CN106610405A - 人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法 - Google Patents
人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，该方法是先将收集到尿液样品用盐酸溶液酸化至pH1.0左右，以防止尿液氧化变质，再将预处理好的尿液样品上样至固相微萃取柱，依次用水和氨化甲醇洗脱，收集的溶液氮气吹干后用流动相溶解，然后用尼龙NYLL滤头过滤，最后采用高效液相色谱电化学法检测，色谱柱为ACCHROM XCharge C18柱、流动相为0.2v/v%三氟乙酸水溶液、柱温为30℃、流速为1.0 mL/min、检测电压为+0.9V。该方法可以缩短色谱柱平衡时间，噪声小、基线较平稳、峰性较为尖锐，有效的延长色谱柱的使用寿命。
Description
技术领域
本发明属于临床药物分析检测技术领域，具体是一种人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤(Pheochromocytomas)是肾上腺髓质及肾上腺外副神经节系统产生儿茶酚胺的嗜铬细胞所发生的肿瘤。主要的临床症状表现为阵发性的高血压、头痛、心悸、焦虑、出汗和高血糖。儿茶酚胺类物质主要有去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、肾上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Catecholamine，CA)，嗜铬瘤细胞分泌大量的儿茶酚胺类物质使得交感神经功异常增强和持续，导致上述症状的发生。去甲苄肾上腺素(Normetanephrine，NMN)和间甲肾上腺素(Metanephrine，MN)是儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的代谢产物。有报道称：甲氧基代谢产物(MNs)中的MN和NMN是比较好的诊断嗜铬细胞瘤的生物检测手段。与儿茶酚胺类物质相比，MNs具有更长的半衰期、更稳定的血药浓度和不容易受到食物和药物的影响。COMT广泛分布于肾上腺髓质和嗜铬细胞瘤细胞，MNs的浓度与肿瘤的体积密切相关。据文献报道，测定游离的甲氧基代谢产物更为普遍和适用。测定多巴胺类化合物(CAs)和MNs含量的方法主要有毛细管电泳法、LC-ECD、LC-MS等。目前，临床检测血液或尿样中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物采用的是离子对液相色谱-电化学检测方法，该方法在流动相的水相中加入了磺酸盐作为离子对，造成色谱柱平衡时间长、噪声较大基线不稳定、有时峰形拖尾较为严重。
本发明旨在通过改性的C18色谱柱，简化流动相组成，缩短平衡色谱柱时间，获得良好的色谱分离曲线，从而建立临床上尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的高效液相色谱电化学检测法。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是解决现有尿样中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物的检测方法色谱柱平衡时间长、噪声较大基线不稳定、峰形拖尾较为严重的技术问题，提供一种固相萃取-高效液相色谱电化学检测法，该方法可以缩短色谱柱平衡时间，噪声小、基线较平稳、峰性较为尖锐，有效地延长色谱柱的使用寿命。
技术方案：人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，是将尿液样品经酸化预处理后进行固相萃取，然后采用高效液相色谱电化学法检测。
所述酸化预处理是指用10mol/L的盐酸溶液将尿液样品酸化至pH1.0。
所述固相萃取是指将预处理的尿液样品上样至萃取柱，用水淋洗后再用2％氨化甲醇洗脱。
所述高效液相色谱电化学法的色谱柱为ACCHROM XCharge C18柱、流动相为0.2v/v％三氟乙酸水溶液、柱温为30℃、流速为1.0mL/min、检测电压为+0.9V。
有益效果：固相萃取-高效液相色谱电化学检测法测定人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物的含量，主要通过选用改性的C18色谱柱，克服了传统的离子对高效液相色谱-电化学法对其检测的缺点，如流动相含有辛烷磺酸钠等易造成水相中产生气泡、色谱柱平衡时间长、噪声较大基线不稳定、有时峰形拖尾较为严重等，采用小分子挥发性三氟乙酸水溶液作为流动相，缩短色谱柱平衡时间、噪声小、基线较平稳、峰性较为尖锐，大大改善了色谱条件，获得良好的色谱分离曲线，可满足临床上尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物的含量检测要求。
本发明选用三氟乙酸水溶液为流动相，与采用含EDTA、辛烷磺酸钠、磷酸盐缓冲液及乙腈流动相的方法相比，本发明可以缩短色谱柱平衡时间，噪声小、基线较平稳、峰性较为尖锐，有效的延长色谱柱的使用寿命。
附图说明
图1中(A)为流动相三氟乙酸浓度与组分保留时间关系图，(B)为0.2v/v％三氟乙酸与组分和空白样品干扰杂质保留时间关系图，a为1.0μg/mL标准对照品，b为空白尿样；
图2为检测电压与响应峰面积的关系图；
图3为四种物质的标准曲线，(1)为去甲肾上腺素、(2)为肾上腺素、(3)为去甲苄肾上腺素、(4)为间甲肾上腺素；
图4为尿液样品测定的HPLC-ECD色谱流出图，1为去甲肾上腺素、2为肾上腺素、3为去甲苄肾上腺素、4为间甲肾上腺素、5为内标物异丙肾上腺素，a为样品、b为空白对照、c为标准品。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明提供了一种人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，尿液样品预处理：将尿液样品用10mol/L的盐酸溶液酸化至pH1.0，并储存在-20℃冰箱中；
步骤2，供试品溶液的制备：先将Cleanert PCX-SPE萃取小柱用甲醇和水活化后，将预处理好的尿液样品上样至萃取柱，用水淋洗后用2％的氨化甲醇洗脱，收集的溶液经氮气吹干后用流动相溶解，然后用尼龙NYLL滤头过滤；
步骤3，混合标准溶液的配制：取1.0mg/mL的甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素对照品储备液分别配制成浓度为0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和50.0μg/mL的混合标准溶液，含内标异丙肾上腺素2.0μg/mL，按尿液样品预处理和供试品溶液制备步骤制备一系列混合标准溶液；
步骤4，精密量取供试品溶液和混合标准溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
色谱柱：ACCHROM XCharge C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；
流动相：0.2v/v％三氟乙酸(TFA)水溶液；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：20.0μL；
检测电压：+0.9V(vs.Hy-REF reference electrodes)。
步骤5，采用异丙肾上腺素未内标物，以被测物质的峰面积与内标物峰面积比对被测物质浓度进行线性拟合，得工作曲线，根据供试品溶液得到的峰面积和拟合得到的工作曲线，计算人尿液中甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的含量。
检测方法的建立
(1)条件的优化
①流动相的优化
分别取4种对照品溶液和内标稀释成浓度为1.0μg/mL的对照品混合溶液，改变流动相水相中三氟乙酸的浓度分别为0.05v/v％、0.1v/v％、0.15v/v％、0.2v/v％，其他按色谱条件分别进样，结果见图1(A)。三氟乙酸在流动相的浓度越大化合物的保留时间越长，有利于各组分色谱峰的分离；但是由于色谱柱pH的适用范围在1-9，因此三氟乙酸的浓度必须保证在色谱柱耐受的pH范围之内。此外，0.2v/v％三氟乙酸水溶液能将空白样品中的干扰物质与待测组分分离，且分析时间适宜，最终选择0.2v/v％三氟乙酸水溶液作为流动相，结果见图1(B)。
②检测电压的选择
分别取4种对照品溶液稀释成浓度为1.0μg/mL的对照品混合溶液，将电化学检测器的检测电压分别设置成0.7V、0.8V、0.9V、1.0V、1.1V、1.2V和1.3V，其他按色谱条件分别进样。由图2可知：电压在0.7-0.9V之间响应随电压增大而增大，在0.9V之后响应逐渐减弱，因此实验选择0.9V电压作为检测电压。
③固相微萃取柱的选择
CAs和MNs都具有碱性氨基结构，碱性样品通常按照阳离子交换的原理进行样品的前处理。有报道采用不同机制填料的固相萃取柱对嗜铬细胞瘤阳性尿液进行净化处理，如弱阳离子交换柱(WCX)，混合型阳离子交换柱(MCX)，hydrophilic–lipophilic balance(HLB)。本实验采用PCX(Agela，混合型阳离子交换固相萃取小柱)、SCX(阳离子交换小柱)、MCX(Waters,混合型阳离子交换小柱)、WCX(Waters,弱阳离子交换小柱)处理空白样品和添加标准对照品的空白尿液，考察不同类型的SPE小柱的干扰去除能力以及待测物的回收率。结果表明：SCX、MCX和WCX固相萃取柱可能由于过强的吸附性或太弱的保留能力，洗脱液中待测物组分含量很少，回收率不高(均小于50％)。PCX则具有较强的去除杂质的效果和较高的回收率，有更好的提取和纯化能力，因此选择PCX-SPE进行样品预处理。并对对PCX-SPE的洗脱条件进行优化，其最优条件为：先后2mL甲醇和1mL水活化柱子后，在酸性条件下上样1mL，用10mL的水淋洗柱子，最后用3mL 2％的氨化甲醇洗脱。最后测定了10μg·mL-1混合标准溶液过固相萃取柱后回收率(表1)。
表1 PCX固相萃取的回收率
(2)方法学建立
①线性范围
取一系列经固相为萃取柱进行预处理的混合浓度标准溶液(0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL和50.0μg/mL；含2.0μg/mL内标物异丙肾上腺素)进样，每个浓度进样三次，考察响应被测物与内标物峰面积比与其浓度的线性关系等(表2)。四种性物质的线性相关系数r均在0.995以上。标准曲线见图3。
②检测限与定量限
将去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的对照品储备液稀释配制成10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL混合溶液，按照尿样样品的预处理步骤处理后进样，以信噪比3和10分别测定检测限和定量限，结果见表2。
表2 HPLC-ECD测得的四中化合物的线性回归方程、相关系数和线性范围
③精密度与重复性
以甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的对照品储备液配制成终浓度为0.10μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL的混合溶液，含内标2.0μg/mL,按照尿样样品的预处理步骤处理后进样，每种浓度一天内连续进样六次，其响应峰面积的RSD％为日内精密度；每种浓度连续测定三天，每天测定六次，其响应峰面积的RSD％为日间精密度(见表3)。四种被测物的日内和日间精密度均小于或等于2.0％，说明该方法具有良好的精密度与重现性。
表3 四种化合物不同浓度水平的日内和日间精密度(n＝6)
*4种化合物的浓度水平为0.10μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL
(3)样品含量及回收率的测定
按照在优化后的色谱条件，将尿样预处理方法后制得供试品溶液仅进行色谱实验，得到色谱流出曲线。重复进样3次，结果取平均值，得到尿样样品中去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素和间甲肾上腺素的含量。含量计算：外标曲线法计算尿样样品中甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的含量。
取一嗜铬细胞瘤阳性尿样，按照先前建立高效液相色谱电化学检测法测定样品中各组份的含量，然后在该嗜铬细胞瘤阳性尿样中分别准确加入三种不同浓度水平1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的混合标准品溶液，按尿样样品的预处理步骤制得供试品后进行回收率测定。结果表明：4个组分甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的回收率基本都在80％-120％之间，表明该实验方法准确可靠，满足临床实际样品中四种化合物的分离与检测。回收率＝(检测值－样品溶液中各组份的浓度)/各组份对照品加标浓度×100％。
本发明选用0.2％三氟乙酸水溶液为流动相，与采用含EDTA、辛烷磺酸钠、磷酸盐缓冲液及乙腈流动相的方法相比，本发明可以缩短色谱柱平衡时间，噪声小、基线较平稳、峰性较为尖锐，有效的延长色谱柱的使用寿命。
Claims (5)
1.人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，其特征在于：将尿液样品经酸化预处理后进行固相萃取，然后采用高效液相色谱电化学法检测。
2. 根据权利要求1所述的人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，其特征在于：所述酸化预处理是指用10 mol/L的盐酸溶液将尿液样品酸化至pH1.0。
3.根据权利要求1所述的人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，其特征在于：所述固相萃取是指将预处理的尿液样品上样至萃取柱，用水淋洗后再用2%氨化甲醇洗脱。
4. 根据权利要求1所述的人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱电化学法的色谱柱为ACCHROM XCharge C18柱、流动相为0.2v/v%三氟乙酸水溶液、柱温为30℃流速为1.0 mL/min、检测电压为+0.9V。
5.根据权利要求1或4所述的人尿液中儿茶酚胺类物质和其甲氧基代谢物含量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，尿液样品预处理：将尿液样品用10 mol/L的盐酸溶液酸化至pH1.0，并储存在-20℃冰箱中；
步骤2，供试品溶液的制备：先将Cleanert PCX-SPE萃取小柱用甲醇和水活化后，将预处理好的尿液样品上样至萃取柱，用水淋洗后用2%的氨化甲醇洗脱，收集的溶液经氮气吹干后用流动相溶解，然后用尼龙NYLL滤头过滤；
步骤3，混合标准溶液的配制：取1.0 mg/mL的甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素对照品储备液分别配制成浓度为0.050 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL的混合标准溶液，含内标异丙肾上腺素2.0 μg/mL，按尿液样品预处理和供试品溶液制备步骤制备一系列混合标准溶液；
步骤4，精密量取供试品溶液和混合标准溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5，采用异丙肾上腺素为内标物，以被测物质的峰面积与内标物峰面积比对被测物质浓度进行线性拟合，得工作曲线，根据供试品溶液得到的峰面积和拟合得到的工作曲线，计算人尿液中甲肾上腺素、肾上腺素、去甲苄肾上腺素、间甲肾上腺素的含量。
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