疫に関する上記プロトコルに限定されるものではない。例えば、 経口または筋肉内投与を分娩前２〜３週間に行うこともできる。

例５ 組織培養適応のＣ型ロタウィルス死菌 ワクチンのワクチン評価：受動免疫 死菌Ｃ型ロタウィルスワクチン単独および多価ワクチン成分としてのものの安全 性および有効性を評価するため、妊娠ブタ［ｇｉｌｔｓｌを使って動物美装を行 った。妊娠ブタの全数１０頭中、４頭はワクチン接種せず、３頭はＣ型ロタウィ ルス含有の多価ワクチンで接種し、残り３頭はＣ型ロタウィルス単独のワクチン で接種した。ワクチン接種した動物全部は正常の健康な子供を分娩し、ワクチン 接種したことに起因する有害な反応は観察されなかった。Ｃ型ロタウィルスワク チンは例１記載の方法で調製した。細胞破片を遠心除去し、浮遊物を採集した。

次にＣ型ロタウィルスのバルクを０．１％ホルマリンに５日間３７°Ｃて不活性 化した。このバルクはＲＮＡ抽出ＰＡＧＥ分析て死菌ウィルスバルク中で同定し た。

死菌ワクチンを分娩前５週間口および２週間口に筋肉内投与した。動物たちから ワクチン接種前および分娩口に各々採血した。また、乳サンプルを分娩口（初乳 ）および分娩後７〜１４日目に各々採集した。血清および乳サンプルを例３記載 の方法でＣ型ロタウィルス中和抗体如何につき分析した。

死菌Ｃ型ロタウィルスを多価ワクチン中への添加はＣ型ロタウィルスの有効性を 減衰しなかった。ワクチン接種した動物たちはＣ型ロタウィルスに血清転換され 初乳その他の乳の血清中和抗体力価につき非接種の対照動物たちより高いレベル を示した。

これらの結果を表６に示す。

表６：妊娠ブタにおける死菌Ｃ型ロタウィルスワクチンの有効性の評価 グループの幾何平均Ｃ型ロタウィルス中和抗体力価予防接種　分娩口　分娩後 動物数　接種物　の血清　の血清零１　初乳本２　７〜１４日の乳＊３４　非接 種　５３　９１（ＯＸ）　８３２　６９３　Ｃ型ロタ／多価　１３０　６４０（ ５Ｘ）　２７５０（３Ｘ）　、２７９（４Ｘ）３　Ｃ型ロタ／単独　９１　５５ ０（６Ｘ）　３６３０（４Ｘ）　３６３（５Ｘ）ｅ　本１　０内は予防接種力価 からの増加倍率軸０内は非接種の対照グループに比較したときの初乳の幾何平均 力価（Ｇ訂）［Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ　１ｌｅａｎ　Ｔｉｔｅｒ］の増加倍率。

零３０内は非接種の対照グループに比較したときの乳の幾何平均力価（ＧＭＴ） の増加倍率。

表６の結果を見ると、死菌Ｃ型ロタウィルスワクチン（単独および多価ワクチン との混合ともに）は妊娠動物のＣ型ロタウィルスへの免疫性を高め、ひいてはそ れら乳児ブタに与えられる受動免疫レベルを向上させるために有効に使用できる ことか明らかである。

こうしたデータは、本発明方法による二倍体のブタ電光細胞系へのＣ型ロタウィ ルスの適応かその免疫原性にとって有害でなく、本発明方法によるブタ皐丸細胞 で増殖させたウィルスが、ＭＬＶワクチンとしであるいは死菌ワクチンとして、 病毒性のＣ型ロタウィルス感染に対する有効なワクチンたり得ることを明確に示 している。ブタ皐丸細胞培養による継代は、その免疫原性に影響を及ぼすことな く、Ｃ型ロタウィルスの病毒力を低下ないし除去することが知見されたのである 。

例６ Ｃ型ロタウィルス感染能を見るための細胞系試験ノドパイオートブタて産生じた 病毒性Ｃ型ロタウィルス腸内物を使って実験を行った。腸内物を下記細胞系の集 密的細胞単層上に接種した。接種細胞を２日間インキュベートした後、アセトン に固定し、間接蛍光抗体法ｄｅウィルス感染能［１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙコを調 べた。

細胞系　型　感染した単層の％　第５回目のＣＰＥブタ皐丸蛍光二倍体　７５％ 　プラス ＭＡ−１０４安定　１５％　なされず Ｖｅｒｏ　安定　８％　なされず ウシ鼻介骨　安定　８％　なされず ＰＫ、５　安定　０％　なされず ＢＳＣ安定　０％　なされず ■　感染した単層の％は、接種後４８時間の接種細胞をＩＦＡ　［Ｉｎｄｉｒｅ ｃｔ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｏｔ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ］すなわち間 接蛍光抗体染色法で分析したもの。

修飾 薬学的に許容されるキャリヤ中に本発明に従い調製したＣ型ロタウィルスの有効 量を使ってワクチンを調製した。そのワクチンにとり適した投与方法に従いキャ リヤも経口、筋肉内、その他のワクチン投与の従来法に適したものにした。修飾 した生菌ワクチンの場合、ウィルスをスクロース、ゼラチンおよびペプトンと共 に凍結乾燥し安定化することが好ましい。死菌ウィルスワクチンの場合は、好ま しいキャリヤはフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバント、スク アラン、および水素化アルミニウム水である。さらに、本発明で調整したＣ型ロ タウィルスは、Ａ型ロタウィルス、伝染性胃腸炎、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐ ｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　Ｃ型、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの単独 または適当な何らかとの混合といった従来の多価ワクチン形式で組合せることも できる。

本発明により調整したＣ型ロタウィルス抗原は、Ｃ型ロタウィルス感染を診断す るための診断試験に使用することかできる。

免疫学的試験の種類は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光抗体法、化学ルミネセンスな ど当業者間に周知の技術である。粗Ｃ型ロタウィルス抗原でも精製Ｃ型ロタウィ ルス抗原でも抗体含有液の産生における、あるいはＣ型ロタウィルスに対する感 受性体のワクチン接種における免疫原エージェントとして、あるいはまた、Ｃ型 ロタウィルス特異性抗体の精製におけるイムノソーベント［１ａｏｎｕｎｏｓｏ ｒｂｅｎｔＪ　（！：して使用することができる。そしてこうした抗体は、治療 薬としても、あるいはワクチン接種により免疫応答の誘導薬として使用すること ができる。抗体は免疫血清すなわち乳の形式、あるいは精製した形式で投与する ことができる。

Ｃ型ロタウィルス粒子は宿主細胞の増殖を支持する培養基から得ることができる が、宿主細胞が溶解、例えば凍結／解凍を数回繰り返すとかソニケーション［５ ｏｎｉｃａｔｉｏΩ］をすれば、収穫量を向上させることができる。次にウィル ス液を例えば２．０００〜６．０００Ｘｇの遠心で細胞破片から精製する。ある いは、ウィルスを例えばスクロース２０％クッション中に１０．０００　ｘ　ｇ の超遠心でさらに精製し、生理食塩水中で再懸濁する。そうして得た抗原調製物 を診断薬として使用するため標識付けるか固定化する。

あるいはそうして得た調製物を、例えばキレート化剤及び／又は洗浄剤で処理し サブユニット抗原を産生ずるか、または例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグ ラフィ、レクチンアフィニティクロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣなどで成分抗原 分子中にクロマトグラフィ溶解させる。

本発明の診断的分析は特定のアッセイフォーマットに限定されるものではない。

例２に記載の蛍光抗体法の代わりに、酵素免疫検定法、ラジオイムノアッセイ、 粒子（例、ラテックス）凝集分析などを使用することもできる。この分析は競合 的に行ってもサンドイッチ方式に行ってもよく、また標識付けした抗抗体に代え て標識付けした抗原を用いてもよい。ＥＩＡの場合、好ましい標識は１１２５で ある。標識種（または支持体）を免疫Ｈｉｔ薬［ｉｍｍｕｏｏｒｅａｇｅｎｔ］ に共役することによりアビジン／ビオチン結合させることもできる。

適当な希釈剤中に適当な容器で所望の試薬および任意の支持体と共に包装するこ とで、本発明による抗原から診断キットを調整することができる。

１、Ｂｅ１ｌｉｎｚｏｎｉ、Ｎ、、Ｍａｔｔｉ、ｏｎ、Ｌ、、Ｖａｌｌｅｊｏｓ 、Ｊ、、ＬａＴｏｒｒｅ、Ｅ。

、　５ｃｏｄｅｌｌｅｒ、　Ａ、１９８７　アルセンチンにおけるニワトリの非 定型的ロタウィルス。Ｒｅｓ、　Ｖｅｔ　５ｃｉｅｎｃｅ、　４３：　１３０− １３１゜２、　Ｂｅｎｆｉｅｌｄ、　Ｄ、Ａ、、　５ｔｏｔｚ、　Ｉｖａｎ、、 　Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，およびＭｃＡｄａｒａｇｈ、　Ｊｏｈｎ　Ｐ、１９８２． 分娩前後のブタの糞便中のロタウィルス排泄。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、、　１６：　１８６−１９０゜３、　Ｂｏｈｌ、　Ｅ、Ｅｌ、、　Ｋｏ ｈｌｅｒ、　Ｅ、Ｍ、、　５ａｉｆ、　Ｌ、Ｊ、、　Ｃｒｏｓｓ、　Ｒ，Ｆ、、 　Ａｇｎｅｓ、　Ａ、Ｇ、およびｔｈｅｉｌ、　Ｋ、Ｗ、１９７８．　ブタの下 痢の原因としての０タウイルス。Ｊ、　Ａｒｎ、　Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ ｏｃ、、　１７２：　４５８−４６３゜４、　Ｂｏｂｌ、　Ｅ、Ｆｌ、、５ａｉ ｆ、　Ｌ、Ｊ、、　Ｔｂｅｉｌ、　Ｋ、Ｗ、、　Ａｇｎｅｓ、　Ａ、Ｇ、、およ びＣｒｏｓｓ　Ｒ，Ｆ、　、１９８２．　ブタのパラロタウィルス°その検出と ロタウィルスからの区別およびノドパイオートブタにおける発病学。Ｊ、　Ｃ１ １ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、、　１５：　３１２−３１９５、　Ｂｒｅｅｒ、　Ｃ，、 Ｗｕｏｄｅｒｌｉ、　Ｗ、、Ｌｅｅ、　Ｃ，、Ｗｅｉｓｓｅｒ、　Ｅ、、および ５ｃｈｏｐｆｅｒ、　Ｋ、、　１９８５．　Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ−ｕｎｄ　Ｐａ ｒａｒｏｔａｖｉｒｕｓ−Ｉｎｆｅｃｔｉ。

ｎｅｎ　ｂｅｉ　Ｅｒｗａｃｈｓｅｎｅｎ、　Ｓｃｈｗｅｊ、ｚ、　ｍｅｄ、　 Ｗｓｃｈｒ、　１１５：　１５３０−１５３５゜６、８ｒｅｍｏｎｔ、　Ｍ、、 　Ｃｏｂｅｎ、　Ｊ、、　ＭｃＣｒａｅ、　Ｍ、Ａ、、　１９８８．　ブタＣ型 ロタウィルスの構造ポリペプチドの分析。Ｊ、　Ｖｉｏｒｏｌ、、　６２：　２ １８３−２１８５゜ ７、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｐｅｄｌｅｙ、　Ｓ、、　ＭｃＣｒａｅ、 　Ｍ、、　１９８６．　ヒトにおけるＣ型ロタウィルス。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍ ｉｃｒｏ、　２３：　７６０−７６３゜８、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ，１９ ８８，ブタロタウィルスおよびその病気における役割。Ｐｉｇ　Ｎｅｗｓおよび Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、　９：　２３−２６゜９、８ｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ ，、１９８５，ブタにおける定型的ならびに非定型的ロタウィルスに対する抗体 優勢。Ｙｅｔ、　Ｒｅｃ、　１１６・５０１０、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ， 、１９８７，動物およびヒトにおける新規なロタウィルス。Ｗｉｌｅｙ、　Ｃｈ ｉｃｈｅｓｔｅｒ　Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ１２ ８：　５−２３゜ １１、　Ｂｒｏｗｎ、　ＤＪ、、　Ｂｅａｒｄｓ、　Ｇ、Ｍ、、　Ｇｕａｎｇ− Ｍｕ、　Ｃ，、Ｆｌｅｗｅｔｔ、Ｔ。

Ｈ，、１９８７，ヒトおよび動物におけるＢ型（非定型的）ロタウィルスに対す る抗体優勢。Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、、　２５：　３１６−３１９１２ 、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｄ、Ｗ、Ｇ、、　Ｍａｔｈａｎ、　Ｍ、Ｍ、、　Ｍａｒｔｉ ｎ、　Ｒ，、Ｂｅａｒｄｓ、　Ｇ、Ｍ。

、　Ｍａｔｂａｎ、　Ｖ、１．、１９８８．南インドのベロールにおけるロタウ ィルス疫学、グループ、サブグループ、血清型、ならびにエレクトロフェロタイ プ。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　２６：　２４１０−２４１４゜ｒｏｖ、 　Ｌ、Ｍ、、　Ｍｅｌｎｉｃｋ、　Ｊ、Ｌ、、およびＧｒａｈａｍ、　Ｄ、Ｙ、 　１９８３．感染した、および免疫感作した、幼児がらの抗体的に顕著なロタウ ィルスの検出法。４４：　２．　５２３−５２６゜１４、　Ｅｓｐｅｊｏ、　Ｒ ，Ｔ、、　Ｐｕｅｒｔｏ、　Ｊ、、　５ｏｌｅｒ、　Ｃ，、およびＧｏｏｚａｌ ｅｚ。

Ｎ、、　（１９８４）感染および免疫感作したヒトパラロタウィルスの特徴。４ ４　（１）：　１１２−１１６゜１５、　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｇ、Ｒ，、 Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、およびＷｅｌｔｅｒ、　ＣＪ。

１９８６、ブタロタウィルスワクチン効果の評価。Ｙｅｔ、　ｌ１ｅｄ、、　８ １コ　１８８−１９２゜ １６、　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｇ、Ｒ，、Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、および Ｗｅｌｔｅｒ、　ＣＪ。

１９８６、幼児ブタにおける離乳後の体重増加に対するブタロタウィルスワクチ ン接種の効果。Ｍｏｄｅｒｎ　Ｖｅｔ、　Ｐｒａｃｔ、、　６７：　６０９−６ １０゜ １７、　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、　Ｇ、Ｒ，、Ｂａｒｋｅｒ、　Ｔ、、　Ｗｅｌ ｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、およびＷｅｌｔｅｒ、　Ｃ，Ｊ、　１９８８．若いブタにお ける下痢：５つの極めて一般的な感染剤の発病比較。Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ、、　８ ３：　８０−８６゜１８、　Ｊａｓｂｅｓ、　Ｍ、　Ｓおよびｉｎｏ、　Ａ、Ｍ 、、　Ｆａｕｎｄｅｚ、　Ｇ、　Ａｖｅｎｄａｎｏ、　Ｌ。

Ｆ、、　５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｅ、、１９８６．　ヒトパラロタウィルスのｉｎ　 ｖｉｔｒｏ転写。Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５７：　１８３−１９０゜１９、Ｋａｐ ｉｋｉａｏ、Ａ、Ｚ、、Ｆｏｒｅｓ、Ｊ、、Ｈｏ５ｈｉｎｏ、Ｙ、、Ｍｉｄｔｈ ｕｎ、Ｋ、。

Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ、Ｍ、、Ｇｒｅｅｎ、Ｋ、Ｙ、、Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｒ，Ｍ、 、Ｐｏｔａｓｈ、Ｌ、。

５ｅａｒｓ、Ｓ、Ｄ、、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、Ｍ、Ｌ、、Ｅｌａｌｓｅｙ、Ｎ、Ａ 、、Ｂｌａｃｋ、Ｒ，Ｅ、。

Ｐｅｒｅｚ−５ｃｈａｅｌ、　１．、１９８９．　幼児および若い子供における ロタウィルス性下痢に対するロタウィルスワクチンの開発と展望。

Ｒｅｖ、　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　Ｖｏｌ、　Ｉｌ、　Ｓｕｐｐｌｅｍ ｅｎｔ　３：５５３９−５４６゜２０、　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｋ、、　Ｍｏ ｔｏｉｃｂｉ、　Ｈ，、５ｂｕｄｏ、　Ｙ、、　５ｈｕｊｉ、　Ｎ、、　５ｈｕ ｎｚｏ、　Ｃ，、およびＹｏｓｈｉｎｏｂｕ、　Ｋ、１９８９．学生における急 性ロタウィルス感染に関与する胃腸炎の発病。　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、１６０　（４）：　６１１−６１５２１、　Ｎａｇｅｓｈａ、　Ｈ，Ｓ 、、　Ｈｕｍ、　Ｃ，Ｐ、、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｅｌｏｌｍｅｓ、 　Ｉ、Ｈ。

、　１９８８．オーストラリアブタにおける非定型的ロタウィルス。

Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、１０２：　９１−９８゜２２、Ｎ１ｃｏｌａｓ、Ｊ、 Ｃ，、Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、、Ｆｏｒｔｉｅｒ、Ｂ、、Ｌｏｕｒｅｏｃｏ、Ｍ、Ｈ。

、およびＢｒ１ｃｏｕｔ、　Ｆ、１９８２．　ヒトパラロタウィルスの単離。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２４：　１８１−１８４゜２３、０ｊｅｈ、　Ｃ，に、、 ５ａｉｆ、　Ｌ、Ｊ、、　Ｋａｎｇ、　Ｓ、Ｙ、、１９８８．　ブタＣ型ロタウ ィルスに対するモノクロナール抗体の産生と特徴。動物の病気に関する研究者会 議Ｎｏｖ、　１４−１５．　Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃３２８２４、Ｐｅｄｌｅｙ、 Ｓ、、Ｂｒｉｄｇｅｒ、Ｊ、Ｃ，、Ｂｒｏｗｎ、Ｊ、Ｆ、、ＭｃＣｒａｅ、Ｍ、 Ａ、。

１９８３、顕著なグループ抗原を有するロタウィルスの分子特性。

Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：　２０９３−２１０１゜２５、　Ｐｅ ｎａｒおよびａ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｃｕｂｉｔｔ、　Ｗ、Ｄ、、５ｉｎａｒａｃｂ ａｔａｎａｎｔ、　Ｐ。

、　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｄ、Ｎ、、　Ｌｉｋａｎｏｎｓａｋｕｌ、　Ｓ、、　５ａ ｉｆ、　Ｌ、、　Ｇｌａｓｓ、　Ｒ，１，。

１９８９、　タイ、ネパール、英国における下痢症患者におけるＣ型ロタウィル ス感染。Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１６０：　３９２−３９７゜２６、　 Ｒｏｄｇｅｒ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｈｏｌｍｅｓ、　 １．Ｈ，、１９８２，幼児における下痢に関与するロタウィルス様エージェント の検出。

Ｊ、Ｃｌ１ｐ、Ｍｉｃｒｏ、１６：　７２４−７２６゜２７−５ａｉｆ、、　Ｌ Ｊ、、およびＴｈｅｉｌ、　ＫＪ、、１９８５．　ヒトおよび動物由来の抗原的 に顕著なロタウィルス。Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ　Ｂ、Ｖ、子供における感染性下痢症。２０８−２１４゜２８、５ａｉｆ、 　Ｌ、Ｊ、、　Ｔｅｒｒｅｔ、　Ｌ、Ａ、、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｋ、Ｌ、、およ びＣｒｏｓｓ。

Ｒ，Ｆ、　１９８８．連続細胞系におけるブタＣ型ロタウィルス（パラロタウィ ルス）の連続増殖および継代ウィルスの特性。Ｊ、　ｏｆＣＩｉｎ、　Ｍｉｃｒ ｏ、　２６　（７）：　１２７７−１２８２゜２９、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ、Ｄ、 Ｒ，、Ｈｅｒｒｉｎｇ、Ａ、Ｊ、、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、１．、Ｉｎｇｌｉｓ。

Ｊ、Ｍ、、　Ｈａｒｇｒｅａｒｅｓ、　Ｆ、Ｄ、　１９８４　ウシ、子ブタ、子 ヒツジ、ヒトの非定型的ロタウィルス。Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ、、　６５：　 ９０９−９１４゜３０、　Ｔｅｒｒｅｔ、　Ｌ、Ａ、、および５ａｉｆ、　Ｌ、 Ｊ、、　（１９８７）、初代ブタ腎臓細胞培養におけるブタＣ型ロタウィルス（ パラロタウィルス）の連続的増殖。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、、　２５： 　１３１６１３１９゜３１、　Ｔｅｒｒｅｔ、　Ｌ、Ａ、、　５ａｉｆ、　Ｌ、 Ｊ、、　Ｔｈｅｉｌ、　ＫＪ、、およびＫｏｈｌｅｒ。

Ｅ、Ｍ、　１９８７．　ブタパラロタウィルスの物理学的ならびに化学的特性と 、細胞培養の蛍光抗体法を使ったウィルスおよびウィルス抗体の検出法。Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　２５　（２）：　２６８−２７２゜３２、　Ｔｈｅ ｉｌ、　［、Ｖ、、　ＭｃＣＩｏｓｋｅｙ、　Ｃ，Ｍ、、　５ａｉｆ、　Ｌ、Ｊ 、、　Ｒｅｄｍａｎ、Ｄ。

Ｒ，、Ｂｏｂｌ、　Ｅ、Ｈ，、Ｈａｎｃｏｃｋ、　Ｄ、Ｄ、、Ｋｏｈｌｅｒ、　 Ｅ、Ｍ、、　Ｍｏｏｒｈｅａｄ、　Ｐ。

Ｄ、　１９８１．ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析のためのロタウィ ルス二重鎖リボ核酸の簡単で迅速な調製法。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　 １４：　２７３−２８０３３、　Ｕｓｈｉｊｉｒｎａ、　１１．、　Ｈｏｎｍａ 、　Ｈ，１Ｍｕｋｏｙａｆｆｌａ、　Ａ、、　５ｈｉｎｏｚａｋｉ、　Ｔ、。

Ｆｕｊｉｔａ、　Ｙ、、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　Ｍ、、　０ｈｓｅｔｏ、　Ｍ 、、　Ｍｏｒｉｋａｗａ、　Ｓ、、およびＫｉｔａｍｕｒａ、　Ｔ、、　（１９ ８９）、東京におけるＣ型ロタウィルスの検出。Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、Ｖｉｒ、 　２７：　２９９−３０３゜３４、　ｖｏｎ　Ｂｏｎｓｄｏｒｆｆ、　Ｃ，、５ ｖｅｎｓｓｏｎ、　Ｌ、、フィンランドにおけるヒト血清型Ｃ型ロタウィルス。

（１９８８）　Ｓｃおよび、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、２０：　４ ７５−４７８゜３５．　Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、、　Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、 　Ｇ、Ｒ，、およびＷｅｌｔｅｒ、　ＣＪ。

１９８６、　２つの主要なＡ型血清型に対する混合ブタロタウィルスワクチン。

　Ａｇｒｉ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　５ｗ１ｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　７： 　５９−６２゜３６、　Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｗ、、　Ｗｅｌｔｅｒ、　Ｃ，Ｊ 、、帝王切開初乳奪ブタにおける死菌および修飾生菌のブタロタウィルスワクチ ンの評価。

Ｙｅｔ　Ｍｉｃｒｏ、　”Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ″３７、　Ｗｏｏｄｅ、　Ｇ、Ｎ、 、　Ｂｒｉｄｇｅｒ、　Ｊ、Ｃ，、Ｈａｌｌ、　Ｇ、Ａ、、　Ｊｏｎｅｓ　Ｊ、 Ｍ。

およびＪａｃｋｓｏｎ、　Ｇ、１９７６、レオウィルス様エージェント（ロタウ ィルス）の急性胃腸炎子ブタからの単離。Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、、　９：　２０３−−２０９゜３８、米国特許第３．８３８．００４号、Ｍｅ ｂｕｓおよびＴｗｉｅｂａｕｓ、　９−２４−７４、子ウシ下痢ウィルスワクチ ンおよびその製造法。

３９、米国特許第３．８３９．５５６号、ＭｅｂｕｓおよびＴｗｉｅｂａｕｓ、 　１０−４−７４、子ウシ下痢ウィルスワクチンおよびその製造法。

４０、米国特許第３．８６９．５４７号、Ｍｅｂｕｓら、３−４−７５、子ウシ 下痢ウィルスワクチンおよびその製造法。

４１、米国特許第４．７５１．０８０号、Ｗｙａｔｔら、６−１４−８８、ロタ ウィルス由来の病気に対するワクチン。

４２、米国特許第４．６２４．８５０号、Ａｌｂｅｒｔら、１１−２５−８６、 ヒトロタウィルスの生弱毒ワクチン。

図１ ブタＡ型ロタウィルスおよび Ｃ型ロタウィルスのゲノムの エレクトロフェロタイプ 第１列　細胞培養適応したＡ型（血清型Ａ、）第２列　細胞培養適応したＡ型（ 血清型Ａ２）第３列　病毒性腸内物由来のＣ型 第４列　第３列と第５列の共同電気泳動第５列　細胞培養適応したＣ型 図２ 要約書 診断キット用の抗原および抗血清およびＣ型ロタウィルス感染予防の死菌ワクチ ンを産生ずるため、ブタ畢丸細胞中で希釈濃度のタンパク質分解酵素と共にＣ型 ロタウィルスを増殖する。

ブタ翠丸細胞中のＣ型ロタウィルスを増殖することは、Ｃ型ロタウィルス感染予 防のために修飾生菌ウィルスワクチンとして使用するためウィルスを修飾するこ ともできる。

国際調査報告 Ｐｆｆｉ／ＩＩ！ｉＱ）／Ｑ４１７０ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔ、ｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／工ＰＥＡ／２１０にτ用刃 ＩＡＸ３刀 Ａｔｔａｃｈｍ＠ｎｔ　ｔｏ　ＰＣＴ／ＦｉＡ／２１０．　Ｓ田買ＯＮ　ＶＴ： １ｎｖｅｎセｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｐｔ、ＰＣＴ　Ｒｕ１ｅ　１３．１　ａｎｄ　 １３．２　ｄｏ　ｎｏｔ　ｐｒｏｖｉｄ＠　ｆｏｒＭｕｌｔｌｐｌｅ　ｄｉｓｔ ｌｎｃｔ　ｐｒｏｄｕｅｔｓ　ａｎｄ　＋＊ｅｔｈｏｄｓ。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ型ロタウイルスの増殖を少なくとも５代は支持することができる細胞増殖 支持培地が設けられた二倍体細胞内で継代し、このＣ型ロタウイルスに細胞変性 効果を起こすことができるタンパク質分解酵素の非細胞変性効果量を有している ことを特徴とする細胞培養におけるＣ型ロタウイルス増殖法。
2. ２．細胞がブタ睾丸細胞である請求項１のＣ型ロタウイルス増殖症。
3. ３．増殖培地がトリプシンを含む請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法。
4. ４．トリプシンが約１０μｇ／ｍｌないし８０μｇ／ｍｌ未満の範囲で含まれる 請求項３のＣ型ロタウイルス増殖法。
5. ５．Ｃ型ロタウイルスが免疫原性を著しく喪失せずに実質的に非病原性になるま でブタ睾丸（ＳＴ）細胞中で連続継代することを特徴とする請求項１のＣ型ロタ ウイルス増殖法。
6. ６．Ｃ型ロタウイルスがＳＴ細胞中で少なくとも約２２代連続継代されることを 特徴とする請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法。
7. ７．Ｃ型ロタウイルスがＳＴ細胞中で少なくとも約３０代連続継代されることを 特徴とする請求項６のＣ型ロタウイルス増殖法。
8. ８．培養基がタンパク質分解酵素を含むことを特徴とする請求項１のＣ型ロタウ イルス増殖法。
9. ９．培地が実質的にパンクレアチンまたはトリプシン以外のパンクレアチン成分 のないものであることを特徴とする請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法。
10. １０．ｐＨが約６〜約８の範囲内である請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法。
11. １１．Ｃ型ロタウイルスの細胞変性効果がウイルスの首尾よい継代を確認するた め定期的に観察することを特徴とする請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法。
12. １２．薬学的に許容できるキャリヤ中に請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法に従 って増殖した実質的に非病原性のＣ型ロタウイルスの有効量を含むワクチン。
13. １３．薬学的に許容できるキャリヤ中に請求項５のウイルスを実質的に非病原性 にする増殖法で増殖したＣ型ロタウイルスの有効量を含む弱毒ワクチン。
14. １４．薬学的に許容できるキャリヤ中に請求項６のウイルスを実質的に非病原性 にする増殖法で増殖したＣ型ロタウイルスの有効量を含む弱毒ワクチン。
15. １５．薬学的に許容できるキャリヤ中に請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法に従 って増殖し、その後そのウイルスを実質的に非病原性にするため不活性化したＣ 型ロタウイルスの有効量を含む死菌ワクチン。
16. １６．請求項１２のワクチンをヒトまたは動物に投与することを特徴とするＣ型 ロタウイルスにより引き起こされる感染に対しヒトまたは動物を免疫感作する方 法。
17. １７．分娩前６週間以内に請求項１２のワクチンを妊娠したホスト哺乳動物に投 与し、これによって当該ホストに免疫応答を引き起こし、当該ホストから新生哺 乳動物児へ授乳される初乳および初乳以外の乳経由のＣ型ロタウイルス感染に対 し受動的に予防することを特徴とするＣ型ロタウイルス起因の感染からの新生哺 乳動物児の予防法。
18. １８．請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法により増殖させたＣ型ロタウイルスの ウイルス粒子でサンプルをインキュベートし、これによって当該サンプル内の抗 体がこれらウイルス粒子の少なくともいくつかに結合させ、そうしてウイルス粒 子に結合した抗体の存在を検出することを特徴とするＣ型ロタウイルスに対する 抗体のサンプル内検出法。
19. １９．抗体がヒト抗体であり、増殖させたＣ型ロタウイルスがブタから得たもの であることを特徴とする請求項１８のＣ型ロタウイルスに対する抗体のサンプル 内検出法。
20. ２０．結合した抗体を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣとの結合抗体をインキュベートす ることにより検出することを特徴とする請求項１９のＣ型ロタウイルスに対する 抗体のサンプル内検出法。
21. ２１．抗体が結合したウイルス粒子を中和させ、その中和させたウイルス粒子ひ いては結合抗体をウイルス粒子をＳＴ細胞に暴露することで検出し、当該ＳＴ細 胞の感染を非結合ウイルス粒子により検出する請求項１８のＣ型ロタウイルスに 対する抗体のサンプル内検出法。
22. ２２．宿主細胞を溶解し、そのライゼートからウイルス抗原を少なくとも一部分 純化採取することにより、請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法に従ってＣ型ロタ ウイルスを増殖することで得た、標識付けされたか固定化された形で存在するＣ 型ロタウイルス抗原を有する抗原試薬。
23. ２３．請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法によりＣ型ロタウイルスを増殖し、そ の宿主細胞および薬学的に許容できるキャリヤを溶解することにより得た１また は２以上のＣ型ロタウイルス抗原を有し、免疫担当サブジェクト中にＣ型ロタウ イルスと免疫学的に交差反応する抗体を生成することができる免疫学的組成物。
24. ２４．請求項２３の免疫学的組成物を投与することを特徴とするヒトまたは動物 の免疫感作法。
25. ２５．Ｃ型ロタウイルスが請求項１のＣ型ロタウイルス増殖法により増殖された Ｃ型ロタウイルスまたはＣ型ロタウイルス由来の抗原調製剤に対し生成される抗 体を有する組成物。