CN114958776A - Pcv2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1a6 - Google Patents

Pcv2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1a6 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PCV2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1A6，涉及单克隆抗体技术领域。杂交瘤细胞株1A6及其分泌的单克隆抗体能够与PCV2病毒和PCV2‑rCap蛋白发生特异性免疫反应，以鉴定PCV2和Cap蛋白、测定PCV2病毒含量；该杂交瘤细胞株1A6及其分泌的单克隆抗体可广泛的应用于免疫检测技术中，作为Western‑Blot、间接免疫荧光试验、免疫组化试验、中和试验和胶体金检测试验中的抗体使用。

Description

PCV2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1A6
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及一种PCV2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1A6。
背景技术
PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属病毒。PCV2为无囊膜、单股环状双向DNA病毒，含1767～1768个核苷酸，分子量为5.8×102。病毒粒子直径平均为17nm，对酸性环境(pH3)、氯仿或高温(56℃和70℃)有抵抗能力，病毒的DNA利用宿主细胞的酶自行复制。
Cap蛋白与病毒的致病性密切相关，通过改变病毒的宿主嗜性及病毒蛋白与细胞间的相互作用机制，可以使病毒获得不同的致病性。Cap蛋白是PCV2主要免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体。
PCV2可经口腔、呼吸道途径感染不同日龄的猪，病猪所接触的物品或病猪的分泌物可能含有传染性病原体。怀孕母猪感染PCV2后，也可经胎盘垂直传播感染仔猪，并导致繁殖障碍。
PCV2感染后会出现断奶仔猪多系统消耗综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、肉芽肿性肠炎、急性肺水肿和增生性坏死性肺炎等多种疾病。家猪和野猪是PCV2的自然宿土，猪科以外其他动物对PCV2均不易感。
猪圆环病毒病(PCVD)的含义是指一系列综合症侯群或是与PCV2感染相关的疾病。现已证实，PCV2主要侵害猪体的免疫系统，导致免疫抑制及机体抵抗力降低，干扰和破坏猪对其他病原微生物的免疫抗体的产生和维持，从而继发其他疾病。因此，在养殖业中，PCV2危害性不能孤立而言，更主要表现在它与其它重要疾病，例如猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪副嗜血杆菌病、猪肺炎支原体病、猪链球菌病和多杀性巴氏杆菌病等多种疾病的继发感染相关。
从上述可以看出，PCV2导致的疾病对养猪业的危害极其严重，免疫检测技术可以有效的检测PCV2或PCV2的有效抗原。对于免疫检测技术，能够与病毒抗原有效结合的抗体是关键。因此提供一种能够和PCV2或其抗原高效结合的抗体是本领域亟待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种PCV2单克隆抗体以及能够分泌其的杂交瘤细胞株1A6，以缓解缺少能够和PCV2或其抗原高效结合的抗体的技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述PCV2单克隆抗体以及能够分泌其的杂交瘤细胞株1A6在非诊断和治疗目的的检测PCV2或PCV2的Cap蛋白，或在制备用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株杂交瘤细胞株1A6，保藏编号为：CCTCCNO:C2022151。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了由杂交瘤细胞株1A6分泌产生的单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体在非诊断和治疗目的的检测PCV2或PCV2的Cap蛋白中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体在制备用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品，该产品包括杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的杂交瘤细胞株1A6以及其分泌的单克隆抗体能够与PCV2病毒、PCV2-rCap蛋白发生特异性免疫反应，具有良好的免疫原性，其特异性好、灵敏度高，可广泛的应用于免疫检测技术中，例如可作为Western-Blot、间接免疫荧光试验、免疫组化试验、中和试验和胶体金检测试验中的抗体，可用于鉴定PCV2和Cap蛋白以及测定PCV2病毒含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中杂交瘤细胞的培养上清和纯化抗体样品SDS-PAGE分析结果；
图2为实施例4中4种PCV2疫苗抗原样品Western-Blot分析结果；
图3为实施例4中单抗与PCV2的间接免疫荧光试验中单抗与接种PCV2病毒液的PK-15细胞作用的试验结果；
图4为实施例4中单抗与PCV2的间接免疫荧光试验中空白对照的试验结果；
图5为实施例4中单抗中和活性测定实验中的病毒对照组的免疫荧光检测结果；
图6为实施例4中单抗中和活性测定实验中的阴性血清组的免疫荧光检测结果；
图7为实施例4中单抗中和活性测定实验中的杂交瘤细胞1A6抗体中和组的免疫荧光检测结果；
图8为实施例4中单抗中和活性测定实验中的正常细胞对照组的免疫荧光检测结果；
图9为实施例5免疫组化检测方法中阴性对照结果；
图10为实施例5免疫组化检测方法中单抗1:1000稀释的阳性对照结果；
图11为实施例5免疫组化检测方法中单抗1:2000稀释的阳性对照结果；
图12为实施例5免疫组化检测方法中单抗1:4000稀释的阳性对照结果；
图13为实施例5免疫组化检测方法中单抗1:8000稀释的阳性对照结果；
图14为实施例6提供的胶体金检测试纸分别检测猪圆环病毒2型样品原液、100倍稀释、1000倍稀释和10000倍稀释的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株杂交瘤细胞株1A6，以及其分泌的单克隆抗体。杂交瘤细胞株1A6的保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCCNO:C2022151；保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072；保藏日期为：2022年5月21日。
该杂交瘤细胞株1A6以纯化的PCV2病毒液为免疫原免疫小鼠制备得到，其分泌的单克隆抗体能够与PCV2病毒和PCV2-rCap蛋白发生特异性免疫反应。使用thePierce.Rapid ELISA Mouse mAb IsotypingKit鉴定单抗亚型，杂交瘤细胞株1A6分泌的单克隆抗体的重链约为50kDa，轻链约为25kDa；单抗属于IgG2a亚类，轻链为к型。实验表明，杂交瘤细胞株1A6分泌的单克隆抗体能够与猪圆环病毒1-2型嵌合体、支原体肺炎二联灭活疫苗，猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗以及猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗发生特异性免疫反应。
本发明提供的杂交瘤细胞株1A6及其分泌的抗体免疫原性好，可广泛的应用于免疫检测技术中，例如可作为Western-Blot、间接免疫荧光试验、免疫组化试验、中和试验和胶体金检测试验中的抗体使用，可用于鉴定PCV2和Cap蛋白，测定PCV2病毒含量。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体在非诊断和治疗目的的检测PCV2或PCV2的Cap蛋白中的应用。可以理解的是，利用杂交瘤细胞株1A6或其分泌产生的单克隆抗体与PCV2的Cap蛋白的特异性结合的检测技术，均为上述应用。所述应用包括但不限于为采用(a)Western-Blot；(b)间接免疫荧光试验；(c)免疫组化试验；(d)中和试验；和(e)胶体金检测抗体试验中至少一种方法检测PCV2或PCV2的Cap蛋白。可选地，采用Western-Blot方法检测试验室中PCV2的Cap蛋白的表达和纯化；可选地，采用间接免疫荧光试验检测PCV2在宿主细胞中的增殖情况；可选地，联合多种检测方法检测宿主细胞或组织中PCV2的增殖情况，以研究目标基因、细胞因子、小分子药物或环境对宿主中PCV2增殖的影响，例如同时采用Western-Blot和间接免疫荧光试验对宿主细胞中的PCV2进行定性和定量的检测，或利用中和试验测定病毒力等。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体在制备用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品中的应用。可以理解的是，当用于制备产品时，杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体并非局限于存在于产品的最终形式中。杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体可以作为制备产品中一种或多种成分的前体或免疫原使用。一些可选的实例包括但不限于如下：使用杂交瘤细胞株1A6生产单克隆抗体，其最终产品，例如用于Western-Blot或ELISA的试剂，只包含其生产的单克隆抗体作为与抗原结合的一抗；或者以单克隆抗体作为免疫原生产与该单克隆抗体结合的抗体，生产的抗体可以用于以单克隆抗体为一抗的免疫检测试验试剂盒中的二抗。
基于上述杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体在制备用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品中的应用的发明构思，本发明在一个方面还提供了一种用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品。该产品中使用杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体作为与PCV2或PCV2的Cap蛋白特异性结合的物质，能够有效的检测出待测样本中的PCV2或PCV2的Cap蛋白。
可以理解的是，本发明不限制产品的具体形式，产品的形式可选地为试剂、试剂盒和试纸等本领域可接受的常规形式。所述产品中还可选的包括但不限于其他用于反应的试剂和耗材，例如可以包括但不限于缓冲液、二抗、阳性对照、阴性对照、标准品、标记物、反应底物、显色剂、检测试纸、离心管和支撑部件中的一种或多种。同时，本产品中的杂交瘤细胞株1A6或其分泌的单克隆抗体可以连接有本领域常规的功能成分，例如可以为但不限于为标记物、示踪物和磁性微粒中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中，所述产品包括用于实现如下(a)～(e)中至少一种试验的产品：(a)Western-Blot；(b)间接免疫荧光试验；(c)免疫组化试验；(d)中和试验；和(e)胶体金检测抗体试验。在一些可选的实施例中，所述产品为含有杂交瘤细胞株1A6分泌产生的单克隆抗体，例如以冻干粉的纯化物质形式存在或者以溶解于缓冲液中的形式存在的试剂，可以应用于Western-Blot、间接免疫荧光试验、免疫组化试验和中和试验等多种形式的免疫检测的试验中。
在一些可选的实施方式中，所述产品为用于免疫组化的试剂或试剂盒；其中单克隆抗体的稀释倍数不超过1:4000，优选单克隆抗体的稀释倍数为1:8000～1:4000，例如可以为但不限于为1:8000、1:7000、1:6000、1:5000或1:4000，1:4000，优选1:8000稀释浓度作为检测浓度。
在另一些可选的实施方式中，所述产品为胶体金检测试纸，所述胶体金检测试纸的检测区域包被杂交瘤细胞株1A6分泌产生的单克隆抗体。试验结果显示，样品进行连续稀释时，结果呈梯度下降，待检样品稀释至1000倍仍能被识别。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
杂交瘤细胞的制备
(1)小鼠免疫：利用纯化的PCV2病毒液为免疫原配制疫苗，皮下多点注射6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，剂量200μl/只，三至四次免疫：颈背部皮下多点注射。小鼠尾静脉采血用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选择效价高的小鼠在细胞融合前3天，腹腔注射200μl的PCV2纯化病毒液疫苗加强免疫。
(2)免疫小鼠血清效价的测定：原核表达的PCV2-rCap蛋白作为ELISA包被抗原检测免疫小鼠的血清抗体效价，并设立未免疫的小鼠血清为阴性对照。最后以P/N>2.1的最大血清稀释度为小鼠的血清效价。
(3)细胞融合：无菌采集免疫小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按一定比例进行混合，再用PEG4000按常规方法进行细胞融合。
(4)杂交瘤细胞筛选与克隆：分别用纯化的原核表达的PCV2-rCap蛋白和原核表达载体蛋白包被聚苯乙烯板，收取融合后10天的细胞培养上清进行间接ELISA筛选阳性细胞克隆。最后选则与PCV2反应为阳性，与原核表达载体蛋白反应为阴性的杂交瘤细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，经过2次亚克隆和间接ELISA筛选，得到1株针对PCV2-rCap蛋白的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A6。
实施例2
杂交瘤细胞制备单克隆抗体
(1)细胞培养法：将上述稳定分泌的杂交瘤细胞株1A6在含有20％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM高糖培养基中继续进行培养、传代，培养到25代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:1024以上，不同代次抗体效价的间接免疫荧光试验检测结果如表1所示。以上结果表明，本发明所得杂交瘤细胞株1A6能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗PCV2-rCap蛋白的单克隆抗体。
表1 1株杂交瘤细胞不同代次细胞上清液中PCV2抗体效价(IFA)测定结果
代次 抗体效价
F5 1:1024
F10 1:1024
F15 1:4096
F20 1:1024
F25 1:1024
(2)小鼠腹水制备：要获得效价较高且较多的抗体时多用此法。具体方法为：取6-8周龄健康雌性Balb/c小鼠5只，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只；7天后，每只小鼠腹腔接种1～2×106个/ml杂交瘤细胞。接种前，杂交瘤细胞弃掉培养液，用无血清的DMEM高糖培养基洗涤细胞两次，尽量洗去血清蛋白，吹散细胞并配成浓度为4～5×106个/ml的细胞悬液。无菌条件下，注射0.5ml细胞悬液入小鼠腹腔。杂交瘤细胞以腹水瘤的形式在小鼠腹腔内大量繁殖，7～10天后，小鼠腹部明显胀大，触之有波动感，且表现为精神萎靡、被毛凌乱的状态，此时即可收集腹水。采集腹水时，左手抓住小鼠颈背部皮肤、左后腿和尾巴，腹部朝向实验者，并使头部呈45度倾斜向下。用12号针头自腹股沟插入腹腔后，迅速使小鼠头部朝上和腹部向下，腹水自然流出而收集。过几天后，腹部再次胀大收集，一般可收集至少2次。腹水收集于离心管，4000r/min离心l0分钟，取中间无色透明层液体，即为腹水，采用间接免疫荧光试验分别测定不同腹水的抗体效价，计算结果为各小鼠腹水平均抗体效价(IFA)为1:65536。
实施例3
单克隆抗体的纯化，应用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，AKTA进行监测。
杂交瘤细胞的培养上清的处理：杂交瘤细胞的培养上清，在4℃，12000g条件下离心15分钟，以除去细胞碎片。
装柱：将1.5gProtein A干粉用6～7ml三蒸水溶解，再用0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡15分钟，然后装入层析柱中。
平衡：用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min，pH试纸测试流出液体的pH为7.4。
上样：取预处理过的腹水5ml，用上样缓冲液稀释至50ml，用0.45μm的滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。
洗脱：用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。随后用0.02M，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用AKTA进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，每收集3ml后，立即用1M，pH9.0的TRis-Hcl缓冲液调整pH值至7.0。
平衡：收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5～10倍柱床体积，流速调至1ml/min。再用三蒸水平衡10柱床体积。
杂交瘤细胞的培养上清、纯化的抗体取样进行蛋白电泳分析，结果结果如图1所示，图1显示纯化抗体只有2条条带50kDa的重链、25kDa的轻链，纯化效果较好。
实施例4
单克隆抗体的鉴定
(1)Western-blot鉴定单克隆抗体的反应性：采用4种不同的市售PCV2疫苗作为抗原，分别进行预处理后用SDS-PAGE分离，取一片含有目的条带的胶片置于转膜仪上，350mA条件下转膜1小时。将PVDF膜用5％脱脂奶室温封闭1小时。PBST洗3次之后，加入单克隆抗体作为一抗，4℃缓慢振荡反应过夜。PBST洗三次之后，用标记HRP的羊抗鼠IgG二抗(1:5000)室温孵育1小时，最后AEC显色，观察结果。Western-blot鉴定结果如图2所示。其中4种市售PCV2分别为：泳道1为猪圆环病毒1-2型嵌合体、支原体肺炎二联灭活疫苗(硕腾、瑞圆舒)；泳道2为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗(SH株和HN0613株)；泳道3为猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗(勃林格)；泳道4为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗(生泰尔、北京华夏)。泳道1、2中的疫苗抗原为PCV2全病毒，泳道3、4中的疫苗抗原为PCV2-rCap蛋白。
结果发现各泳道在约20～28kDa处均有目的条带，表明制备得到的单克隆抗体能够与PCV2病毒、PCV2-rCap蛋白发生特异性免疫反应。
(2)单抗与PCV2的间接免疫荧光试验：无PCVl污染的PK15细胞经胰酶消化后铺96孔细胞板，细胞长至80％左右融合度时，接种PCV2病毒液，37℃孵育1小时，加入2％DMEM继续培养，同时设立未接毒的PK-15细胞为对照。37℃继续培养72小时后，进行间接免疫荧光试验。预冷80％丙酮室温固定细胞10分钟，弃固定剂，置室温下干燥，PBST洗涤3次拍干，感染PCV2及正常的PK-15细胞孔分别加入杂交瘤细胞培养上清，同时设定SP2/0上清阴性对照，抗PCV2猪血清为阳性对照。37℃孵育1小时后，PBST洗涤3次拍干，加入羊抗小鼠的IgG-FITC，37℃均孵育2小时后，PBST洗涤3次拍干，荧光显微镜下观察结果。用倒置荧光显微镜观察可知，病毒与阳性血清、PCV2单克隆抗体发生特异性抗原抗体反应，加入荧光二抗后，视野下出现明显的特异性荧光，空白对照孔无荧光，结果如图3和图4所示。
(3)单抗中和活性测定：杂交瘤细胞上清分别与PCV2病毒液等量混合，置36～38℃含5％的二氧化碳培养箱中培养中和1小时后，然后加入含有4％血清的PK-15细胞悬液，每孔细胞为1×104个，每孔100μl，每个样品4重复。同时设正常细胞对照、病毒对照和阴性血清对照，置36～38℃含5％的二氧化碳培养箱中培养3日后，用免疫荧光法检测，结果如图5～图8所示。杂交瘤细胞上抗体中和孔和正常细胞对照孔细胞无特异性荧光出现。病毒对照和阴性血清对照孔在细胞的胞浆或胞核内可见到特异性荧光。
(4)单抗亚类鉴定：用the Pierce.Rapid ELISA Mouse mAb IsotypingKit鉴定单抗亚型。抗体重链约为50kDa，轻链约为25kDa。单抗属于IgG2a亚类，轻链为к型。
实施例5
猪圆环病毒2型抗原的免疫组化检测方法
(1)脱蜡和水化：二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟。将玻片依次按100％酒精Ⅰ、100％乙醇Ⅱ、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇顺序浸洗，每缸2分钟，最后浸入去离子水中5分钟。
(2)阻断：将染色架浸入3％H2O2溶液30分钟，以阻断内源性过氧化物酶。染色架置于PBS中浸洗3次，每次5分钟。
(3)抗原热修复：将玻片浸入盛有1L柠檬酸缓冲液的烧杯中，放入微波炉中加热。使之维持沸腾5分钟，再调小微波炉火力使之保温20分钟。烧杯取出后放在实验台上自然冷却至室温。之后将玻片在PBS中浸洗3次，每次5分钟。
(4)封闭：将玻片放入底部盛有水的湿盒中，擦去组织周围液体，用免疫组化笔在组织周围画一圈包围组织，在圈中滴加5％BSA溶液覆满组织，室温作用30分钟，以封闭非特异性抗原。
(5)一抗孵育：甩去玻片上液体，将猪圆环病毒2型单克隆抗体用1％PBA稀释，滴加覆盖整个组织，避光4℃孵育过夜。次日早晨去掉一抗溶液，PBS洗3次，每次5分钟。
(6)生物素化山羊抗小鼠IgG孵育：每张切片上滴加生物素化山羊抗小鼠IgG覆满组织，室温避光孵育30分钟。
(7)滴加SABC：去掉二抗，PBS洗3次，每次5分钟；之后滴加SABC覆满组织，室温作用2分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
(8)显色：依显色试剂盒配方制好显色液滴加覆满各个组织，室温避光显色。之后将玻片浸入去离子水中2次，每次5分钟。
(9)苏木素复染：浸入苏木素染液染色，取出在自来水中浸洗，之后放入去离子水中浸泡5分钟。
(10)分化：将玻片浸入盐酸酒精(浓盐酸200倍稀释于75％乙醇中)中2秒立刻取出，玻片放入烧杯中，在自来水下细流冲洗10分钟。
(11)脱水、透明：70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％酒精Ⅰ、100％乙醇Ⅱ每缸2分钟，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ每次5分钟。
(12)封片：中性树脂滴加在组织上，盖上盖玻片，赶出气泡，37℃过夜烘片，次日镜检。
(13)判定：在显微镜视野中，在胞浆内观察到有棕黄色着色为PCV2抗原阳性反应；未观察到有棕黄色着色为PCV2抗原阴性反应。
试验猪剖检后取腹股沟淋巴结固定后样品进行免疫组化检测，结果显示PCV2单克隆抗体各浓度阳性样品猪腹股沟淋巴结PCV2抗原为阳性感染细胞呈棕黄色着色，1:4000以上稀释浓度背景色深，优选1:8000稀释浓度作为检测浓度；阴性对照猪腹股沟淋巴结PCV2抗原均为阴性，详见附图9、图10、图11、图12和图13。
实施例6
猪圆环病毒2型抗原的胶体金检测试纸
(1)胶体金制备：用氯金酸溶液搅拌加热，同时加入柠檬酸三钠溶液，颜色为橙红色时继续加热15分钟左右，冷却至室温调整pH至6.5定容，保存于棕色瓶中。
(2)胶体金标记：将实施例2中制备得到的单克隆抗体加入胶体金溶液中反应，后加入BSA，室温反应数分钟。离心收集沉淀，用BSA缓冲液重悬，恢复至原体积再离心。
(3)金标垫的制备：将标记好的金标复合物喷洒在玻璃纤维素上，在烘箱中烘干。
(4)样品垫的制备：将样品垫处理液涂在玻璃纤维素上，在烘箱中烘干。
(5)印模制备：将玻璃纤维素贴在PVC地板上，将印模机的T、C线调整搭配合适的距离，然后进行印模，在烘箱中烘干。
(6)组板：将吸水垫、制备好金垫、样品垫裁切至合适宽度，与印好的T、C线玻璃纤维素膜贴在PVC地板位置。
(7)切条：根据检测卡槽的宽度，将组装好的大板切成一定宽度的检测条，检测条压入卡壳内。
(8)检测：使用前放置室温回温30分钟，根据需要稀释样品，滴加样品反应20分钟。结果观察：若测试卡的C线显示试验成立，T线显示有猪圆环病毒2型抗原。
结果如图14所示：样品进行连续稀释时，结果呈梯度下降，待检样品稀释至1000倍仍能被识别，T线仍然显示有猪圆环病毒2型抗原条带。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株1A6，保藏编号为：CCTCC NO:C2022151。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A6分泌产生的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A6或权利要求2所述的单克隆抗体在非诊断和治疗目的的检测PCV2或PCV2的Cap蛋白中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括采用如下(a)～(e)中至少一种方法检测PCV2或PCV2的Cap蛋白：
(a)Western-Blot；
(b)间接免疫荧光试验；
(c)免疫组化试验；
(d)中和试验；
(e)胶体金检测抗体试验。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A6或权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括用于实现如下(a)～(e)中至少一种试验的产品；
(a)Western-Blot；
(b)间接免疫荧光试验；
(c)免疫组化试验；
(d)中和试验；
(e)胶体金检测抗体试验。
7.用于检测PCV2或PCV2的Cap蛋白的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A6或权利要求2所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括用于实现如下(a)～(e)中至少一种试验的产品；
(a)Western-Blot；
(b)间接免疫荧光试验；
(c)免疫组化试验；
(d)中和试验；
(e)胶体金检测抗体试验。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为用于免疫组化的试剂或试剂盒；所述单克隆抗体的稀释倍数不超过1:4000；
优选地，所述单克隆抗体的稀释倍数为1:8000～1:4000；
优选地，所述单克隆抗体的稀释倍数为1:8000。
10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为胶体金检测试纸，所述胶体金检测试纸的检测区域包被权利要求2所述的单克隆抗体。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184016A1 (en) * 2007-06-22 2010-07-22 David Jacques Gerard Lefebvre Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection
CN103695376A (zh) * 2013-11-13 2014-04-02 南京农业大学 分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株
CN103969451A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
CN104498439A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 湖南农业大学 杂交瘤细胞、pcv2单克隆抗体及其应用
CN105223359A (zh) * 2015-04-13 2016-01-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒
CN105445457A (zh) * 2015-03-24 2016-03-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒
CN105542000A (zh) * 2016-01-05 2016-05-04 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种单克隆抗体及其应用
CN107037212A (zh) * 2017-04-20 2017-08-11 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒
CN108761098A (zh) * 2018-08-22 2018-11-06 河南中泽生物工程有限公司 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法
RU2695330C1 (ru) * 2018-06-19 2019-07-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Способ диагностики цирковирусной инфекции свиней второго типа прямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител
CN110687302A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 浙江省医学科学院 猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金快速检测试纸条及方法
CN113355292A (zh) * 2021-06-04 2021-09-07 天康制药(苏州)有限公司 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184016A1 (en) * 2007-06-22 2010-07-22 David Jacques Gerard Lefebvre Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection
CN103695376A (zh) * 2013-11-13 2014-04-02 南京农业大学 分泌猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株
CN103969451A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
CN104498439A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 湖南农业大学 杂交瘤细胞、pcv2单克隆抗体及其应用
CN105445457A (zh) * 2015-03-24 2016-03-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒
CN105223359A (zh) * 2015-04-13 2016-01-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒
CN105542000A (zh) * 2016-01-05 2016-05-04 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 一种单克隆抗体及其应用
CN107037212A (zh) * 2017-04-20 2017-08-11 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒
RU2695330C1 (ru) * 2018-06-19 2019-07-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Способ диагностики цирковирусной инфекции свиней второго типа прямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител
CN108761098A (zh) * 2018-08-22 2018-11-06 河南中泽生物工程有限公司 致病性猪圆环病毒双联抗原快速检测试纸及其制备方法
CN110687302A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 浙江省医学科学院 猪圆环病毒2型抗原或抗体胶体金快速检测试纸条及方法
CN113355292A (zh) * 2021-06-04 2021-09-07 天康制药(苏州)有限公司 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HWI WON SEO 等: "Evaluation of commercial polyclonal- and monoclonal-antibody-based immunohistochemical tests for 2 genotypes of Porcine circovirus type 2 and comparison with in-situ hybridization assays", CAN J VET RES, vol. 78, no. 3, pages 233 *
YANLI GU 等: "Development of a Monoclonal Antibody Against Porcine Circovirus2 Cap Protein", MONOCLON ANTIB IMMUNOTHER, vol. 35, no. 4, pages 227 - 230 *
李海忠;符芳;张永欣;李曦;宋淑萍;: "Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定", 黑龙江畜牧兽医, no. 05, pages 125 - 127 *
翟淑燕: "猪圆环病毒2型单克隆抗体研制与夹心ELISA抗原检测方法的建立", 中国优秀硕士学位论文数据库电子期刊农业科技辑, no. 3, pages 1 - 2 *

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Publication number Publication date
CN114958776B (zh) 2024-02-06

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