CN104610387A - 基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法 - Google Patents
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Abstract
基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,涉及一种寡糖非还原胺化衍生化的方法。1)将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合,水浴反应后,利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果;2)以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源,考察高分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。1)可以广泛应用到各种还原性寡糖及复杂寡糖库;2)“一步衍生化”;3)操作简单,无需纯化;4)反应时间短(约3h);5)衍生化效率可达到95%以上;6)质谱中响应信号及信噪比提高约2~5倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种寡糖非还原胺化衍生化的方法,尤其是涉及一种基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,包括以含磷苯胺衍生物为衍生化试剂,在甲醇水混合溶剂中使寡糖衍生化的反应。具体来讲,所述方法使用还原性寡糖为寡糖原料,含磷苯胺衍生物为衍生化试剂,在甲醇水混合溶剂中反应生成含磷苯胺衍生物衍生化的寡糖。
背景技术
蛋白质的糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰,它参与、调控生命体的众多生物功能,比如说胚胎的发育、蛋白的折叠、细胞粘附、免疫响应等等。其生物功能的多样性源于寡糖的结构复杂性。因此,糖蛋白上寡糖结构的分析及鉴定对理解其生物功能具有非常重要的意义。在诸多技术手段中,质谱技术因其快速、灵敏、样品消耗量少等特点在寡糖结构的分析、鉴定中发挥了越来越重要的作用。
寡糖在质谱中的离子化效率较低,一直制约着质谱技术在糖检测领域的发展,因此一般需要对寡糖进行衍生化。传统的还原胺化衍生化方法需要用到毒性高的还原试剂,如硼氢化钠,而且与下游的质谱检测不兼容,需要繁琐的分离纯化步骤,容易造成样品损失。后来又发展了非还原胺化衍生化法,如利用3-氨基喹啉、2-氨基吡嗪及苯胺作为非还原胺化衍生化试剂。
研究表明,磷酰基在ESI质谱分析中具有较强的增敏效应。将氨基酸氮端磷酰化修饰后进行MALDI-MS检测,发现磷酰基可以有效抑制低分子量区域的基质峰的干扰,增强小分子氨基酸的MALDI质谱信号。
发明内容
本发明的目的在于结合苯胺与还原糖的非还原胺化反应及磷酰基在MALDI-MS中的增敏效应,提供一种工艺较为简单的基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法。
本发明包括以下步骤:
1)将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合,水浴反应后,利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果;
2)以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源,考察高分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。
在步骤1)中,所述将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合以麦芽五糖为模型;所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液可采用含有1mg/mL含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液,乙酸-甲醇溶液中乙酸与甲醇的体积比可为1∶9;所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液的体积比可为1∶1,所述麦芽五糖水溶液的浓度可为100μg/mL;所述水浴反应的条件可在75℃水浴反应3h;所述含磷苯胺衍生物如表1所示。
与现有的方法相比,本发明具有以下突出优点:
1)可以广泛应用到各种还原性寡糖及复杂寡糖库;
2)“一步衍生化”;
3)操作简单,无需纯化;
4)反应时间短(约3h);
5)衍生化效率可达到95%以上;
6)质谱中响应信号及信噪比提高约2~5倍。
附图说明
图1是基于含磷苯胺衍生物作为非还原胺化衍生化试剂的寡糖衍生化方法反应通式。
图2是在最佳条件下,未衍生化的麦芽五糖(A)及应用本方法衍生化的麦芽五糖(B)的质谱图。横轴为质荷比(m/z),纵轴为信号强度(Intensity)。
图3是在最佳条件下,未衍生化的NA2(A)及应用本方法衍生化的NA2(B)的质谱图。横轴为质荷比(m/z),纵轴为信号强度(Intensity)。
图4是在最佳条件下,来源于核糖核酸酶B的未衍生化的寡糖混合物(A)及应用本方法衍生化的寡糖混合物(B)的质谱图。横轴为质荷比(m/z),纵轴为信号强度(Intensity)。
图5是在条件下,来源于鸡卵清蛋白的未衍生化的寡糖混合物(A)及应用本方法衍生化的寡糖混合物(B)的质谱图。横轴为质荷比(m/z),纵轴为信号强度(Intensity)。
具体实施方式
本发明涉及一种寡糖的基于含磷苯胺衍生物的非还原胺化衍生化方法,以4-DPPBA为例,其反应的通式如图1所示。
表1是本发明中所涉及的含磷苯胺衍生物分子结构式。图2~5中所涉及的含磷苯胺衍生物均以4-DPPBA为例加以说明。
表1
实施例1测定中所用的质谱参数及基质
以下实施例中所用的质谱仪为Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF/TOF质谱仪。所用激光为337nm N2激光光源,激光脉冲100ns,加速电压24.96KV,反射电压22.37kV。谱图采集模式为正离子反射模式,每张谱图累计5000次。仪器使用前经Peptide CalibrationStandards校准。激光强度根据样品出峰情况进行调整。
对实施例4、5、6、7,MALDI质谱所采用的基质为20mg DHB溶于1mL 50%水-乙腈混合溶液,其中含有1mmol醋酸钠。分析前基质与样品等体积混合。
实施例2寡糖衍生化效率计算
寡糖衍生化效率计算以MALDI质谱谱图上衍生化后的寡糖分子量对应的质谱峰的峰面积与衍生化前及衍生化后分子量对应的质谱峰的峰面积之和的比计算。以4-DPPBA为例,具体计算公式如下:
式中,A4-DPPBA衍生:衍生化反应完成后被4-DPPBA试剂衍生化的寡糖质谱峰的峰面积;
A未衍生:衍生化反应完成后未被4-DPPBA试剂衍生化的寡糖质谱峰的峰面积;
对于实施例4、5、6、7,含磷苯胺衍生物以4-DPPBA为例。
实施例3糖蛋白上寡糖的酶切、提取
125μg核糖核酸酶B中加入30μL 50mM碳酸氢铵缓冲液(pH=7.9),加入PNGase F酶溶液0.8μL,混匀器混匀1min后置于37℃孵育24h。反应停止后用真空离心浓缩仪除去溶剂。所得样品加入100μL Milli-Q水溶解,转移至Millipore MWCO 3KD离心管中4000g离心40min。下层溶液用真空离心浓缩仪除去溶剂。所得样品加入10μL Milli-Q水溶解,待用于实施例6。
2.5mg鸡卵清蛋白中加入190μL 50mM碳酸氢铵缓冲液(pH=7.9),加入PNGase F酶溶液3.5μL,混匀器混匀1min后置于37℃孵育24h。反应停止后用真空离心浓缩仪除去溶剂。所得样品加入300μL Milli-Q水溶解,转移至Millipore MWCO 3KD离心管中4000g离心40min。下层溶液用真空离心浓缩仪除去溶剂。所得样品加入60μL Milli-Q水溶解,待用于实施例7。
实施例4应用本方法衍生麦芽五糖
以麦芽五糖为模型,将1mg/mL 4-DPPBA的乙酸-甲醇(10∶90)溶液与100μg/mL麦芽五糖溶液等体积混合,在75℃水浴反应3h。反应完毕,进行MALDI质谱分析。质谱谱图见图2。图2中A图表示未衍生化的麦芽五糖在质谱中的响应信号,B图表示采用本方法衍生化(以4-DPPBA为衍生化试剂)的麦芽五糖在质谱中的响应信号。通过A,B两图对比可得,采用本方法对麦芽五糖进行衍生,可使麦芽五糖在质谱中的响应信号提高约5倍,信噪比提高约10倍。
实施例5应用本方法衍生寡糖NA2
将100μg/mL NA2溶液与1mg/mL 4-DPPBA的乙酸-甲醇(10∶90)溶液等体积混合,在75℃水浴反应3h。反应完毕,进行MALDI质谱分析。质谱谱图见图3。图3中A图表示未衍生化的NA2在质谱中的响应信号,B图表示采用本方法衍生化(以4-DPPBA为衍生化试剂)的NA2在质谱中的响应信号。通过A,B两图对比可得,采用本方法对NA2进行衍生,可使NA2在质谱中的响应信号及信噪比提高约2倍。
实施例6应用本方法衍生来自核糖核酸酶B的寡糖样品
将来自核糖核酸酶B的寡糖样品与1mg/mL 4-DPPBA的乙酸-甲醇(10∶90)溶液等体积混合,在75℃水浴反应3h。反应完毕,进行MALDI质谱分析。质谱谱图见图4。图4中A图表示未衍生化的来自核糖核酸酶B的寡糖样品在质谱中的响应信号,B图表示采用本方法衍生化(以4-DPPBA为衍生化试剂)的来自核糖核酸酶B的寡糖样品在质谱中的响应信号。通过A,B两图对比可得,采用本方法对来自核糖核酸酶B的寡糖样品进行衍生,可使来自核糖核酸酶B的寡糖样品在质谱中的响应信号及信噪比提高约3倍。
实施例7应用本方法衍生来自鸡卵清蛋白的寡糖样品
将来自鸡卵清蛋白的寡糖样品与1mg/mL 4-DPPBA的乙酸-甲醇(10∶90)溶液等体积混合,在75℃水浴反应3h。反应完毕,进行MALDI质谱分析。质谱谱图见图5。图5中A图表示未衍生化的来自鸡卵清蛋白的寡糖样品在质谱中的响应信号,B图表示采用本方法衍生化(以4-DPPBA为衍生化试剂)的来自鸡卵清蛋白的寡糖样品在质谱中的响应信号。通过A,B两图对比可得,采用本方法对来自鸡卵清蛋白的寡糖样品进行衍生,可使来自鸡卵清蛋白的寡糖样品在质谱中的响应信号及信噪比提高约3倍。
Claims (8)
1.基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于包括以下步骤:
1)将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合,水浴反应后,利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果;
2)以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源,考察高分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。
2.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合以麦芽五糖为模型。
3.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液采用含有1mg/mL含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液。
4.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,乙酸-甲醇溶液中乙酸与甲醇的体积比为1∶9。
5.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液的体积比为1∶1。
6.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述麦芽五糖水溶液的浓度为100μg/mL。
7.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述水浴反应的条件是在75℃水浴反应3h。
8.如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法,其特征在于在步骤1)中,所述含磷苯胺衍生物如表1所示。
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