CN105542000A - 一种单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单克隆抗体及其应用,所述单克隆抗体为抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11,主要用于含该单克隆抗体3H11的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒、抗原检测试剂盒、药物组合物,属于生物医药领域。本发明提供抗体检测试剂盒可区分PCV1和PCV2的感染,以便对猪群的免疫状况进行实时监测,为防止PCV2感染起到重要作用;抗原检测试剂盒可实现检测样品中的PCV2抗原,减少了假阳性率,对控制PCV2的感染具有重要意义。本发明的单克隆抗体3H11对猪圆环病毒病具有预防和/或治疗作用,弥补现有疫苗单一的预防作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗猪圆环病毒2型单克隆抗体、含该单克隆抗体的药物组合物、抗体检测试剂盒、抗原检测试剂盒等应用,属于生物医药领域。
背景技术
猪圆环病毒(Circoviridae,Circovirus,Porcinecircovirus,PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒,病毒直径约17nm,环状,单股DNA病毒,具有两个血清型即PCV1和PCV2。其中,PCV1没有致病性;PCV2具有致病性,可引发一系列猪圆环病毒病(PorcineCircovirusdiseases,PCVD)包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystcmicWastingSyndrome,PMWS)、仔猪A2型先天震颤(A2CT)、猪繁殖障碍、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)和呼吸道疾病综合征(PRDS),特别是PMWS的主要病原。PMWS主要侵害6-8周龄的仔猪,发病率一般为10%-20%,病死率高达50%-100%,并能造成免疫抑制降低抗病力;成年猪一般为隐性感染,不表现任何症状,但可以传染给仔猪。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展,给许多国家和地区带来了巨大的损失。
目前,PCV2抗体的检测方法包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA),但IPMA、IFA不能区分PCV1和PCV2的抗原交叉反应,且操作复杂,耗时耗力;现有ELISA试剂盒包括国外试剂盒(荷兰Biochek公司的PCV2ELISASK105、韩国金诺公司的PCV2ELISA)和国内试剂盒(以间接ELISA抗体检测试剂盒为主,如中国动物卫生与流行病学中心的PCV2ELISA抗体检测试剂盒、浙江大学的PCV2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒),这些试剂盒均不能区分PCV1交叉抗体的问题。
临床上,PCV1与PCV2经常混合感染,虽然PCV1不会引起发病,但会交叉干扰PCV2感染的检测。免疫学试验表明,PCV1病毒与PCV2病毒有明显发交叉反应。因此,检测PCV2感染的关键技术在于如何尽可能地排除PCV1的干扰,减少假阳性结果。鉴于此,为了更为准确地检测PCV2,亟需建立一种检测方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型单克隆抗体及其应用,该单克隆抗体可用于检测猪圆环病毒2型抗体、抗原,还可以预防和/或治疗猪圆环病毒病。
本发明涉及一种特异性结合猪圆环病毒2型的单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列,其中,1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段,所述抗体或其片段仍保持特异性结合猪圆环病毒2型的能力。
本发明还涉及一种药物组合物,所述药物组合物包括免疫量的含有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的抗体或所述抗体片段,以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾病的药物中的应用。
本发明还涉及一种抗体检测试剂盒,所述抗体检测试剂盒包括有效量的具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体片段,猪圆环病毒2型抗原,以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述单克隆抗体PCV2-McAB1为2F8或3G12。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照,其中,所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物,所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所述抗原检测试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1),所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上吸附有干燥的酶底物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体PCV2-McAB2上标记的酶产生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体PCV2-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1;其中,所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括一条检测线(6)、一条质控线(7),其中,所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗,且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PCV2-McAB1而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元,底物供应区,样品供应区,检测区以及吸水垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端;以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所述抗原检测试剂盒包括胶体金检测试纸条,所述胶体金检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所抗原检测述试剂盒包括荧光免疫检测试纸条,所述荧光免疫检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次由滤纸、样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与荧光垫接触或与样品垫、荧光垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述荧光垫上含有荧光标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环病毒2型抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McAB1与PCV2-McAB2的混合反应液。
本发明还涉及所述抗原检测试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测中的应用。
本发明的有益效果:含本发明单克隆抗体PCV2-McAB2的抗体检测试剂盒不与PCV1抗体交叉反应,降低了假阳性检出率,同时相对于IPMA、IFA等需要花费4-5天的检测方法,该检测方法花费2小时,缩短了检测时间;含本发明单克隆抗体PCV2-McAB2的抗原检测试剂盒可用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测中的应用,减少了假阳性结果;含本发明的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的药物组合物可解决母源抗体不足时所引发的猪圆环病毒感染的问题,可弥补现有疫苗预防效果不能达到100%的缺陷,解决了现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪圆环病毒2型感染问题;单克隆抗体PCV2-McAB2具有中和病毒的活性,能够用于相关联苗的鉴别检验。
附图说明
图1为单克隆抗体3H11的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图,其中泳道M为蛋白Marker;泳道1、2均为单克隆抗体3H11,包括上端的重链和下端的轻链。
图2为酶免疫层析检测试纸条的侧面示意图,图中:1-硝酸纤维素膜,2-酶标垫,3-底物垫,4-吸水垫,5-展开液垫,6-检测线,7-质控线,8-底物缓冲液槽,9-底物缓冲液,10-支撑物,11-检测样品。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体,即组成该群体的抗体个体都相同,除了可能存在少量可能的自发突变。因此,修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地,所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物,也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子,因而,这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物,也包括含有抗原结合结构域的任何多肽,无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG,IgE,IgM,IgD和IgA)及其亚型亚类;也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰,可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区,参见EP.A.184187,GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变,这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得,因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段,如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到,因而也可用重组DNA方法,可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞,然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体,称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区,轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽,其长度为110至125个氨基酸,其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样,术语“轻链可变区”是指一种多肽,其长度为95至115个氨基酸,其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓,在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上,可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰,获得保守性变异体,而仍能够保持与猪圆环病毒2型特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性,如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地,多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽,但是差异是有限的,以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似,并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如:一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码,也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生,或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
术语“基因工程抗体”均能够通过基因工程的方法由适当的宿主细胞表达。本发明可使用多种表达宿主细胞,如原核宿主细胞,包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株;真核宿主,包括但不限于曲霉属、酵母菌等的菌株,以及哺乳动物细胞、植物细胞等。本发明并不局限于具体的表达载体和表达宿主,只要其能够表达本发明所述的基因工程抗体,其保守性变异体。
术语“中和活性”是指中和抗体具有中和病毒的作用,其中“中和抗体”在本文以最广义使用,指的是抑制猪圆环病毒2型重复感染靶细胞的任何抗体,而不管实现中和的机制。因而,举例来说,可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和,例如通过设计抗体,所述抗体直接结合到,或者接近于,负责病毒附着或粘附的位点,还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和,其导致病毒体的聚集,可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合,通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等,进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。
本发明涉及一种特异性结合猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列,其中,1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种由所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体,和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体;所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体;其中,所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段;所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪圆环病毒2型的能力。
作为本发明的一种实施方式,所述抗体为单克隆抗体PCV2-McAB2,所述单克隆抗体PCV2-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.2,和/或轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.4。
所述单克隆抗体PCV2-McAB2为抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11,其相对亲和力常数为7.81ng/ml,也就是说,所述单克隆抗体3H11与抗原的抗原决定簇的结合强度适中;所述单克隆抗体3H11的中和抗体效价大于1:512,也就是说所述单克隆抗体3H11具有良好的中和活性,可抑制猪圆环病毒2型重复感染靶细胞。
术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时,是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓,所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同,结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范,本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”;当理解为“治疗有效量”时,是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓,所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程,临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。
术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。
本发明还涉及一种药物组合物,所述药物组合物包括免疫量的具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段,以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区制备的单链抗体,以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体,以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式,所述药物组合物经肌肉注射或腹腔注射给药。
作为本发明的一种实施方式,所述药物组合物包括但不限于粉末剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。
术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒2型感染时是指抑制猪圆环病毒2型的复制、抑制猪圆环病毒2型的传播或防止猪圆环病毒2型在其宿主体内定居,以及减轻猪圆环病毒2型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加,那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物,如猪。
本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的药物组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区制备的单链抗体在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾病的药物中的应用。
术语“有效量”当理解为“诊断有效量”时,是指能够利用本发明所述单克隆抗体有效检测样品中是否存在猪圆环病毒2型的量。根据已知的免疫化学检测方法,本领域技术人员能够知晓,所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方法的不同而不同,根据公知文献的教导,本领域技术人员知晓如何选择适当的本发明所述单克隆抗体用量,以用于诊断样品中是否存在猪圆环病毒2型。本领域技术人员知晓,适当地该试剂盒中还应当包括适当的载体,缓冲液/剂,和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。
术语“酶”是包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任一种。
术语“缓冲液”包括“磷酸盐缓冲液”,是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液,是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地,磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐,例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用,缓冲的pH值范围很宽,例如约pH4至约pH10的范围,优选约pH5至pH9的范围,更优选约pH6至约pH8的范围,最优选约pH7.4。进一步优选地,所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
本发明还涉及一种抗体检测试剂盒,所述抗体检测试剂盒包括有效量的具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段,猪圆环病毒2型抗原,以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段使用酶标记,所述用于和猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。
作为本发明的一种实施方式,所述抗体检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,猪圆环病毒2型抗原,以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明还涉及所述抗体检测试剂盒检测样品中猪圆环病毒2型抗体的方法,所述方法:1)将检测样品与酶标记的所述抗体或所述抗体片段共同加入包被PCV2抗原的检测孔,2)检测酶标记的所述抗体或所述抗体片段与检测样品中的猪圆环病毒2型抗体共同竞争结合包被的PCV2抗原;其中,所述步骤1)中PCV2抗原附着在支持介质上,所述支持介质优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种;其中,所述方法步骤2)中所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定;优选地,所述步骤1)、2)中的所述抗体或所述抗体片段为所述单克隆抗体PCV2-McAB2。
本发明还涉及所述抗体检测试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗体检测中的应用。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
术语“抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1”包括2F8(由保藏号为CCTCCNO:C2014199的小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株分泌产生),3G12(由保藏号为CCTCCNO:C2014198的小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株分泌产生),C4D2、E3D4(边少国.猪圆环病毒II型特异性单克隆抗体的研究.吉林农业大学硕士学位论文,2007),3B2F4、9C3D2(陈美玲.抗猪圆环病毒II型ORF2蛋白单克隆抗体的制备鉴定及I型ORF2基因的研究.华中农业大学硕士学位,2005),B69(中国专利CN104498439A),3E5(中国专利CN102465116A),2E9(王琳琳,陈长春,徐婷婷等.猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用.江苏农业科学,2013,41(7):30-31)等。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述单克隆抗体PCV2-McAB1选自下列抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9;其中,所述单克隆抗体PCV2-McAB1为2F8或3G12。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物,所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述单克隆抗体PCV2-McAB1选自下列抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9;其中,所述单克隆抗体PCV2-McAB1为2F8或3G12。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所述抗原检测试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1),所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上吸附有干燥的酶底物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体PCV2-McAB2上标记的酶产生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体PCV2-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1;其中,所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括一条检测线(6)、一条质控线(7),其中,所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗,且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PCV2-McAB1而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元,底物供应区,样品供应区,检测区以及吸水垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端;以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒中的所述酶免疫层析检测试纸条包括固相的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10,其中2属于样品供应区,3属于底物供应区,5、8属于缓冲液供应单元,6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。所述检测试纸条固定在塑料外壳中,其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段;吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端,且与硝酸纤维素膜1有重叠;酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段,上面干燥有酶标记的所述单克隆抗体2;底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端,其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3,且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔纸,以防止底物缓冲液9渗漏,其上有缓冲液按钮,按下缓冲液按钮可刺破铝箔纸,并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸纤维素膜1的中上端,其上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端、检测线6的上游,其上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所述抗原检测试剂盒包括胶体金检测试纸条,所述胶体金检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所抗原检测述试剂盒包括荧光免疫检测试纸条,所述荧光免疫检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次由滤纸、样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与荧光垫接触或与样品垫、荧光垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述荧光垫上含有荧光标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
本发明还涉及一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环病毒2型抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McAB1与PCV2-McAB2的混合反应液。
作为本发明的一种实施方式,所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,所述洗涤液为磷酸盐缓冲液,所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液,所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液,所述终止液为2mol/l的浓H2SO4溶液,所述阴性对照为磷酸盐缓冲液,所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪圆环病毒2型的溶液。
本发明涉及一种抗原检测试剂盒,所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环病毒2型抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、酶标记的羊抗鼠二抗、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McAB1与PCV2-McAB2的混合反应液;其中,所述洗涤液为磷酸盐缓冲液,所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液,所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液,所述终止液为2mol/l的浓H2SO4溶液,所述阴性对照为磷酸盐缓冲液,所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪圆环病毒2型的溶液。
术语“检测样品”当用于抗体检测试剂盒时包括但不限于动物或患者的血清及组织样品、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。
术语“方法”可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、胶体金检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法及类似检测方法。
术语“检测样品”当用于抗原检测试剂盒时包括但不限于动物或患者的血清、脏器研磨液、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。
本发明还涉及所述抗原检测试剂盒检测样品中猪圆环病毒2型的方法,所述方法包括:a将检测样品与具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段,和/或所述单克隆抗体PCV2-McAB1进行接触,b检测所述抗体或抗体片段,和/或所述单克隆抗体PCV2-McAB1与检测样品中猪圆环病毒2型的反应;其中,所述步骤a中的所述抗体或所述抗体片段,或所述单克隆抗体PCV2-McAB1附着在支持介质上,所述支持介质优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝化纤维素膜中的任一种;其中,所述步骤b中所述反应可通过酶显色、荧光、胶体金、化学发光中的任一种方法进行测定。
作为本发明的一种实施方式,具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段使用酶标记,所述用于和猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物。
作为本发明的一种实施方式,所述用于和猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物。
作为本发明的一种实施方式,所述方法包括:将采集的微生物拭子插入到样品处理管中,使样品尽可能溶解在溶液中,将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心,10分钟后判定结果,结果判定标准为:质控线显色则试验成立,检测线显色即为阳性、不显色即为阴性;质控线未显色则试验不成立,无论检测线是否显色均判定为无效结果,需重测。
作为本发明的一种实施方式,所述方法包括:使用样品处理管预处理样品,将所述预处理样品加入所述酶免疫层析检测试纸条中所述酶标垫的位置,按下缓冲液按钮,30分钟后观察结果,结果判定标准为:质控线显色则试验成立,检测线显色即为阳性、不显色即为阴性;质控线未显色则试验不成立,无论检测线是否显色均判定为无效结果,需重测。
作为本发明的一种实施方式,所述方法包括:使用样品处理管预处理样品,将所述预处理样品加入所述荧光免疫检测试纸条中所述酶标垫的位置,按下缓冲液按钮,5分钟后观察结果,结果判定标准为:质控线显色则试验成立,检测线显色即为阳性、不显色即为阴性;质控线未显色则试验不成立,无论检测线是否显色均判定为无效结果,需重测。
作为本发明的一种实施方式,所述方法包括:将包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板用封闭液进行封闭,用洗涤液进行洗涤;使用样品处理管预处理样品,将所述预处理样品于稀释液中稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应,同时做阳性对照、阴性对照,于反应后洗涤;加入稀释的酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2,于37℃作用40-80min反应后洗涤;加入底物显色液,于37℃反应10min后加入终止液;用酶标仪读取数据,对结果进行判定。
作为本发明的一种实施方式,所述方法包括:将包被猪圆环病毒2型抗原的ELISA板用封闭液进行封闭,同时做阴性对照、阳性对照,并用洗涤液进行洗涤;使用样品处理管预处理样品,将所述预处理样品于稀释液中进行稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应,并用已知浓度的猪圆环病毒2型抗原进行梯度稀释后加入ELISA反应孔中进行检测反应,于反应后洗涤;将含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液,或含所述单克隆抗体PCV2-McAB1和所述单克隆抗体PCV2-McAB2混合的反应液,稀释后加入ELISA反应孔,于37℃反应20-40min,洗涤,同时设空白对照;将酶标记的羊抗鼠二抗稀释后加入ELISA反应孔中,于37℃反应20-40min,洗涤;加入底物显色液,于37℃反应10min后加入终止液;用酶标仪读取数据,对结果进行判定。
本发明涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1的试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和有效量的单克隆抗体PCV2-McAB2的试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型检测中的应用。
作为本发明的一种实施方式,本发明提供了使用本发明的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和所述单克隆抗体PCV2-McAB2进行夹心法检测的试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型检测中的应用。
本发明还涉及所述抗原检测试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测中的应用;所述非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测以及定性和定量鉴别检验含猪圆环病毒2型和其他抗原的疫苗组合物中的猪圆环病毒2型抗原的检测。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12由小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,Strain3G12)分泌产生,其中小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株的保藏号为CCTCCNO:C2014198,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏日期为2014年11月3日。
本发明中抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8由小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株(Hybridoma-Balb/cmousespleencellsandSp2/0,strain2F8)分泌产生,其中小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株的保藏号为CCTCCNO:C2014199,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏日期为2014年11月3日。
本发明实施例中猪圆环病毒2型PCV2SH株已经在专利申请CN101240264A中公开,猪圆环病毒1型PCV1G株已经在专利申请CN101423836A中公开。
本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS,其1L体积配方为:NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.24g,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
1.1PCV2Cap全蛋白的制备、纯化及含量测定
根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪圆环病毒2型PCV2-Nanjing株(登录号为KF524259.1)中Cap全蛋白的基因序列设计引物对Cap-F:5'CATATGATGACGTATCCAAGGAGGC3',Cap-R:5'CTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGT3'。按李廷栋(李廷栋,轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装,2009)文献的操作方法原核表达PCV2Cap全蛋白,并通过离子交换层析方法进行纯化,使用12%SDS-PAGE进行蛋白电泳鉴定,结果:所获蛋白分子量与预期相符。将纯化后的蛋白样品在1×PBS(pH7.4)中透析过夜,透析后样品按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量,结果表明PCV2-Cap全蛋白2的浓度为2mg/ml。
1.2单克隆抗体2F8、3G12、3H11的制备和纯化
将0.5mlPCV2-Cap全蛋白与等量的弗氏佐剂经充分乳化后免疫与所用骨髓瘤细胞同源的6-8周龄BALB/c健康小鼠2只,每只皮下多点注射乳化后的猪圆环病毒2型Cap全蛋白300μl,间隔2周加强一次,加强免疫使用弗氏不完全佐剂;用间接ELISA法测定其抗血清,血清效价达到1:20000后方可融合。
间接ELISA方法包括:包被,以20mmol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液将猪圆环病毒2型Cap全蛋白1:4000V/V稀释,包被96孔聚乙烯板,然后用洗涤液洗涤,拍干后,在4℃下真空抽干,其中聚乙烯板包被规格为200μl/孔,洗涤采用0.05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3次;封闭,每孔加入pH为7.4内含10%(V/V)小牛血清的磷酸盐缓冲液200μl,在37℃下封闭2小时,然后洗涤1次;加样,每板设阴性对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白对照,每孔加入第三次免疫后的第3天的1:5000(V/V)稀释后小鼠外周血清50μl,在37℃下孵育1小时,洗涤3次,每孔加入酶标羊抗鼠二抗100μl,在37℃下孵育1小时,洗涤3次;显色,每孔加入底物显色液A和底物显色液B的混合液100μl,室温下反应15分钟,然后使用终止液终止反应;比色,以空白调零,经酶标仪在波长450nm处读取光密度值;结果判断,P/N=测定标本OD均值/阴性血清OD均值,P/N≥2.1为阳性。
分离脾细胞:取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞,铺96孔培养板,将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为2×107个/毫升细胞悬液,分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液。
细胞融合:将处于对数期的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按细胞数10:1比例混合,加入PEG-1500使细胞彼此融合,在两种细胞的混合细胞悬液中,第1分钟滴加4.5ml培养液;间隔2分钟滴加5ml培养液,然后加培养液50ml,以HAT选择培养基按36%的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。
筛选杂交瘤细胞:待融合的细胞培养至第7天时,即细胞培养至覆盖10%孔底时,吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA法检测抗体含量,经有限稀释进行三次亚克隆筛选,依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株,扩大培养,并将高效价、高特异性的细胞株冻存。最终筛选出三株小鼠骨髓杂交瘤细胞株。
腹水的制备、纯化:选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用液体石蜡对小鼠腹腔注射,两周后将5×105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中,在接种一周后收集小鼠的腹水,每只小鼠可收集5ml的腹水,使用AKTA蛋白纯化仪及DE-52离子交换柱将小鼠IgG单克隆抗体腹水纯化。
最终获得3株小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8、3G12、3H11株,其中小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株的保藏号为CCTCCNO:C2014199,其分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8;小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株的保藏号为CCTCCNO:C2014198,其分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12;小鼠骨髓杂交瘤细胞3H11株分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11。
1.3单克隆抗体2F8、3G12、3H11类型和亚类的鉴定
将单克隆抗体的细胞培养上清分别加入包被有抗鼠重链或轻链抗体的酶标板,50μl/孔,每个样品加8孔。按照KoenigR.(KoenigR.IndirectELISAmethodsforthebroadspecificitydetectionofplantviruses(J).JournalofGeneralVirology,1981,55(1):53-62)文献中的间接ELISA法,每孔分别加入稀释的HRP-山羊抗鼠IgM(HRP-IgM)、HRP-山羊抗鼠IgG1(HRP-IgG1)、HRP-山羊抗鼠IgG2a(HRP-IgG2a)、HRP-山羊抗鼠IgG2b(HRP-IgG2b)和HRP-山羊抗鼠IgG3(HRP-IgG3)抗体酶标二抗,结果见表1。
表1各单克隆抗体类型的鉴定
抗体类型 | HRP-IgM | HRP-IgG1 | HRP-IgG2a | HRP-IgG2b | HRP-IgG3 | 重链亚型 |
2F8 | - | - | + | - | - | IgG2a |
3G12 | - | - | - | + | - | IgG2b |
3H11 | - | - | + | - | - | IgG2a |
注:+表示阳性,-表示阴性。
由表1可知,单克隆抗体2F8、3H11的亚类为IgG2a,单克隆抗体3G12的亚类为IgG2b。
1.4单克隆抗体2F8、3G12、3H11特异性的鉴定
将纯化的单克隆抗体分别加入猪圆环病毒2型PCV2SH株、猪圆环病毒1型PCV1、猪瘟病毒CSFVC株、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSVJXA1-R株、猪伪狂犬病病毒PRVBarthaK-61株、猪细小病毒PPVWH-1株感染的细胞,固定后,加入FITC标记的羊抗鼠二抗,置荧光显微镜观察。测定单克隆抗体3H11与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV是否具有交叉反应性。结果:单克隆抗体2F8、3G12、3H11与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV接种细胞均未出现特异性荧光,无交叉反应;而与PCV2接种细胞在细胞核及细胞质部位出现特异性荧光着染。表明:这三株单克隆抗体均是抗圆环病毒2型的特异性单克隆抗体。
1.5单克隆抗体2F8、3G12亲和力常数Kd的测定
按照郭杰标(郭杰标等,以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究,南方医科大学学报,2006,26(7):1057-1059)文献中的竞争ELISA方法进行,分别测定单克隆抗体2F8、3G12的OD450值以计算各个反应溶液的抗原结合率,并计算亲和力常数。分别计算单克隆抗体2F8、3G12的抗原结合率B/(1-抗原结合率B),然后作图求得斜率(亲和力常数)分别为4.10×10-12mol/l和3.65×10-12mol/l。
1.6单克隆抗体3H11相对亲和力的测定
将单克隆抗体3H11按照宋帅等(宋帅,林彤,邵军军,常惠芸.抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学,2009,25(4):333-335)中的操作方法测定其相对亲和力。其中抗原的包被浓度为2μg/ml,酶标二抗的稀释度为1:10000,测定纯化后的单克隆抗体3H11的相对亲和力。结果:单克隆抗体3H11的相对亲和力为7.81ng/ml。
1.7纯化单克隆抗体2F8、3G12、3H11的检验
外观检验:室温下,肉眼观察可见纯化的单克隆抗体2F8、3G12、3H11呈无色澄清状态,均未见絮状物沉淀。
无菌试验:按二〇一〇年版《中国兽药典》附录42进行检验,结果表明:纯化后单克隆抗体2F8、3G12、3H11均无菌。
1.8单克隆抗体2F8、3G12、3H11的纯度
对纯化后的单抗进行纯度的检测,使用12%SDS-PAGE蛋白电泳法,每泳道的上样量为10μg,检测结果表明:单克隆抗体2F8、3G12的纯度均不低于80%,单克隆抗体3H11的纯度不低于90%。
1.9单克隆抗体2F8、3G12、3H11效价的测定
按照实施例1.2测定单克隆抗体2F8、3G12的ELISA效价,结果分别为1:40000、1:45000。按刘长明等(刘长明,张超范,危艳武.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研究与应用.中国预防兽医学报,2007,29(8):621-624)的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法进行效价测定,单克隆抗体2F8、3G12、3H11的IPMA效价均不低于1:10240。
1.10单克隆抗体2F8、3G12、3H11含量的测定
用BCA蛋白定量试剂盒(购自Pierce公司)按照说明书对纯化后单克隆抗体2F8、3G12、3H11分别进行定量分析,测定结果表明:单克隆抗体2F8、3G12、3H11的蛋白含量分别为2.80、3.20、3.25mg/ml。
1.11单克隆抗体3H11中和活性的测定
将单克隆抗体3H11用PBS作10倍系列稀释,将各稀释度单克隆抗体与200TCID50的PCV2SH株于37℃作用2小时,分别接种长满单层的PK-15细胞,每个稀释度接种3孔,37℃、5%CO2下培养72h,试验中设立阳性对照和阴性对照。用IPMA方法检测,每孔选择5个视野,记录每个视野中的阳性细胞数,以相对于未中和的阳性对照,待检孔中阳性细胞数减少大于90%判为有中和能力。以能中和病毒的单克隆抗体的最高稀释倍数作为单抗的中和效价。结果,单克隆抗体3H11中和抗体效价不低于1:104.5。
1.12单克隆抗体3H11可变区序列的测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征,设计重链可变区引物序列:
P1:5’-GTGAAGCTGGTGGAGTCTGG-3’
P2:5’-TGCAGAGACAGTGACCTGAG-3’
设计轻链可变区引物序列:
P3:5’-TCAGTCTCCAGCCTCCCTAT-3’
P4:5’-TTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3’
按照张爱华等(张爱华,闭兰,王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志,2001,15(2):65-68)建立的可变区序列测定方法,通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体3H11的可变区序列,选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。测定单克隆抗体3H11的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.3所示,由其推导的氨基酸序列分别为SEQIDNo.2、SEQIDNo.4。
1.13酶标单克隆抗体3H11的制备
参照王丽敏等(王丽敏,杨香林,候成才等.猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用,中国兽医学报,2014,34(10):1584-1588)所述方法,将辣根过氧化酶标记单克隆抗体3H11,标记后单克隆抗体为澄清溶液,无絮状物,克分子比值为1.625。
实施例2猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的制备、质量研究及应用
2.1抗体检测试剂盒的制备
取实施例1制备的猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,用PB溶液(0.02mol/L,pH值7.4)稀释为2.0μg/ml,2~8℃包被酶标板过夜,弃包被液。每孔加入200μl含20%小牛血清的PB溶液(0.02mol/L,pH值7.4),37℃封闭2小时,弃去封闭液。将酶标板置25~37℃干燥16~24小时后,逐一装入铝箔袋中,同时放入一袋干燥剂,装袋热封。将酶标板、阳性对照、阴性对照、酶标单克隆抗体、浓缩洗涤液、显色剂A液、显色剂B液、终止液进行组装。检测时,分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照各50μl,然后每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外,轻轻振荡混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤5遍,最后一次尽量扣干。每孔加入显色剂A、B液各50μl,轻轻振荡混匀,37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl,轻轻振荡混匀,10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处,用空白孔调零点后测定各孔吸光光度值,即A值。计算待测样品的阻断率=【(阴性对照A均值-样品A值)/阴性对照A均值】×100%,若待测样品阻断率≤60%者为PCV2抗体阴性,若待测样品阻断率≥70%者为PCV2抗体阳性,若待测样品阻断率在60%~70%之间,结果判为可疑。
2.2抗体检测试剂盒的质量研究
灵敏度检验:将IPMA效价为1∶3200的猪圆环病毒2型阳性血清2倍梯度稀释,用该抗体检测试剂盒按2.1方法检测,计算各稀释度待检血清阻断率。结果,猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒最低检测限为IPMA效价1∶800。
敏感性检验:用该抗体检测试剂盒按实施例2.1方法分别检测20份猪圆环病毒2型阳性血清、10份阴性血清,同时用IPMA方法进行检测结果表明:抗体检测试剂盒同IPMA方法符合率为96.7%。
特异性检验:用该检测试剂盒按2.1方法检测其它猪源病毒,包括PCV1G株、CSFVCVCCAV1412株、PRRSVJXA1-R株、PRVBartha-K61株、PPVWH-1株免疫制备的阳性血清,同时与IPMA方法分别检测PCV2阴性血清,结果表明:抗体检测试剂盒同其它猪源病毒无交叉反应,检测阴性血清与IPMA方法的符合率为90%。
批间重复性:用3批猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒按实施例2.1方法分别检测PCV2阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经不同批试剂盒检测阻断率的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV),测定自制试剂盒不同批次批间的变异系数。结果,猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒批间变异系数小于10%。
批内重复性:取1批猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒中5个分别按实施例2.1方法检测PCV2阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经同批不同试剂盒检测阻断率的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV),测定自制试剂盒同批次批内的变异系数。结果,猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒批内变异系数小于10%。
2.3抗体检测试剂盒的应用
用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒与韩国金诺猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒分别检测猪圆环病毒1型阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清及阴性血清。结果(如表2所示):猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒检测1型阳性血清均为阴性;检测猪圆环病毒2型阳性血清19/20为阳性;检测阴性血清10/10为阴性;而韩国金诺猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒检测1型阳性血清,3/10为阳性;检测猪圆环病毒2型阳性血清15/20为阳性;检测阴性血清10/10为阴性。结果表明:本发明ELISA抗体检测试剂盒可区分PCV1抗体和PCV2抗体,即能区分PCV1和PCV2是否感染,而韩国金诺抗体检测试剂盒则不能区分。
表2ELISA抗体检测试剂盒与韩国金诺试剂盒比对结果
“+”表示阳性,“-”表示阴性。
实施例3猪圆环病毒2型抗原检测试剂盒的制备及检测方法、质量研究及应用
3.1抗原检测试剂盒的制备及检测方法
试剂盒1即胶体金检测试纸条的制备:按照李红梅等(李红梅,聂政,陈佳等.免疫检测用的胶体金制备工艺的优化研究.食品工业科技,2009,30(12):289-291)建立的胶体金制备方法,制备胶体金溶液并标记单克隆抗体3H11,单克隆抗体PCV2-McAB1即2F8和羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,将该硝酸纤维素膜和浸润有金标单克隆抗体的金标垫用塑料外壳包装起来,做成胶体金检测试纸条。并配置相应的磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时,将样品与样品处理液混合,将2~3滴(约80μl)混合液滴加于胶体金检测试纸条的加样孔处,静置10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果。结果判定标准:质控线显色即试验成立,则检测线阳性为阳性,检测线阴性为阴性;质控线未显色即试验不成立,则判定为无效结果,需重测。
试剂盒2即酶免疫层析检测试纸条的制备:按照CN104062430A制备酶免疫层析检测试纸条,将实施例1制备的单克隆抗体3H11进行酶标记,将实施例1制备的单克隆抗体PCV2-McAB1即2F8和羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)分别喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,将该硝酸纤维素膜、酶标垫和底物垫用塑料外壳包装起来,做成酶免疫层析检测试纸条。并配制磷酸盐缓冲液作为样品处理液。检测时,将样品与样品处理液混合,将2~3滴(约80μl)混合液滴加于酶联免疫检测试纸条的加样孔处,同时迅速按下缓冲液按钮,静置30分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果。结果判定标准:质控线显色即试验成立,则检测线阳性为阳性,检测线阴性为阴性;质控线未显色即试验不成立,则判定为无效结果,需重测。
试剂盒3即荧光免疫层析检测试纸条的制备:按中国专利CN102192983A分别制备包被有生物素的荧光微球作为质控微球,终浓度为1.0mg/ml;包被有单克隆抗体3H11的荧光微球作为检测微球,终浓度为1.2mg/ml,分别以4μl包被于Fusion5膜的微球区;将终浓度为1.5mg/ml单克隆抗体2和终浓度为1.6mg/ml的链霉素亲和素均以1.0μl/cm包被于硝酸纤维素的检测线处。检测时,将5个不同稀释度的PCV2病毒液及样品处理液分别加置试纸条加样区,然后滴加上样缓冲液,膜层析5分钟以后,用仪器读取质控线、检测线信号,绘制病毒含量与测定的信号平均值的标准曲线及试纸条检测阴性临界值。待检样品以同样方式加入,膜层析5分钟以后,用仪器读取质控线、检测线信号,根据标准曲线计算待检样品的抗原含量或判定样品阴、阳性。结果判定标准:质控线显色即试验成立,则检测线阳性为阳性,检测线阴性为阴性;质控线未显色即试验不成立,则判定为无效结果,需重测。
试剂盒4即双抗夹心ELISA的制备及检测方法:取单克隆抗体PCV2-McAB1即2F8用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)作1000倍稀释包被酶标板,100μl/孔,置于4℃包被过夜,取出用PBST洗板3次,拍干;用5%的牛血清白蛋白以100μl/孔加入,37℃封闭1小时,洗板3次,拍干;每次检测时设置阳性对照和阴性对照,其中阳性对照为102.0TCID50/mlPCV2病毒液,阴性对照为PBS缓冲液,待检样品加入包被有单克隆抗体2F8的样品孔,100μl/孔,置于37℃作用1小时,取出用PBST洗板3次,拍干;取实施例1制备的经2000倍稀释的HRP标记单克隆抗体3H11作为二抗,100μl/孔,置于37℃作用1小时,取出用PBST洗板3次,拍干;加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液50μL/孔,37℃反应10min;最后加入50μl/孔的2M硫酸终止反应,用酶标仪检测OD450nm。S/P值=(待检样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照),S/P值大于0.3为阳性,小于0.2为阴性,0.2-0.3间为可疑。
3.2抗原检测试剂盒的质量研究
灵敏度检验:取PCV2SH株病毒液(106.0TCID50/ml),用PBS作10倍梯度稀释,分别按照实施例3.1用试剂盒1、2、3、4确定各检测方法的灵敏度,结果,试剂盒1最低检测限为103.8TCID50/ml,试剂盒2最低检测限为103.2TCID50/ml,试剂盒3最低检测限为101.5TCID50/ml,试剂盒4最低检测限为102.0TCID50/ml。
敏感性检验:取20份经PCR检测均为猪圆环病毒阳性血清的样品,分别按照实施例3.1用试剂盒1、2、3、4进行检验,结果,试剂盒1检测14/20为阳性,试剂盒2检测15/20为阳性,试剂盒3检测19/20为阳性,试剂盒4检测18/20为阳性。
批间重复性:用3批试剂盒1、2、3分别按实施例3.1方法分别检测PCV2抗原阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经不同批试剂盒1、2、3检测阳性和阴性数量及显色强度。结果,试剂盒1、2、3的各自不同批试纸条检测结果相同,且显色强度一致。同时,用3批试剂盒4按实施例3.1方法分别检测PCV2抗原阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经不同批试剂盒4检测S/P值的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV),测定试剂盒4不同批次批间的变异系数。结果,试剂盒4批间变异系数小于10%。表明:试剂盒1、2、3、4的批间重复性较好。
批内重复性:分别各自取同批的试剂盒1、2、3各5盒,分别按实施例3.1分别检测PCV2抗原阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经同批不同盒的试剂盒1、2、3检测阳性和阴性数量及显色强度。结果,各自同批不同盒的试纸条检测结果相同,且显色强度一致。同时,取同批5盒的试剂盒4分别检测PCV2抗原阳性血清和阴性血清,分别计算每份血清经同批不同盒检测阻断率的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV),测定自制试剂盒同批次批内的变异系数。结果,试剂盒4批内变异系数小于10%。表明:试剂盒1、2、3、4的批内重复性较好。
3.3抗原检测试剂盒的应用
按实施例3.1用试剂盒1、2、3、4分别检测30份临床猪血清样品,同时用猪圆环病毒PCR试剂盒(北京世纪元亨公司)按照说明书进行检测,比较各试剂盒检测结果。结果(见表3):30份临床样品中PCR检测20份为阳性,10份为阴性;试剂盒1同PCR阳性符合率为14/20,阴性符合率为9/10;试剂盒2同PCR阳性符合率为17/20,阴性符合率为8/10;试剂盒3同PCR阳性符合率为19/20,阴性符合率为6/10;试剂盒4同PCR检测试剂盒阳性和阴性符合率均为18/20。结果:试剂盒1、2、3、4检测结果与PCR符合率较高,以试剂盒3的灵敏度为最高。
表3不同试剂盒的检测结果
注:“+”表示阳性,“-”表示阴性,“±”表示可疑。
实施例4单克隆抗体3H11预防、治疗病毒感染的效果评价
筛选PCV2抗原、抗体双阴性的21日龄仔猪15头,随机分为3组,第一组口服实施例2制备的单克隆抗体2ml,第二组口服PBS缓冲液2ml,第3组作为空白对照。口服后24小时第一组和第二组肌肉接种PCV2SH株4ml,每日观察仔猪的临床症状及体温,14日后计算仔猪相对日增重及淋巴结免疫组织化学抗原检测结果。结果:第一组4/5获得保护,第二组5/5发病(表现为体温升高、相对日增重降低、淋巴结经免疫组织化学检测抗原阳性),空白对照正常。
表4单克隆抗体3H11的预防、治疗结果
“+”表示阳性,“-”表示阴性。
实施例5基因工程抗体的制备
按照郝淑美等(郝淑美,李群,王承宇等.H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达.病毒学报,2009,25(1):63-67)在建立的单链抗体制备的操作方法,用单克隆抗体3H11的重链可变区和轻链可变区序列(分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.3)制备相对应的单链抗体,依次为单链抗体1、2。
将PCV2SH株病毒液(含200TCID50/0.1ml)分别与系列稀释的单链抗体1、2等体积混合后,于37℃作用2小时,然后加入已长满单层的PK-15细胞,37℃孵育2小时后,弃上清,将细胞用PBS洗涤后,于37℃、5%CO2作用48小时,弃上清,同时设置接毒细胞对照和健康细胞对照。将细胞用80%丙酮4℃固定30min,用pH7.4PBS洗涤3次,5min/次,加入分别加入PCV2单克隆抗体,37℃作用1小时,用pH7.4PBS洗涤3次,5min/次,加入FITC标记的兔抗鼠IgG置于37℃作用1小时,用pH7.4PBS洗涤3次,5min/次,置于荧光显微镜下观察。以单链抗体1或2阻止PCV2感染细胞的最高稀释度作为其中和抗体效价。
按照实施例1.3.5操作方法,测定单链抗体中和效价。结果显示:单链抗体1、2均可以抑制PCV2结合细胞,中和抗体效价均为1:32。表明:单克隆抗体3H11的可变区序列可用于猪圆环病毒2型基因工程抗体的制备,并且所制备的基因工程抗体具有中和猪圆环病毒2型的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (12)
1.一种特异性结合猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列,其中,1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
2.一种由权利要求1所述可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体,和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体;所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体;其中,所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段;所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪圆环病毒2型的能力;优选地,所述抗体为单克隆抗体PCV2-McAB2,所述单克隆抗体PCV2-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.2,轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.4。
3.一种药物组合物,其中,所述药物组合物包括免疫量的具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段,以及药学上可接受的载体;优选地,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及药学上可接受的载体;优选地,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区制备的单链抗体,以及药学上可接受的载体;更优选地,所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体,以及药学上可接受的载体。
4.一种抗体检测试剂盒,其中,所述抗体检测试剂盒包括有效量的权利要求2所述抗体或所述抗体片段,猪圆环病毒2型抗原,以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述抗体或所述抗体片段使用酶标记,所述用于和猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物;优选地,所述抗体检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,猪圆环病毒2型抗原,以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
5.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的权利要求2所述抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底物;优选地,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的权利要求2所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照,所述单克隆抗体PCV2-McAB1选自下列抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9,优选为抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8或3G12。
6.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的权利要求2所述抗体或所述抗体的片段,以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中,所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物,所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗;优选地,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1和/或有效量的权利要求2所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照,所述单克隆抗体PCV2-McAB1选自下列抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9,优选为抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8或3G12。
7.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;
其中,所述抗原检测试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1),所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上吸附有干燥的酶底物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体PCV2-McAB2上标记的酶产生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体PCV2-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迁移;以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1;
其中,所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括一条检测线(6)、一条质控线(7),其中,所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗,且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PCV2-McAB1而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元,底物供应区,样品供应区,检测区以及吸水垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端;以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
8.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;
其中,所述抗原检测试剂盒包括胶体金检测试纸条,所述胶体金检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
9.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB1、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中,所抗原检测述试剂盒包括荧光免疫检测试纸条,所述荧光免疫检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向上依次由滤纸、样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述硝酸纤维素膜与荧光垫接触或与样品垫、荧光垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迁移;所述荧光垫上含有荧光标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线,所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McAB1,所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
10.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;优选地,所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McAB1的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,所述洗涤液为磷酸盐缓冲液,所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液,所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液,所述终止液为2mol/l的浓H2SO4溶液,所述阴性对照为磷酸盐缓冲液,所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪圆环病毒2型的溶液。
11.一种抗原检测试剂盒,其中,所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环病毒2型抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照;其中,或含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McAB1与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的混合反应液;其中,所述洗涤液为磷酸盐缓冲液,所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液,所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液,所述终止液为2mol/l的浓H2SO4溶液,所述阴性对照为磷酸盐缓冲液,所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪圆环病毒2型的溶液。
12.如权利要求5-11任一项所述抗原检测试剂盒在非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测检测中的应用;优选地,所述非诊断目的的猪圆环病毒2型检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测以及定性和定量鉴别检验含猪圆环病毒2型和其他抗原的疫苗组合物中的猪圆环病毒2型抗原的检测。
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