CN108761098A - 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法 - Google Patents

致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法，旨在解决即时检测PCV2与PCV3的技术问题。该测试纸包括支撑板，样品端样品垫，金标垫，检测膜，手柄端吸水垫，检测线T1，检测线T2和质控线C，样品端样品垫、金标垫、检测膜、手柄端吸水垫互相交叉渗透；金标垫标记有PCV2单克隆抗体和PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，检测线T1包被有PCV2单克隆抗体，检测线T2包被有PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，质控线包被有兔抗小鼠IgG多克隆抗体或金黄色葡萄球菌SPA。本发明试纸廉价、特异、快速、简便无需仪器、易于运输，为疾病防控、检验检疫、感染监测以及临床和养殖基层的即时检测提供方便和效率。

Description

致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物免疫检测技术领域，具体涉及一种致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种无囊膜的单链闭合环状DNA病毒，具有PCV1，PCV2以及PCV3三种基因型。PCV1在猪群中广泛存在，但不具有致病性，不产生细胞病变(CPE)；PCV2则具有很强的致病性，是引起猪圆环病毒病(porcine circovirus diseases, PCVD)的主要及原发病原，由其引起的猪传染性疾病在全球猪群中广泛存在，是国际公认的危害世界各国规模化养猪业的重要免疫抑制病原；PCV3是从流产胎猪中检测到的一种新型的猪圆环病毒，其母猪具有猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)等临床病症，且PCV2阴性，回溯性分析表明，PCV3可能是丘疹性皮炎、肾病变、生殖障碍和多器官炎症这些临床病症的主要致病因。同时，基于现有的检测阳性样品多来自于PDNS等发病猪场，PCV3需引起足够的关注和预防。
PCV2单独感染时常常仅呈现亚临床感染状态，随之而来的混合或继发感染又与其他共感染病原导致的临床症状及器官病变十分相似，仅依靠临床症状和病理变化特点很难准确检测。目前检测PCV的方法主要有病毒的分离与鉴定技术、免疫学检测方法以及PCR检测3大类。病毒的分离与鉴定是最为准确的检测PCV感染的方法，但整个过程技术繁杂，需要专业人士进行操作，不适于病毒快速检测。免疫学检测方法具有高度的灵敏性和特异性，重复性好等优点，在流行病学普查和疫苗免疫效果评价中也具有很高实用性。特别是免疫层析快速检测试纸简便、快捷、无需特殊仪器设备、检测结果清楚直观，完美符合世界卫生组织(World Health Organization, WHO)制定的ASSURED性能标准，是一个非常适合实时和现场检测的成熟技术，方便在养殖基层的生产实践中以及监督检查中推广应用。
猪圆环病毒2型抗体快速检测试纸为猪圆环病毒2型感染快速检测以及免疫评价提供了重要参考，为猪圆环病毒病的防控提供了很好的基础。然而，随着猪圆环病毒疫苗大面积地使用，血清学的监测数据不再反应猪圆环病毒的感染状况，研发快速检测抗原的方法势在必行。然而，现在市场上还未见商品化的PCV2抗原检测试纸。PCV3作为新检测到的猪圆环病毒，其与PCV2所引起的临床症状一致。但是目前对于PCV3的研究还很少，主要的检测方法为PCR检测，PCR检测因其敏感性高的优点在实验室中被广泛应用于检测疾病病原，但其对技术和设备要求高，因此不适合现场实时监测以及在养殖基层中推广应用。
因此，目前亟需建立一种能够同时检测PCV2和PCV3的快速检测方法，为猪圆环病毒的临床快速检测以及病原监测、防控提供支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，该检测试纸符合WHO制定的ASSURED性能标准，以期为疾病防控、检验检疫、感染监测以及临床和养殖基层的即时检测提供低成本的技术物质基础。
另一方面，本发还公开了致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸的制备方法，以降低致病性猪圆环病毒的检测成本及技术门槛。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
设计一种致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，包括支撑板，样品端样品垫，金标垫，检测膜，手柄端吸水垫，检测线T1，检测线T2和质控线C，所述样品端样品垫、所述金标垫、所述检测膜、所述手柄端吸水垫互相交叉重叠；所述金标垫标记有PCV2单克隆抗体和PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，所述检测线T1包被有PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，所述检测线T2包被有PCV2单克隆抗体，所述质控线包被有兔抗小鼠IgG多克隆抗体或金黄色葡萄球菌SPA。
优选的，所述PCV2单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以抗原成分为PCV2a Cap蛋白的亚单位疫苗为免疫抗原；
（2）动物免疫：
将所述免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原分别免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠各3只，免疫剂量为30μg/只；在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，第三免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；最后一次加强免疫后3～30 周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫抗原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量为50μg/只；
（3）细胞融合及杂交瘤细胞的制备：
上述超强免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用含HAT的选择培养液混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，6～8天补加50μl/孔HAT培养液；
10天后，利用ELISA和IPMA方法对融合成功的孔选择阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆直到获得稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（4）单抗腹水的制备：
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化；即得；所得单抗的亲和力常数为3.6×109～1.2×1011；所得单抗的亚型为IgG1/λ或IgG2a/κ。
优选的，所述PCV3单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以PCV3 US MO2015毒株Cap序列依据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后克隆表达的蛋白为免疫抗原；所述密码子优化后Cap基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）动物免疫：
将所述免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原分别免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠各3只，免疫剂量为30μg/只；在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，第三免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；最后一次加强免疫后3～30 周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫抗原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量为50μl /只；
（3）细胞融合及杂交瘤细胞的制备：
上述超强免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用含HAT的选择培养液混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，6～8天补加50μl/孔HAT培养液；
10天后，利用ELISA和IPMA方法对融合成功的孔选择阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆直到获得稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（4）单抗腹水的制备：
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化；即得；所得单抗的亲和力常数为2.5×1010～2.5×1011；所得单抗的的亚型为IgG2 a /λ。
优选的，所述IPMA方法为：
将优化合成的PCV3 Cap基因编码区序列克隆至真核表达载体pcDNA3.1，构建得真核表达载体pcDNA3.1-PCV3Cap并提质粒备用；脂质体Lipofectamine2000按照 DNA：Lip2000(µg/µl)为3:1的比例介导所述pcDNA3.1-PCV3Cap转染293T细胞，每孔转入质粒100ng；转染后48h，用冷无水甲醇固定30min；PBS洗涤3次后加入一抗37℃孵育1h；PBS洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠二抗37℃孵育30min；PBS洗涤3次，AEC显色10min；显微镜下观察染色情况。
优选的，所述支撑板的材料为不吸水薄片条；所述样品端样品垫和所述金标垫的材料为玻璃纤维棉；检测膜的材料为硝酸纤维素膜；手柄端吸水垫的材料为吸水纸。
优选的，所述样品端样品垫、所述金标垫、所述检测膜、所述手柄端吸水垫互相交叉重叠1～2 mm。
优选的，还包括覆盖在所述样品端样品垫、所述金标垫或手柄端吸水垫的保护膜。
优选的，在所述样品端样品垫上的保护膜处印有标记线；在所述标记线旁标记有箭头和Max字样。
设计一种所述致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
（1）猪圆环病毒2型以抗原成分为PCV2a Cap蛋白的亚单位疫苗为免疫抗原；猪圆环病毒3型以PCV3 US MO2015毒株Cap序列依据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后克隆表达的蛋白为免疫抗原；
所述密码子优化后Cap基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）制备抗PCV2a Cap蛋白单克隆抗体和抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体：
以纯化的PCV2a Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白为抗原分别免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，获得PCV2和PCV2的杂交瘤细胞株，分别对比选择亲和力强的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体；
（3）将所述PCV2单克隆抗体和PCV3单克隆抗体作为金标抗体， 并将PCV2单克隆抗体和PCV3单克隆抗体分别包被于所述检测线T2和T1，将羊抗鼠IgG或金黄色葡萄球菌SPA包被于质控线，制备试纸条，切割成不同宽度即成。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明试纸能够同时检测PCV2和PCV3 Cap蛋白，为猪圆环病毒的临床检测、病原监测、流行病学普查以及疫苗评价等提供方便的途径和方法，具有显著的经济，社会和生态效益。
2. 本发明利用双单抗模式建立的抗原检测试纸可有效避免多抗的非特异性拦截，进一步提高了抗原检测的特异性，降低了假阳性结果，利于抗原定量、半定量检测，同时也克服了多抗的批间差异，更有利于抗原检测试剂的标准化生产。
3. 本发明的试纸符合WHO制定的ASSURED性能标准，廉价、敏感、特异、快速、简便无需仪器、易于运输。
4. 本发明的试纸使用时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品，在5分钟内即可判定检测结果，检测结果直观准确，易于判断。
5. 本发明的试纸既可检测组织样品，也可以检测血清样品，与PRRSV、CSFV、PRV、PEDV等病毒无交叉反应，可用于由PCV2和PCV3引起的病毒血症的检验。
6. 本发明为疾病防控、检验检疫、感染监测以及临床和养殖基层的即时检测提供了坚实技术保障。
附图说明
图1为PCV2 Cap蛋白纯化鉴定电泳图；
其中，M为蛋白质标准分子量标准，1～3为纯化的PCV2 Cap蛋白；
图2为PCV3 Cap蛋白的纯化鉴定电泳图；
其中，M为蛋白质标准分子量标准，1为纯化前重组蛋白上清，2为流穿液，3～7为纯化的PCV3 Cap蛋白；
图3为改进的免疫过氧化物酶单层细胞试验结果图；
其中，A为pcDNA3.1-PCV3Cap转染293T细胞，B为pcDNA3.1转染293T细胞；
图4为mAb1特异性IPMA测定结果图；
图5为mAb2特异性改良IPMA测定结果图；
图6为猪圆环病毒2型与3型双联抗原快速检测试纸的结构示意图；
其中，1为支撑板，2为检测膜，3为样品垫，4为金标垫，5为手柄端吸水垫，6为检测线T2，7为检测线T1，8为质控线（C）；
图7为猪圆环病毒2型与3型双联抗原快速检测试纸检测效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：猪圆环病毒2型、3型免疫抗原的制备
猪圆环病毒2型以抗原成分为PCV2a Cap蛋白的亚单位疫苗为免疫抗原；
以GenBank公布的PCV3 US MO2015毒株Cap序列为参考，依据大肠杆表达系统密码子偏好性进行密码子优化后，合成优化后Cap基因序列（如SEQ ID NO.1所示），构建原核重组表达载体 pGEX6P1-PCV3-Cap，利用原核系统表达并获得可溶性重组蛋白，重组蛋白分子量约为46kDa，经GST亲和纯化后，作为PCV3的免疫抗原。
纯化的PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白电泳图如图1和图2所示。
实施例二：抗猪圆环病毒2型、3型单克隆抗体的制备
1. 动物免疫
（1）将猪圆环病毒2型、3型的免疫抗原分别与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化。通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原分别免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠各3只，免疫剂量是30μg/只；
（2）在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，第三免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；
（3）最后一次加强免疫后3～30周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫抗原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是50μg/只。
2. 细胞融合及杂交瘤细胞的制备
（1）对小鼠进行超免后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用选择培养液(含HAT)轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，6～8天补加50μl/孔HAT培养液。
（2）10天后，PCV2利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）方法对融合成功的孔选择阳性杂交瘤细胞，然后通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆直到获得稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
IPMA实验采用常规方法，首先于96孔细胞版内培养PK15细胞，用PCV2病毒接毒，继续培养48h后用冷无水甲醇固定30min，PBS洗涤3次后加入一抗（杂交瘤细胞培养上清、PCV2单抗或PCV2阳性血清）37℃孵育1h，PBS洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠二抗37℃孵育30min，PBS洗涤3次，AEC显色10min，显微镜下观察染色情况。
PCV3利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和改进的免疫过氧化物酶单层细胞试验方法进行阳性选择；改进的免疫过氧化物酶单层细胞试验具体步骤如下：
1）将优化合成的PCV3 Cap基因编码区序列克隆至真核表达载体pcDNA3.1，构建真核表达载体pcDNA3.1-PCV3Cap并提质粒备用；
2）转染：脂质体Lipofectamine2000介导pcDNA3.1-PCV3Cap转染293T细胞（DNA：Lip2000(µg/µl) 比例为3:1），每孔转入质粒100ng；同时设置空载体pcDNA3.1质粒作为阴性对照；
3）固定：转染后48h，用冷无水甲醇固定30min，
4）加一抗：PBS洗涤3次后加入一抗（杂交瘤细胞培养上清、PCV3单抗或PCV3阳性血清）37℃孵育1h；
5）加二抗：PBS洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠二抗37℃孵育30min；
6）显色：PBS洗涤3次，AEC显色10min
7）显微镜下观察染色情况，结果如图3所示。
3. 单抗腹水的制备
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。
4. 单克隆抗体的鉴定
（1）单克隆抗体的抗体效价和亚型
以ELISA和IPMA测定杂交瘤细胞培养上清和腹水中猪圆环病毒2型不同抗原表位的单克隆抗体mAb1和mAb3、猪圆环病毒3型不同抗原表位的单克隆抗体mAb2和mAb4的效价。
单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1：640和1：105以上，IPMA效价分别在1：16和1：1600以上。
具体数据如表1所示：
表1 单抗亚型及亲和力常数
。
（2）单克隆抗体识别抗原表位分析
以阻断ELISA或叠加ELISA对抗猪圆环病毒2型单克隆抗体和抗猪圆环病毒3型单克隆抗体识别的抗原表位进行分析，获得分别识别猪圆环病毒2型不同抗原表位的单克隆抗体mAb1和mAb3，其分别用于胶体金标记和猪圆环病毒2型检测线T1印迹；获得特异识别猪圆环病毒3型不同抗原表位的单克隆抗体mAb2和mAb4，用于胶体金标记和猪圆环病毒3型检测线T2印迹。
（3）单克隆抗体的特异性
将上述单抗腹水按一定比例稀释后分别加入猪圆环病毒2型PCV2 KF株、猪圆环病毒1型PCV1、 猪瘟病毒CSFV石门株，猪繁殖与呼吸综合症病毒PRRSV BJ-4株，猪伪狂犬病毒PRVHN-JZ-16株，猪流行性腹泻病毒PEDV感染的细胞以及真核表达载体pcDNA™3.1/myc-HisA/PCV3-Cap瞬时转染的细胞中，利用IPMA检测方法，测定PCV2单克隆抗体与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PCV3是否具有交叉反应性，结果如图4所示；测定PCV3 Cap蛋白单克隆抗体与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PCV2是否具有交叉反应性，结果如图5所示。
测定结果证明用于胶体金标记的单克隆抗体mAb1和猪圆环病毒2型检测线T1的单克隆抗体mAb3可特异性识别猪圆环病毒2型毒株，用于胶体金标记的单克隆抗体mAb2和猪圆环病毒3型检测线T2的单克隆抗体mAb4均特异识别猪圆环病毒3型病毒。
实施例三：单克隆抗体的纯化
辛酸-硫酸铵法进行抗体纯化，操作方法如下：
（1）取1 mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.0），以0.1 mol/L HCl调至pH 4.5；
（2）于室温搅拌下，逐滴加入33 mL辛酸，4℃静置2 h，15000 r/min离心30 min，弃沉淀；
（3）在离心上清中加入1/10体积0.01 mol/L PBS （pH7.4），以0.1 mol/L NaOH调至pH7.4；
（4）于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45%，4℃静置2 h，10000 r/min离心30min，弃上清；
（5）以适量PBS重悬沉淀，对PBS透析过夜，换液3次。
（6）以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定纯化单克隆抗体IgG的蛋白含量在1mg/ml以上，以酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）测定小鼠腹水和纯化的抗体效价在1：105和1：1000以上，分装，冻存。
实施例四：制备猪圆环病毒2型与3型双联抗原快速检测试纸
1. 单克隆抗体的胶体金标记
（1）胶体金的制备
取100 mL超纯水置于500 mL洁净的锥形瓶，加入1 mL 1 %（w/v）氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1 mL 1%（w/v）柠檬酸钠溶液，煮沸约3 min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2 min；待溶液凉至室温，补超纯水至100mL，以0.2 mol/L K2CO3调pH至9.0，4℃避光可保存数月。
（2）最适标记蛋白浓度测定
取待标记单抗mAb1以及mAb2 IgG对20 mmol/L硼酸钠溶液（pH 8.0）4℃过夜透析。在微孔板中以25 mL超纯水 1：2、1：4、1：8……倍比稀释待标记单抗；各孔加入125 mL胶体金溶液，室温静置5 min；加入125 mL 1 mol/L NaCl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。
具体操作方法和颜色变化如表2所示：
表2 mAb1 IgG与胶体金最佳标记浓度的选择
。
以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，按设计的量加入蛋白、胶体金溶液、100 g/L NaCL 溶液后，室温反应10 min，0.6µg/孔是颜色保持紫红色不变的最低蛋白用量，因此，该蛋白的最佳标记量为4.8µg/mL（0.6×8）；同样方法得出mAb2 IgG的标记量为6.4µg/mL。
（3）单克隆抗体的胶体金标记
取2 mL 最适蛋白浓度的待标记单抗，加入10mL胶体金溶液（pH 9.0），迅速混匀，室温作用10 min～15 min；加入1/10体积含10%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的20 mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10 min～15 min；4℃，15000 g离心30min，小心移去上清；以含1%（w/v）BSA 的20 mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心，弃上清；重复洗涤1次，以1 mL含1%（w/v）BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，4℃保存备用。
2. 检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5×30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS（pH 7.2）将特异性识别PCV2的单抗mAb3，特异性识别PCV3的单抗mAb4稀释至1mg/mL，并分别放于贮存池；利用Biojet Quanti 3000以1 mL/cm分别将mAb3，mAb4和兔抗鼠IgG溶液喷点于检测膜中央，形成PCV2检测线T1、PCV3检测线T2和质控线C印迹，检测线与质控线相距0.5 cm；置42℃干燥箱30 min或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
3. 结合垫的制备
将玻璃棉切成1.5×30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取1mL胶体金标记物加入2 mL含2%（w/v） BSA、3%（w/v）蔗糖、0.6 mol/L NaCl、0.2%Tween 20（v/v）和 0.1%（w/v）叠氮钠的20 mmol/L硼酸钠溶液（pH 8.0）；利用AirjetQuanti 3000以15 mL/cm将抗胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置50℃干燥箱30 min干燥；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
4. 样品垫的制备
将玻璃棉切成1.5×30 cm2的长条，以将含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20（v/v）和0.1%（w/v）叠氮钠的PBS（pH 7.2）溶液浸泡玻璃棉条；置50℃干燥箱30 min干燥；将样品垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
5. 吸水垫的制备
将玻璃棉切成2.5×30 cm2的长条，将吸水垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
6. 支撑板的制备
将单面含有不干胶的PVC支撑板切成7.5×30 cm2的长板，制备支撑板。
7. 试纸的组装
将上述材料装配成试纸板：先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将胶金垫和样品垫依次粘贴于检测膜的样品端，各层间重叠1 mm～2 mm，再将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠1 mm～2 mm，在样品端以白色塑胶膜包裹样品垫和胶金垫，塑胶膜上印有检测方向及检测溶液上限标记，在手柄端以蓝色塑胶膜包裹吸水垫。
8. 切割与包装
用CM4000切割仪将装配好的试纸板切成3 mm的试纸条，将试纸条分装入塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存。
9. 猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双联检测试纸的具体结构
参见图6，图中，支撑板1用不干胶的PVC薄板；反应试剂载体吸附层由样品端样品垫3、金标垫4、手柄端吸水垫5组合而成，从样品端样品垫3开始，到手柄端吸水垫5依次粘贴在支撑层 1上面；检测膜2可采用硝酸纤维素膜（NC膜）；样品端样品垫3可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉；金标垫4为吸附胶体金标记识别PCV2单克隆抗体mAb1和识别PCV3 Cap蛋白单克隆抗体mAb2的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉；手柄端吸水垫5采用吸水纸，如滤纸。
试纸条总长8cm，宽度0.4cm，6为用特异识别PCV2单克隆抗体mAb3在硝酸纤维素膜上印制检测线T2，其印迹为“｜”；7为特异识别PCV3单克隆抗体mAb4检测线T1，其印迹为“｜”；8为兔抗小鼠IgG多克隆抗体或金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线，其印迹为“｜”；在检测膜上的质控线C、T1检测线印迹和T2检测线印迹组合排列为“｜｜｜”。
保护膜包括覆盖在玻璃棉及金标玻璃棉的保护膜和覆盖在吸水层滤纸上的保护膜。
在样品端样品垫3和金标垫4交界处对应位置的白色保护膜上偏向样品端样品垫3一方0.5 cm处的保护膜上印有一条标记线，在标记线右边印有箭头和Max字样，手柄端保护膜可用黄色或其它颜色，样品端样品垫3、金标垫4、检测膜2、手柄端吸水垫5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。
10. 猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双联检测试纸的使用方法
当猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双联检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检抗原及金标抗体mAb1和mAb2一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中金标抗体mAb1与待检PCV2抗原相结合，金标抗体mAb2与待检PCV3抗原相结合，形成金标抗体-抗原复合物。
mAb1-PCV2金标复合物可与检测膜上的PCV2检测印迹mAb3结合生成红棕色“｜”标记，mAb2-PCV3金标复合物可与检测膜上的PCV3检测印迹mAb4结合生成另一条红棕色“｜”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的抗鼠IgG或SPA，生成红棕色标记“｜”，三种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“｜｜｜”，表示样品中同时含有PCV2和PCV3。
而金标复合物不能与检测膜上的PCV2检测印迹mAb3结合，只能与PCV3检测印迹mAb4结合，生成红棕色“｜”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的抗鼠IgG或SPA，生成红棕色标记“｜”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“｜｜”，表示样品中只含PCV3。
同理，而金标复合物不能与检测膜上的PCV3检测印迹mAb4结合，只能与PCV2检测印迹mAb3结合，生成红棕色“｜”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的抗鼠IgG或SPA，生成红棕色标记“｜”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“｜｜”，表示样品中只含PCV2。
当样品中不含PCV2和PCV3时，没有金标抗体-抗原复合物形成，不能与PCV2检测印迹和PCV3检测印迹结合，则生成阴性标记“｜”。
如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
实施例五：检测猪圆环病毒2型与3型
1. 检测样品溶液的制备
组织样品（包括淋巴结，脾脏，肾脏）以样品稀释液或生理盐水1：5 倍稀释，充分研磨后，反复冻融2次，涡旋震荡5min，10000g离心10min，取上清为待检溶液；
血清和疫苗等液态检测样本，可以直接作为待检溶液，也可以加适量PBS或水进行简单混合后作为待检溶液。
2. 试纸检测
取100ul待检溶液加入实施例四制备的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双联检测试纸样品端，试纸水平放置5 min～10 min，观察结果。
3. 检测结果判定
如图7所示：
PCV2和PCV3双联检测试纸检测时，在检测膜显现三条红色条带“｜｜｜”，为猪圆环病毒2型混合猪圆环病毒3型感染；
在猪圆环病毒2型检测线和质控线显现两条红色条带“｜｜”，为PCV2阳性PCV3阴性；
在猪圆环病毒3型检测线和质控线显现两条红色条带“｜｜”，为PCV3阳性PCV2阴性；
只在质控线处显现一条红色条带“｜”，PCV2和PCV3皆为阴性；
试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南中泽生物工程有限公司
<120> 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
atgcgccacc gtgcgatctt tcgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60
cgtcgttacg cgcgtcgtcg tctgttcatc cgtcgtccga ccgcgggtac ctactacact 120
aaaaaataca gcaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caagccgtgg 180
cacgccaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgcgatctc tttcgaatac 240
tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg agcccggtta tcagcccggc acagcagacc 300
aaaaccatgt tcggccacac cgcgatcgat ctggacggcg cgtggaccac caacacctgg 360
ctgcaggacg atccgtacgc ggaatctagc acccgtaaag tgatgacctc caaaaagaaa 420
cactcacgct acttcacccc gaaaccgatc ctggcgggca ccaccagcgc gcatccgggt 480
cagtctctgt tcttcttcag ccgtccgacc ccgtggctga atacctacga tccgaccgtt 540
cagtggggcg cgctgctgtg gagcatctac gttccggaaa aaaccggcat gaccgatttc 600
tacggcacca aagaagtgtg gattcgttac aaatccgttc tgtaa 645

Claims (9)

1.一种致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，包括支撑板，样品端样品垫，金标垫，检测膜，手柄端吸水垫，检测线T1，检测线T2和质控线C，其特征在于，所述样品端样品垫、所述金标垫、所述检测膜、所述手柄端吸水垫互相交叉重叠；所述金标垫标记有PCV2单克隆抗体和PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，所述检测线T1包被有PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，所述检测线T2包被有PCV2单克隆抗体，所述质控线包被有兔抗小鼠IgG多克隆抗体或金黄色葡萄球菌SPA。
2.根据权利要求1所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，所述PCV2单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以抗原成分为PCV2a Cap蛋白的亚单位疫苗为免疫抗原；
（2）动物免疫：
将所述免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原分别免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠各3只，免疫剂量为30μg/只；在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，第三免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；最后一次加强免疫后3～30 周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫抗原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量为50μg/只；
（3）细胞融合及杂交瘤细胞的制备：
上述超强免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用含HAT的选择培养液混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，6～8天补加50μl/孔HAT培养液；
10天后，利用ELISA和IPMA方法对融合成功的孔选择阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆直到获得稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（4）单抗腹水的制备：
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化；即得；所得单抗的亲和力常数为3.6×109～1.2×1011；所得单抗的亚型为IgG1/λ或IgG2a/κ。
3.根据权利要求1所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，所述PCV3单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）以PCV3 US MO2015毒株Cap序列依据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后克隆表达的蛋白为免疫抗原；所述密码子优化后Cap基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）动物免疫：
将所述免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，通过背部皮下多点注射的方法，用弗氏完全佐剂免疫原分别免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠各3只，免疫剂量为30μg/只；在首次免疫14天和28天后分别用弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，第三免疫两周后，尾部采血，测小鼠血清效价；最后一次加强免疫后3～30 周，细胞融合前3～4天，选取血清效价最高的小鼠通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫抗原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量为50μl /只；
（3）细胞融合及杂交瘤细胞的制备：
上述超强免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用含HAT的选择培养液混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，250μl/孔，置37℃、5% CO2培养箱内培养，培养3～4天可以显微镜观察到小细胞团，6～8天补加50μl/孔HAT培养液；
10天后，利用ELISA和IPMA方法对融合成功的孔选择阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆直到获得稳定分泌的单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（4）单抗腹水的制备：
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化；即得；所得单抗的亲和力常数为2.5×1010～2.5×1011；所得单抗的的亚型为IgG2 a /λ。
4.根据权利要求3所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，所述IPMA方法为：
将优化合成的PCV3 Cap基因编码区序列克隆至真核表达载体pcDNA3.1，构建得真核表达载体pcDNA3.1-PCV3Cap并提质粒备用；脂质体Lipofectamine2000按照 DNA：Lip2000(µg/µl)为3:1的比例介导所述pcDNA3.1-PCV3Cap转染293T细胞，每孔转入质粒100ng；转染后48h，用冷无水甲醇固定30min；PBS洗涤3次后加入一抗37℃孵育1h；PBS洗涤3次后加入HRP标记的羊抗鼠二抗37℃孵育30min；PBS洗涤3次，AEC显色10min；显微镜下观察染色情况。
5.根据权利要求1所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，所述支撑板的材料为不吸水薄片条；所述样品端样品垫和所述金标垫的材料为玻璃纤维棉；检测膜的材料为硝酸纤维素膜；手柄端吸水垫的材料为吸水纸。
6.根据权利要求1所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，所述样品端样品垫、所述金标垫、所述检测膜、所述手柄端吸水垫互相交叉重叠1～2 mm。
7.根据权利要求1所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，还包括覆盖在所述样品端样品垫、所述金标垫或手柄端吸水垫的保护膜。
8.根据权利要求7所述的致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸，其特征在于，在所述样品端样品垫上的保护膜处印有标记线；在所述标记线旁标记有箭头和Max字样。
9.一种权利要求1所述致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）猪圆环病毒2型以抗原成分为PCV2a Cap蛋白的亚单位疫苗为免疫抗原；猪圆环病毒3型以PCV3 US MO2015毒株Cap序列依据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后克隆表达的蛋白为免疫抗原；
所述密码子优化后Cap基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）制备抗PCV2a Cap蛋白单克隆抗体和抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体：
以纯化的PCV2a Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白为抗原分别免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，获得PCV2和PCV2的杂交瘤细胞株，分别对比选择亲和力强的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体；
（3）将所述PCV2单克隆抗体和PCV3单克隆抗体作为金标抗体，并将PCV2单克隆抗体和PCV3单克隆抗体分别包被于所述检测线T2和T1，将羊抗鼠IgG或金黄色葡萄球菌SPA包被于质控线，制备试纸条，切割成不同宽度即成。
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