CN109535250A - 美洲型prrsv n蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用 - Google Patents
美洲型prrsv n蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用，以期研发新型PRRSV疫苗。该单克隆抗体可特异性识别氨基酸序列如SEQ NO.1所示的美洲型PRRSV N蛋白的抗原表位。本发明设计了所述单克隆抗体的制备方法。本发明设计了PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒，含上述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，可避免PRRSV感染早期而出现的抗体空白现象，对病毒感染的检测更直观、快速。本发明将所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体在免疫学检测中应用。本发明为进一步研究PRRSV核衣壳蛋白结构奠定基础，为研制新型PRRSV疫苗提供帮助，进而为免疫预防PRRS提供了新方向。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，具体涉及一种美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproduetive and Respiratory Syndrome，PRRS）是目前世界养猪业危害最为严重的病毒性疾病。感染 PRRSV 后母猪以生殖障碍为特征，主要表现为早产、晚期流产、死胎、木乃伊胎、发热、厌食等，感染的仔猪表现为呼吸道症状，也有神经症状。其在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。接触感染、精液传播、空气传播是PRRSV的主要传播途径，鸟类、鼠类、人类等运输工其都可能成为本病的媒介。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是引起该病的致病因子。该病毒有两种主要的血清型类型，分别是基因Ⅰ型（欧洲型）和Ⅱ型（美洲型）。欧洲型以 Lelystad 株（LV 株）为代表，美洲型以 VR2332 株为代表。感染PRRSV的猪和感染后康复的猪都能排毒，有研究报道能分别从感染后210天的血清、42天的唾液、43-92天的精液、38天的粪便、21天的鼻腔液、28天的尿液、157天的口腔刮脱物中分离到病毒。
酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体或激素的免疫分析技术，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于量大临床标本的同时检测。目前国内外己经建立了很多关于PRRSV感染检测的ELISA方法，但这些检测方法绝大多数都是基于PRRSV抗体检测的，而猪感染PRRSV后最早7天才能诱发可检测的抗体，个别猪甚至感染PRRSV 3周后仍然检测不到抗体，这种不能及时检出PRRSV感染的状况给后续采取措施来控制PRRS的大面积爆发造成了一定阻碍。
此外，国内外对于PRRSV N蛋白表位的研究并不是非常完善，Meulenberg等人用肽扫描技术对PRRSV I型N蛋白表位进行分析，得到2-12，25-30，40-463段B细胞表位；多年后，Plagemann等人用基于肽扫描方法对PRRSV II型N蛋白表位进行分析，得到23-33，31-50，43-563段B细胞表位；T.Q.An等用噬菌体展示技术结合生物套选法对PRRSV II型N蛋白表位进行分析，获得表位78-87。
研究筛选出合适的靶抗原并制备出相应抗体，以研制新型PRRSV疫苗是免疫预防PRRS的研究重点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用，以期研发新型PRRSV疫苗。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
研发一种美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体能特异性识别美洲型PRRSVN蛋白的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
优选的，所述单克隆抗体的重链型为：lgG1，轻链型为：Kappa 型。
优选的，所述单克隆抗体的效价大于等于1：3.2×105。
优选的，所述单克隆抗体IPMA与IFA检测能够特异性识别美洲型PRRSV的不同毒株。
进一步的，所述美洲型PRRSV毒株为JX-A1或BJ-4。
设计一种所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）原核表达N蛋白并纯化；
（2）将所述纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠；
（3）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，采用ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体。
设计一种PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，含上述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体。
将所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体在免疫学检测中应用。
优选的，所述免疫学检测为ELISA、IPMA、IFA中的任意一种。
设计一种含所述的抗体的预防美洲型PRRSV疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明应用于检测或预防治疗当中，成本低，不依赖于大型仪器；与荧光定量PCR相比，能够显著降低成本，易于在生产和科研中推广和应用。
2. 本发明美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体可特异性的识别N蛋白B细胞新表位。
3. 本发明中的试纸条基于双抗夹心ELISA抗原检测法的原理针对PRRSV抗原的检测，可避免PRRSV感染早期而出现的抗体空白现象，对病毒感染的检测更直观、快速。
4. 本发明中的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体能够特异性识别美洲型PRRSV的不同毒株，且不与CSFV、PCV2等其他病毒发生交叉反应，可用于制备美洲型PRRSV抗原检测试剂盒。
5. 本发明为进一步研究PRRSV核衣壳蛋白结构奠定基础，为研制新型PRRSV疫苗提供帮助，进而为免疫预防PRRS提供了新的方向和技术基础。
附图说明
图1为pET-28a-N重组载体构建后PCR鉴定结果图；
图中，M为DNA分子质量标准；1为ORF7基因；
图2为PRRSV N蛋白表达及纯化SDS-PAGE鉴定结果图；
图中，M为蛋白分子质量标准；方框标出为N蛋白；
图3为纯化后N蛋白与PRRSV阳性猪血清反应western-blot鉴定结果图；
图中，M为蛋白预染marker；方框标出为阳性猪血清所识别的N蛋白；
图4为单抗与PRRSV JX-A1株的结合能力IPMA鉴定结果图；
图中，1G4、1C6、3D11为单抗上清；PC为阳性血清，作为阳性对照；NC为PBS，作为阴性对照；BC为未接毒空白对照；
图5为覆盖N蛋白重叠多肽的设计图；
图中，分别合成6段多肽，命名P1～P6；
图6为单抗识别位点dot-ELISA鉴定结果图；
图中，P1～P6为合成的短肽，其中P1为经PBS稀释的短肽MPNNNGKQQKKKKGN（1～15aa）；PC为经PBS稀释的N蛋白，作为阳性对照；NC为经PBS稀释的原核表达无关蛋白，作为阴性对照；
图7为表位1～15aa在不同毒株间的保守性生物信息学软件分析结果图；
图8为单抗1G4腹水纯化前后SDS-PAGE鉴定结果图；
图中，M为蛋白分子质量标准；1为IG4腹水纯化前；2为IG4腹水纯化后；
图9为单抗1G4腹水纯化后效价结果图；
图10为单抗1G4与PRRSV JX-A1、BJ-4株的结合能力IFA鉴定结果图；
图11为双抗夹心ELISA结果图；
图中，包被物为纯化后的阳性猪IgG；检测物分别为PBS、PRRSV、CSFV、PCV2；单抗为1G4。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：免疫原的选择和制备
1.免疫原的选择
发明人长期、大量研究、实践、试验发现：首先，在PRRSV基因组所编码的蛋白中，由ORF7编码的核衣壳蛋白即N蛋白高度保守；其次，在机体中由N蛋白激发的免疫反应性远远高于其他蛋白，从而容易获得高亲和力的单抗；再次，PRRSV感染机体后N蛋白含量最高，所占结构蛋白总量的40%～60%，是PRRSV抗原检测的优势靶标。
基于以上三点N蛋白成为首选靶标蛋白。
2.免疫原的制备
N蛋白的核苷酸序列在Genebank上的登录号为：EF112445。
（1）构建表达N蛋白的pET-28a-N重组载体，构建后PCR鉴定结果如图1所示；
（2）将重组表达载体pET-28a-N电转入感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，获得阳性重组大肠杆菌BL21（DE3）；
（3）将阳性重组大肠杆菌BL21（DE3）接种于LB培养基中，在IPTG浓度为 1mM的条件下，16℃诱导表达10小时；
（4）收集样品进行超声破碎及Ni柱纯；
（5）将纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot检测。
鉴定结果显示：
如图2所示，纯化后获得的N蛋白纯度较高；如图3所示，纯化后获得的N蛋白在Westernblot检测中显示出与PRRSV阳性猪血清有较高的结合能力。
实施例二：阳性杂交瘤细胞株的筛选及鉴定
1. 动物免疫
（1）将免疫原N蛋白加入弗氏完全佐剂首次免疫，乳化制成免疫抗原；
（2）通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，免疫剂量50μg/只；
（3）每隔3周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；
（4）四免后，细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是100 μg/只；
（5）多抗血清效价和敏感性测定：
最后一次加强免疫后一周，分别对3只小鼠进行剪尾采血，然后通过间接ELISA法和间接竞争ELISA法分别对3只小鼠多抗血清的效价和敏感性进行测定。结果显示3号鼠的免疫效果最好，效价是1：4000，选择3号鼠进行细胞融合。
2. 细胞融合及单克隆抗体制备
（1）采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；
（2）分装在铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃、5% CO2培养箱内培养，于融合后第五天每孔补加培养基50 μl，12天后，以N蛋白或多肽作为包被抗原，通过间接ELISA法对杂交瘤细胞上清测OD值，作为阳性杂交瘤的初筛；
（3）通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3～4次亚克隆筛选，最终获得了3株能稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1G4，1C6，3D11）。
3. 稳定性鉴定
将所建立的单克隆杂交瘤细胞株连续培养3个月并反复液氮冻存复苏，从而鉴定杂交瘤细胞的稳定性。结果显示单克隆杂交瘤细胞株稳定性良好。
4. 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）
IPMA操作过程：
Marc145细胞铺96孔细胞板，待细胞汇合度长至70%左右接毒（PRRSV 强毒株JX-A1）。接毒后1h补加2%胎牛血清的DMEM培养基；48h后固定细胞：弃去96孔板中的培养基，PBST洗2～3次，50uL/孔加-20℃预冷的固定液（乙醇/0.3%双氧水的甲醇），室温静置10～15min；弃去固定液，PBST洗3次，200 μL/孔加脱脂奶，四度过夜封闭；弃去封闭液，PBST洗3次，50 μL /孔，分别加入各单抗，37℃，1h；弃去一抗，PBST洗5～6次，拍干，50 μL /孔加一定倍数稀释的对应二抗（HRP-羊抗鼠酶标二抗），37℃，1h；弃去二抗，ddw洗5～6次，拍干，50 μL /孔，显色10min。（AEC显色液：每1ml ddw依次加A液1滴，B液2滴，C液1滴）。
如图4所示，经IPMA筛选，1G4，1C6，3D11均能与PRRSV JX-A1株反应。
实施例三：单抗识别位点的鉴定
1. PRRSV N蛋白抗原表位的制备
如图5所示，采用肽扫描法设计合成6段多肽，每段多肽5个氨基酸重叠，覆盖整个N蛋白。多肽段氨基酸序列如表1所示。
表1多肽段氨基酸序列
。
2. Dot-ELISA筛选能与抗体结合的短肽
多肽用PBS缓冲液稀释，取2μg在NC膜上点样，完全风干后，用5%脱脂奶封闭，4℃过夜；用所述抗体孵育，37℃ 1h；PBST洗涤3～5次，HRP酶标二抗（1：1000稀释），37℃孵育1h；加入AEC底物显色液，室温显色3min后用去离子水终止显色。
如图6所示，结果显示单抗1G4可以特异性识别表位1～15aa；单抗1C6可以特异性识别表位26～50aa；单抗3D11可以特异性识别表位46～70aa。其中，1G4所识别表位未曾被报道过，是一段由本发明新发现的美洲型PRRSV N蛋白B细胞表位。
3. 分析所得新表位在美洲型PRRSV各毒株之间的保守性
利用生物信息学软件ClustalX2.0分析未被报道过的表位1～15aa在美洲型PRRSV各毒株之间的保守性。
表2 毒株信息
。
结果如图7所示，利用生物信息学软件ClustalX2.0结果显示该表位在美洲型PRRSV各毒株之间保守性较高，与欧洲型序列差异较大，显示单抗1G4可用于区分美洲型及欧洲型PRRSV。
实施例四：1G4腹水的制备、纯化及鉴定
1. 体内诱生腹水法制备单抗
选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞1G4，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。
2. 抗体的纯化
辛酸-硫酸铵法进行抗体纯化，操作方法如下：
（1）取出冻存的单抗腹水或抗血清，6000 r/min离心30min，获得上清液，用醋酸钠缓冲液（0.06mol/L pH4.8）稀释5倍。
（2）用NaOH（5mol/L）调节pH为4.5，室温缓慢搅拌0.5 h，加正辛酸，最终浓度为25μL/mL。
（3）4℃下6000 r/min离心30min，保留上清。
（4）用中速滤纸过滤得到的上清，并加入10×PBS缓冲液（pH7.4），体积为1/10，混合均匀后调节pH为7.4。
（5）在4℃条件下向混合液中添加固体硫酸铵，添加比例为0.2778 g/ mL，可多次添加，30 min内添加完毕。
（6）6000 r/min离心20min，扔掉上清液。添加起始腹水体积1/3的PBS（pH7.2）进行重悬，4℃下用PBS缓冲液透析24 h，期间换液3～4次，收集mAb，分装，-20℃保存。
单抗1G4腹水纯化前后SDS-PAGE鉴定结果图如图8所示，其中1泳道为纯化前，2泳道为纯化后，箭头指示位置由上而下分别为纯化后抗体重链和轻链位置。
3. 纯化后1G4单抗腹水的鉴定
（1）间接ELISA测定结果如图9所示，结果显示，纯化后1G4单抗上清效价均达到1：3.2×105；
（2）亚型鉴定：用亚型鉴定试剂盒对单抗的亚型进行鉴定，鉴定结果显示1G4单克隆抗体重链型为：lgG1，轻链型为：Kappa 型。
4. 间接免疫荧光试验（IFA）
IFA操作过程：Marc145细胞铺96孔细胞板，待细胞汇合度长至70%左右接毒（PRRSV 强毒株JX-A1、BJ-4）。接毒后1h补加2%胎牛血清的DMEM培养基；48h后固定细胞：弃去96孔板中的培养基，PBST洗2～3次，50 μL/孔加-20℃预冷的固定液（乙醇/0.3%双氧水的甲醇），室温静置10～15min；弃去固定液，PBST洗3次，200 μL/孔加脱脂奶，四度过夜封闭；弃去封闭液，PBST洗3次，50 μL /孔加一定稀释度的一抗（IG4），37℃，1h；弃去一抗，PBST洗5～6次，拍干，50 μL /孔加一定倍数稀释的对应二抗（FITC-羊抗鼠酶标二抗），37℃，1h；弃去二抗，PBST洗5～6次，于荧光显微镜下观察荧光。
结果如图10所示单抗IG4与美洲型PRRSV不同毒株反应均良好。
实施例五：双抗夹心ELISA抗原检测
用纯化的抗PRRSV阳性猪多克隆抗体用CBS缓冲液稀释后包被的酶标板上，37℃孵育3h；5%脱脂奶封闭，37℃ 3h ；PBST洗涤3～5次后分别加入待检样品PBS（不接毒阴性对照）、PRRSV、CSFV、PCV2（5×TCID50）37℃孵育1h；加入单抗1G4，37℃孵育1h；PBST洗涤3～5次后加入本发明单抗37℃孵育1h；洗涤后加入HRP羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1h；洗涤后加底物显色液5min后终止，用酶标仪检测其OD450处的吸光值。
结果如图11所示，图中显示单抗1G4可以识别美洲型PRRSV毒株，不与CSFV、PCV2发生交叉反应，特异性良好，可用于PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的制备。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学,河南中泽生物工程有限公司
<120> 美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体、其制备方法及其应用
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Animal
<400> 1
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn
1 5 10 15
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Animal
<400> 2
Lys Lys Lys Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu
1 5 10 15
Gly Lys Ile Ile
20
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Animal
<400> 3
Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro
1 5 10 15
Gly Lys Lys Asn Arg Lys Lys Asn Pro
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> Animal
<400> 4
Arg Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp
1 5 10 15
Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Animal
<400> 5
His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr
1 5 10 15
Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> Animal
<400> 6
Gly Ala Gly Thr Cys Ala Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr
1 5 10 15
Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr Gln His
20 25
Claims (10)
1.一种美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能特异性识别美洲型PRRSV N蛋白的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链型为：lgG1，轻链型为：Kappa 型。
3.根据权利要求1所述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的效价大于等于1：3.2×105。
4.根据权利要求1所述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体IPMA与IFA检测能够特异性识别美洲型PRRSV的不同毒株。
5.根据权利要求4所述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述美洲型PRRSV毒株为JX-A1或BJ-4。
6.一种权利要求1所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原核表达N蛋白并纯化；
（2）将所述纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠；
（3）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，采用ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产权利要求1所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体。
7.一种PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体。
8.权利要求1所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
9.依据权利要求8的应用，其特征在于，所述免疫学检测为ELISA、IPMA、IFA中的任意一种。
10.一种预防美洲型PRRSV疫苗，含有权利要求1所述美洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体。
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- 2018-12-13 CN CN201811527178.6A patent/CN109535250A/zh active Pending
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