CN101120254A - 固相寡糖标记:用于操作固定化糖的技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过衍生化操作固定化糖的方法。取决于衍生化的性质，糖可因此更容易地进行检测和/或鉴定或处理。具体而言，本发明涉及制备活性糖的方法，包括步骤：i)提供包含还原糖的样品；ii)提供共价连接至包含含有NH2基的捕获基团的接头上的固相支持物，其中所述接头任选地经间隔区连接至该固相支持物；iii)使所述还原糖与所述－NH2基反应，由此得到固定化的糖；iv)使游离－NH2基与加帽剂反应，其中加帽剂包含能够与－NH2基反应的反应基；和v)以还原剂还原C＝N键，由此得到经接头和任选的间隔区连接至固相支持物上的结构为糖CHn－NH－的活性糖，其中n是1或2。

Description

固相寡糖标记:用于操作固定化糖的技术
本文中引用的全部专利和非专利参考文献在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及糖操作的领域。具体而言，本发明涉及通过衍生化操作固定化糖的方法。取决于衍生化的性质，糖可因此更容易地进行检测和/或鉴定或处理。因此，在一个方面，本发明涉及糖检测和鉴定的领域。
发明背景
糖在自然界以多种形式存在。在包括人的动物中，糖的实例包括溶液中游离的还原糖(如血清中的单糖-葡萄糖)、溶液中游离的寡糖(如乳中的二糖-乳糖)，它们可以通过与多种氨基酸(如精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和其它氨基酸)形成共价键而连接至肽或蛋白质、共价连接至脂类如神经酰胺(如在神经节苷脂中)或通过磷脂酰肌醇连接至膜锚着点。还发现糖连接至包括参与代谢的某些小分子如葡糖苷酸在内的多种小分子。在以上实例中，糖链长度可以从一个糖残基至超过100个糖残基变化。
在包括细菌和植物在内的低等生物中，存在类型更广泛的结构。细菌细胞表面可以由长度为数千个残基的糖聚合物覆盖，这种糖聚合物可以在细菌检测中充当抗原并且作为疫苗。糖是细菌细胞壁的有机部分。糖自身可以是抗生素(如氨基糖苷抗生素，例如链霉素)或可以作为抗生素的重要成分(如红霉素和万古霉素)、作为酶抑制剂(如在阿卡波糖)或作为抗癌剂(例如刺孢霉素)存在。
一个特定目的领域是所找到连接至糖蛋白和糖脂的糖链(聚糖)的结构。已经证实糖蛋白的糖基化模式对它们的生物学功能，包括其生物利用度、其靶向性是重要的，并且甚至与肿瘤细胞的转移能力直接相关。例如，目前使用人血清转铁蛋白的糖基化模式作为对称作糖基化缺陷糖综合征的一系列遗传病的诊断性试验。已经证实特定的糖脂序列参与神经元发育和细胞表面信号作用、参与糖尿病，并且在某些特定的代谢性疾病如Tay-Sachs中积累，这对于此类代谢性疾病是诊断性的。
以上所述的寡糖和多糖中糖残基之间的键可以具有α构型或β构型，并且聚糖可是多重分支的。可能的聚糖链结构的多样性因此是庞大的，并且因此表征它们的结构天生是复杂的。因此在研究、诊断、监测重组糖蛋白的糖基化和开发新药剂中对用于糖结构和聚糖结构的检测、结构表征、鉴定、定量和化学/酶操作的方法存在浓厚兴趣。
目前正使用数种方法分析糖结构，并且最近综述了这些方法。未衍生化的寡糖和糖脂可以通过NMR波谱学、通过质谱分析法及通过层析加以分析。对于非常大的糖蛋白，质谱分析法提供更有限的信息，但是它们的蛋白水解消化物即糖肽的分析已经得到广泛使用。关于未衍生化寡糖的间接结构信息还可以从它们与结合糖的蛋白质如凝集素、抗体或酶的相互作用能力加以推导。
糖自身没有特征性发色团，仅有N-乙酰基，因此通过光学或光谱检测法检测它们的分离不常用。然而，多元醇的脉冲安培检测法已经是用于层析中检测的重要技术。
使用最广泛的高敏感性检测糖的方法是以放射性标记物或荧光标记物(TAG)标记还原性末端(内半缩醛、羟基醛和羟基酮的互变异构体)。已经描述从糖蛋白和糖脂中切割糖而允许需要的还原糖从糖蛋白、糖脂和其它糖缀合物中生成的化学方法和酶方法。最常见的是这样的还原糖与荧光分子的含氨基衍生物在还原性胺化作用的条件下反应，即在所述条件中初始形成的亚胺(C＝N)还原成胺(CH-NH)以产生稳定的键。在大多数情况下，标记反应使用过量标记剂在溶液中开展。这需要在分析前或分析期间分离过量的标记剂及其副产物。质谱分析法中使用的其它标记物已经通过胺化作用或还原性胺化作用以同样方式添加，随后通过质谱仪开展检测。
一旦已经添加允许特定检测的标签，随后如上所述的糖可以被分离和检测/定量。额外的结构信息可以通过使标记的糖接触酶如糖苷酶得到。如果特定的糖苷酶作用于标记的糖，这些酶可以切割一个或多个糖残基，引起层析迁移率或电泳迁移率改变(如通过例如HPLC、CE中的荧光探测器或通过它们在SDS-PAGE中迁移率的改变所检测)或引起它们的质量改变(如通过质谱仪中m/z值的改变所检测)。已经使用酶阵列以提供更高通量的分析。
以下给出本技术领域的简短综述。
Gao等2003综述了用于在溶液中使糖衍生化的合适技术。在溶液中，可以通过还原性胺化作用使糖衍生化。通常，胺的-NH2基可以与还原糖的醛基或酮基反应，由此产生具有-C＝N结构的化合物。此类化合物可以例如通过NaCNBH3进一步还原。Gao等，2003未公开固定化糖的操作。
US5,100,778描述了用于寡糖测序的方法，包括将鉴定标签置于寡糖的还原性末端残基上，将寡糖分裂成多个分离的部分，以例如特定的糖苷酶处理每一部分，汇集产物并分析得到的汇集物。该文件没有描述固定化的寡糖。
US4,419,444描述了用于化学性地结合含有糖残基的有机化合物至携带活性-NH2基的支持物的方法。该方法包括糖二醇的过氧化物氧化以通过切割糖中的C-C键产生活性醛，或者-CH2OH基至-CHO基的酶性氧化。两种氧化均将引起糖结构的改变。活性醛可以通过与-NH2基反应得以固定化。在使含糖化合物固定化后，可以实施还原步骤(例如使用NaBH4)以增加稳定性。该文件既没有描述通过还原糖的还原性末端使还原糖固定化，也没有描述通过还原的胺键对含有已改变糖的化合物固定化的操作。此外，糖的化学本质已经受到改变并且这种改变可能破坏其他修饰，如通过糖苷酶的特异性酶切割。该文件也未描述向固定化寡糖添加导致向该固定化寡糖添加分子结构的任何化学试剂。
WO92/719974描述了寡糖测序的方法。该方法包括在固相支持物上固定寡糖随后用多种糖苷酶处理。在固定化之前，寡糖可以与缀合物连接。该文件除描述糖苷酶处理之外未描述固定化糖的调整。
以上文献描述了聚糖的生物学重要性和复杂性，并且总结了连接标记物至还原糖如单糖及连接至寡糖还原性糖末端的某些益处。迄今，此类附着使用远远过量的标记剂(并且常常使用其它化学试剂如还原剂)在溶液中开展，因此需要于检测前或其它操作前采用耗时且常常困难的分离技术。此类分离技术不可避免地引起物质损失和稀释，因而使分析大大复杂化和出现偏差。因此，迫切需要这样的简单方法，即该方法可以将标记物安置在糖结构上并进一步操作该结构，无需用于分离反应起始材料、试剂、副产物和所需产物的复杂和致偏差的方法。我们在本文中描述了此类简单方法。
发明简述
本发明涉及通过与固定化分子反应，将还原糖(它可以是下文在“还原糖”部分中提及的任何还原糖)共价地连接至固相支持物(它可以是下文在“固相支持物”部分中提及的任意固相支持物)的方法，其中所述的固定化分子由任选的间隔区(即具有或没有间隔区)和引入含有-NH2官能度的捕获基团的接头(其可以是可切割的)组成。得到的固定化糖具有带C＝N键的无环形式，此无环形式可以与其环状糖胺互变异构体处于平衡态。
固定化后固相支持物上的游离-NH2基可以加帽并且C＝N键可以被还原。本方法在图1A+B→E中概述。该图显示未衍生化的吡喃糖，然而其意图代表任何还原糖。
在一种变体形式中，本发明的方法可以包括在对游离-NH2基加帽前还原含有C＝N键的固定化糖(由图1，结构C示例)成为CH-NH，产生结构Cred化合物(图1)。Cred中的NH2基可以在此阶段加帽以产生与通过以上所述并且示于图1的顺序C至D至E所产生的化合物具有相同结构E的化合物。
结构E化合物因此可以通过顺序A+B至C至D至E或者A+B至C至Cred至E产生。
因此，本发明的目的是提供制备活性糖的方法，该述方法包括步骤：
i.提供包含还原糖的样品(如图1中A)，
ii.提供共价连接至包含含有NH2基的捕获基团的接头上的固相支持物(例如图1中固体)，其中所述的接头任选地经间隔区连接至该固相支持物(如图1中B)，
iii.使所述还原糖与所述-NH2基反应，由此得到固定化的糖(如图1中C)，
iv.使游离-NH2基与加帽剂反应，其中加帽剂包含能够与-NH2基反应的反应基，
v.用还原剂还原C＝N键，
vi.由此得到经接头和任选的间隔区连接至固相支持物的含有糖
CHn-NH-结构的活性糖，其中n是1或2(如图1的化合物E)，
其中步骤iv和v可以以任意顺序开展。
在其中步骤iv先于步骤v实施的本发明实施方案中，NH2基在步骤iv中加帽将例如产生图1的化合物D，而在步骤v中开展的还原将例如产生图1的化合物E；
在其中步骤v先于步骤iv实施的本发明实施方案中，则(例如图1化合物C的)C＝N键的还原将例如产生图1的化合物Cred。-NH2基在步骤iv中加帽将例如产生图1的结构E化合物。本发明范围包括可以将包含还原糖的样品与固相支持物和还原剂同时温育。因此，C＝N键的还原(步骤v)将在还原糖与固相支持物的-NH2基反应(步骤iii)后立即开展。
在步骤iii)中，优选地，所述还原糖的还原性末端与所述-NH2基反应。因此，还原糖的醛基或半缩醛优选地与-NH2基反应。
优选地，本方法还包括步骤：
vii.使活性糖(例如图1的化合物E)的-NH-基与包含氮活性官能团(X)的衍生剂反应，由此得到共价连接于所述试剂的糖。与所述试剂共价连接的糖可以是例如图1的化合物F(当衍生剂是标记物时)或图1的化合物H(当衍生剂是与官能团连接的连接索(tether)时)。
术语“TAG”在本上下文中及在图1中(见下)意指可以共价地连接至另一个分子上由此将所述另一分子标记(因已经经历这种共价连接)的任何原子、分子或实体。
附图简述
图1显示本发明方法的实例。图1：A-E显示在固相支持物上捕获和操作还原糖以产生活性糖E。图1：E-G和J显示在固相支持物上操作活性糖E，以及标记糖的切割。本发明的方法可以包括一个或多个示于图1的步骤。在图1中，还原糖以吡喃糖为示例，然而，任何还原糖可以用于本方法。本图显示这样的实例，在其中接头经间隔区连接至固相支持物，然而，接头还可以直接连接至固相支持物。将固相支持物在本图中称作“固体”，然而，它可以是下文所提到的任何固相支持物。
图2.用于本发明的实施例中的还原糖的结构1-10，及还原性糖的混合物。
图3.接头(14)的合成和间隔区的结构(15)。
图4.TMR标记的D-半乳糖衍生物GalCH2-N(R)-TMR(21)的液相合成，以及对单糖标准物命名的描述。
图5.通用结构为糖CH2-N(R)-TMR的哺乳动物中常见八种单糖的合成性标记衍生物的结构21-28。
图6.四种固相支持物BP、B0、B1和B2的结构。
图7.一些加帽剂的结构。
图8.所用的一些通用结构为TAG-X的氮活性标记剂的结构。
图9.使用通用结构为X-连接索-YP的受保护的氮活性剂29的E至J(30)实例。
图10.通过CE分离图5中所示的八种TMR标记单糖标准物。洗脱的顺序是GalNAc(27)、Xyl(24)、Man(23)、Glc(22)、GlcNAc(26)、Fuc(25)、Gal(21)和GlcA(28)。上面的轨迹图是放大图。
图11.GP3的CE(以LacNAc作为使用TRITC标记的还原糖，4.2.1部分)。
图12.GP5的处于阴离子模式电喷雾质谱(以乳-N-四糖作为使用4-溴苯基异硫氰酸酯标记的还原糖，部分4.2.2)。内插图是显示与Br的主要同位素对应的两个峰的放大图。
图13.Gp6a的CE(使用以TRITC标记的单糖混合物6，4.2.3部分)。X指示未鉴定的峰。洗脱的顺序是GalNAc(27)、Man(23)和Fuc(25)。下面的轨迹图是放大图。
图14.Gp7a的CE(使用以TRITC标记的单糖混合物7，4.2.4部分)。X指示未鉴定的峰。洗脱的顺序是GalNAc(27)、Man(23)和Fuc(25)。下面的轨迹图是放大图。
图15.GP9的CE(使用以FITC标记的寡糖混合物9，4.2.5部分)。洗脱的顺序是G7至G2(图2)。
图16.Gp10的CE(使用FITC标记的核糖核酸酶B寡糖10，4.2.6部分)。
图17.G12的CE(以Gal2作为使用TRITC标记的还原糖，4.3.1部分)。
图18.G15的CE(以LNT 5作为使用TRITC标记的还原糖，4.3.2部分)。
图19.G18的CE(以8作为使用TRITC标记的还原糖混合物，4.3.3部分)。洗脱的顺序是LNT，随后Gal。
图20.在β-半乳糖苷酶消化固定化LNT(5)后切割产物G05(A)、G15(B)和G25(C)的CE(5.1.1部分)。TRITC标记的LNT四糖最先在接近36分钟处洗脱。半乳糖的丢失产生在38分钟后洗脱的三糖产物。
图21.F24(麦芽三糖(G3)作为使用TRITC标记的还原糖)与葡糖淀粉酶温育之前(轨迹A)和之后(轨迹B)切割产物的CE(5.1.2部分)。在记录轨迹A前，将标记的Glc参考样品(22，图5)添加至样品。
图22.在β-半乳糖苷酶处理C25(携带LNT和游离NH2基)、随后捕获释放的半乳糖、还原和使用TRITC标记后得到的切割产物的CE(5.2部分)。洗脱的顺序是LNT、因丢失半乳糖产生的三糖和半乳糖(21)。
图23.在以多种试剂加帽、还原和使用TRITC标记后，衍生自C22(固定化半乳糖)的切割产物的CE分析(6.1部分)。加帽剂是A(乙酸酐)、B(苯甲酸酐)、C(三氯乙酸酐)和D(二溴二甲苯)。标记的半乳糖(21)在全部轨迹中于接近17分钟处洗脱。
图24.从按照顺序C→Cred→G加工半乳糖得到的切割产物的CE(6.2部分)。半乳糖21在17分钟洗脱。
发明详述
操作还原糖的方法。
本发明涉及操作还原糖的方法。本发明方法的实例在图1中概述。应当指出本发明的方法实际上无需包括图1中显示的全部步骤。因此，本方法可以仅包括图1中概述的一些步骤。优选地，方法将至少包括步骤A+B→C、C→D和D→E，或步骤A+B→C、C→Cred和Cred→E。在图1中，还原糖以吡喃糖示例，然而，任何还原糖、特别是下文在“还原糖”部分中所述的任何还原糖可以用于本发明。图1中剖分吡喃糖环的-OH基意图显示还原糖可以携带连接至该还原糖上的一个或多个羟基。
本发明方法的每一步骤在下文中更详细地描述，其中大写字母A至J以及Cred涉及图1。
本发明每一化合物或中间体的身份，例如化合物A、B、C、Cred、D、E、F、G、H、I或J的身份可以通过技术人员已知的标准技术如通过NMR予以证实。
A.还原糖
术语“还原糖”如本文中所用包括能够将Cu2+还原为Cu+的糖的传统定义。糖是否具有还原性例如可以使用费林试剂进行测试。在更现代化的术语中，还原糖是包含醛基或式R2C(OH)OR′半缩醛的糖，其中R′不是H。优选地，还原糖是含有醛的糖结构，与称作半缩醛的环化形式处于平衡态。D-葡萄糖是此类还原糖的非限制性实例。量最丰富的环状形态包含称作呋喃糖的五元环，和称作吡喃糖的六元环(见命名规则)。
术语“糖”如本文中所用包括单糖、寡糖、多糖，以及包含单糖、寡糖或多糖的化合物。术语“糖(carbohydrate)”和“糖(sugar)”本文中可互换使用。
寡糖和多糖由糖苷键方式连接的单糖组成。通常，多糖包含至少10个单糖残基，而寡糖通常包含在2至10个单糖。寡糖和多糖可以是线型的或分支的。单糖定义为多羟基醛H-(CHOH)n-CHO或多羟基酮H-(CHOH)n-CO-(CHOH)m-H，其中m和n是整数。优选的单糖包含4至9个碳，因而优选地对于多羟基醛，n是3至8的整数，并且对于多羟基酮，n+m是3至8范围的整数。单糖是这样的化合物，如醛糖和酮糖以及其广泛类型的衍生物。衍生包括通过氧化、脱氧、优选地以氢原子、氨基或硫醇替代一个或多个羟基、以及羟基或氨基的烷基化、酰化、硫酸盐化作用或磷酸化实现的那些衍生。根据IUPAC命名，糖是具有化学计量式Cn(H2O)n的化合物，如醛糖和酮糖，以及通过还原羰基(糖醇)、通过氧化羧酸的一个或多个末端基团或通过以氢原子、氨基、硫醇或相似基团替代一个或多个羟基自单糖衍生的物质或这些化合物的衍生物。
在优选的实施方案中，还原糖是天然存在的还原糖或从天然存在或重组产生的含糖化合物中释放的还原糖，其优选地在释放后未接受其它修饰。特别优选地，还原糖是天然存在的还原糖或从天然存在或重组产生的化合物中释放的还原糖，其中所述天然存在的糖或所述释放的糖中全部醇基均没有在寡糖水平通过经酶氧化转化成醛或酮。还优选还原糖是天然存在的还原糖或从天然存在或重组产生的化合物中释放的还原糖，其中所述天然存在的糖或所述释放的糖没有受到过氧化物处理。因此通常优选所述天然存在的糖或所述释放的糖中醇基均未转化成醛或酮。在本上下文中，重组产生的化合物是通过活生物借助重组技术产生的化合物，例如异源糖蛋白。
还原糖可以从多种来源衍生。例如还原糖可以从活生物或活生物的部分中得到，如动物或植物，或者从一个或多个特定的动物组织或植物组织、从生物如原核生物细胞或真核生物细胞、从病毒、从体外(in vitro)培养的哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌、细菌细胞、酵母或噬菌体中得到。例如还原糖可以从任何前述细胞、微生物或活生物的提取物中分离。此类提取物可以包含还原糖，如游离糖。提取物还可以包含含有单糖、寡糖、多糖或糖部分的化合物，特别是糖蛋白或糖脂或与糖结合的通常称作糖苷的有机小分子。糖蛋白是在其中糖成分与肽、多肽或蛋白质成分连接的化合物。因此，如本文中所用的术语“糖蛋白”还包括蛋白聚糖和糖胺聚糖。糖脂是含有一个或多个通过糖苷键结合至疏水部分的单糖、寡糖、多糖或糖部分的化合物，如酰基甘油、鞘氨基醇(sphingoid)、神经酰胺(N-酰基鞘氨基醇)或磷酸异戊烯酯。糖苷意图描述通过O、N或S以糖苷键方式连接至一个或多个糖的有机小分子(MWt 100-5000)。
还原糖还可以是化学合成或化学/酶合成的产物，如在体外通过在溶液中或在固相上的化学合成所制备的寡糖。这些相同的合成性寡糖可以进一步通过酶反应进行修饰，例如通过硫酸盐化作用、磷酸化或糖基化。因此，本文中描述的方法还可以用于合成性寡糖或半合成性寡糖或寡糖文库的操作。
优选地，单糖、寡糖、多糖或糖部分在本发明方法实施前从糖蛋白中释放。这可以通过技术人员已知的标准方法完成。N-连接的单糖、寡糖、多糖或糖可以通过化学方法或酶方法从糖蛋白上切下。酶方法可以例如包括糖苷酶如内切糖苷酶H和F或者N-聚糖酶如PNG酶F的使用。O-连接单糖、寡糖、多糖或糖可以通过化学方法从糖蛋白中切下，包括肼解或碱性β-消除或使用酶如O-糖苷酶从糖蛋白中切下。用于释放N-连接和O-连接的化学方法包括与强亲核体和/或强碱如肼反应。糖可以利用酸性或碱性反应，或通过糖苷酶作用从有机小分子中切下。
在本发明的一个实施方案中，将预定量的参考标准物添加至包含还原糖的样品中。在接头是可切割的本发明实施方案中，这可以便于在固定化和释放后对所述还原糖定量。
参考标准物可以是能够与-NH2反应的任何化合物，例如本文如下在“E→F.添加TAG”部分中所述的包含一个氮活性官能团的任何化合物。参考标准物优选地是醛或酮，更优选地是糖。在本发明的另一个实施方案中，将相同或不同的参考标准物在与含有还原糖的溶液(包含或不包含添加的参考标准物)接触前添加至固相支持物(见下文“B.固相支持物”部分中)。因此，可以使用两种或多种参考标准物，一种(或多种)参考标准物在固相支持物与包含还原糖的溶液接触前添加至固相支持物，并且一种或多种参考标准物添加至包含还原糖的溶液中。
还可以在与还原糖接触后、但优选地在加帽之前添加一种或多种参考标准物至固相支持物。因此，例如可以优选地在洗涤步骤后添加参考标准物至图1的化合物C或Cred。
在其中固相支持物与参考标准物偶联的本发明实施方案中(见下文“B.固相支持物”部分中)，优选使用不同的参考标准物。
在一个本发明实施方案中，方法包括预处理待于本方法中使用的样品的步骤。特别地，包含糖苷方式连接的糖如糖蛋白、糖脂或糖苷的样品可以在与固相支持物反应前用清除树脂预处理。清除树脂优选地是包含能够与包括还原糖在内的醛和酮反应的亲和基团的树脂，清除树脂优选地包含氨基或肼。因此样品与清除树脂的温育将除去多余的醛、酮和还原糖。预处理后，此类方法通常还将包括从所述以糖苷方式连接的糖中释放还原糖由此得到含有还原糖的样品的步骤。因此所述样品中的绝大部分醛和酮将是从以糖苷方式连接的糖中释放的还原糖。所述的还原糖可以通过多种方法释放，所述方法包括化学方法或酶方法，如在本部分以上所述的任何方法。用例如PNG酶F处理经预处理的样品可以导致还原性寡糖释放至溶液中用于根据本发明方法用于捕获和操作。如此释放的寡糖基本上没有杂质羰基化合物。还可以如上所述在清除羰基化合物后通过其它酶如糖苷酶或利用化学反应实现还原糖的释放。
B.固相支持物
本发明的方法包括使还原糖固定至固相支持物。固相化学提供众多优势，如容易处理、纯化和浓缩固定的化合物。然而，可在溶液中进行的反应并不都能够在固相上开展。与固相支持物的连接赋予每一分子实体无穷大的尺寸。
这产生如此的影响，即分子在生物分子反应中的反应比相同分子在溶液中的反应大为缓慢。一些可以在溶液中以可接受的产率实施的反应将在固相支持物上完全不能开展。
术语“固相支持物”如本文中所用包括物理固体和不可溶多聚体、不可溶粒子、表面、膜和树脂，固相支持物优选地是不可溶多聚体、不可溶粒子、表面或树脂。
因此，“固相支持物”可以是不可溶无机基质(如玻璃)、不可溶多聚体(如塑料，例如聚苯乙烯)、由有机成分部分和无机成分部分组成的不可溶解的基质(例如某些杂合硅酸盐，如结构为R-Si-O-的化合物)、固相合成中常用的有机多聚体(聚苯乙烯、PEGA树脂、PEG树脂、SPOCC树脂及其杂合体)、聚乙二醇链(其可以在某些有机溶剂里溶解并通过添加其它溶剂变得不可溶)。固体还可以是金属(如金)、合金或组合物，例如铟锡氧化物或云母。
任何以上所列的固相支持物可以额外地用对糖具有亲和力的试剂包被，如不限于芳基代硼酸酯或其多聚体。此类包被物可以增加糖在固相支持物表面上的浓度、增强捕获速率和产率。
固相合成中使用的有机多聚体包括例如TentaGel(可从德国图宾根Rapp polymere商业地获得)、Ar-goGel(可从Argonaut Technologies Inc.，San Carlos，CA商业地获得)、PEGA(可从Polymer Laboratories，Amherst，MA商业地获得)、POEPOP(Renil等，1996，Tetrahedron Lett，37：6185-88；可从丹麦哥本哈根Versamatrixk获得)和SPOCC(Rademann等，1999，J.Am.Chem.Soc，121：5459-66；可从丹麦哥本哈根Versamatrix获得)。
在本发明的一个实施方案中，固相支持物是传感器，如表面声波传感器(如在Samoyolov等2002，J.Molec.Recognit.15：197-203中描述的任何传感器)或表面等离子共振传感器(如在Homola等，1999，Sensors andActua-tors B，54：3-15中描述的任何传感器)。此类固相支持物可以是有机材料如玻璃、金属如金、有机多聚体材料或其杂合体，并且可以由多种包被物如蛋白质或多糖、寡聚物(如树状聚体)或者多聚体(如聚丙烯酰胺或聚乙二醇)包被。在优选的实施方案中，固相支持物是玻璃或PEGA树脂。
在本发明的一个实施方案中，固相支持物与可以方便对固定化的还原糖定量的参考标准物偶联。特别地优选该参考标准物通过可切割接头(直接或间接地)连接至固相支持物上，这可方便对已固定和已释放的还原糖定量。在其中还原糖通过可切割接头固定至固相支持物的本发明实施方案中，优选参考标准物通过相同或相似的可切割接头固定至固相支持物。
参考标准物可以是任何的可检测化合物，例如参考标准物可以是或不是糖，然而它优选地是糖。
参考标准物的量可以变化，通常固相支持物可以包含每参考标准物20至500个、优选地50至200，如90至110个-NH2基。
B.间隔区
根据本发明，固相支持物任选地经间隔区偶联至接头。然而，本发明还包括固相支持物直接偶联至接头。
间隔区是长度在1至1000个原子的化学实体。优选地，所述的间隔区是线型的或分支的链和/或环结构。间隔区的性质可以是疏水的或亲水的或混合具有这两种特性。间隔区的基团包括在固相合成中和涉及检测经间隔区连接在固相支持物上的分子的珠上、孔内或载片上测定法中常用的分子。技术人员将能够容易地鉴定可用于特定固相支持物的间隔区。
间隔区优选地是烷基链(更优选地是C1至C1000烷基链)，其任选地可以是分支的，其中所述的烷基链任选地在一个或多个位置上被含有一个或多个B、O、N、S、P、Si、F、Cl、Br或I的基团取代。间隔区还可以含有一个或多个芳基残基，其任选地可以是分支的或以相同方式取代。在一个优选的实施方案中，间隔区选自酰胺和醚。因此，间隔区可以基本上由这样的链组成，所述的链含有一个或多个酰胺键(-CONH-)、一个或多个1，2亚乙基二醇(-CH2-CH2-O-)单元或这些单元与烷基链或芳基链的组合。
在本发明的一个实施方案中，间隔区优选地不包含伯胺或仲胺。在本发明的另一个实施方案中，间隔区内包含的任何胺均被加帽。
B.接头
本发明涉及在共价连接至包含捕获基团的接头的固相支持物上捕获还原糖。接头起到将以-NH2终止的捕获基团任选地经间隔区连接至固相支持物的作用。接头可以是任意的多种接头，如那些在固相有机合成中常用的接头。
接头可以是不可切割接头或是可切割接头。
不可切割接头可以例如是烷基、芳基、醚或酰胺，其中任何前述接头可以任选地被取代。例如任何前述接头可以任选地经杂原子取代或它们可以含有O-烷基、烷基、芳基或杂原子作为分支。在一个实施例中，接头包含PEG和/或聚酰胺或基本由其组成。
接头可以包含这样的位点，在该位点可以使反应发生以将含有捕获基团(包括已捕获的和已任选地经其它修饰的分子)的部分从间隔区和固相支持物中切下。此类接头称作可切割接头，并且在固相有机合成中广泛使用。可切割接头的实例是已知的，其中切割可以受亲电体、亲核体、氧化剂、还原剂、自由基、酸、碱、光、热或酶影响。
可切割接头可以例如是酸不稳定的(例如，如Rink，1987，TetrahedromLett.，28：387中所述的Rink酰胺和如Plunkett等，1995，J.Org.Chem.，60：6006-7中所述的无痕迹的甲硅烷基接头)、碱不稳定的(例如，如Atherton等1981，J.Chem.Soc.Perkin Trans，1：538中所述的HMBA)或光不稳定的(例如，如Homles等，1995，J.Org.Chem.，60：2318-2319中所述的2-硝基苄基型)。接头可以是对所开展的化学类型更为特异性和限制性的，如甲硅烷基接头(例如，如Boehm等，1996，J.Org.Chem.，62：6498-99中所述的以氟化物切割的那些甲硅烷基接头)、烯丙基接头(例如，Kunz等，1988，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，27：711-713)和保险扣磺酰胺接头(safetycatch sulfonamide linker)(例如，如Kenner等，1971，Chem.Commun.，12：636-7中所述)。可酶切割接头可以例如是在Reents等，2002，Drug Discov.Today，7：71-76中描述的任何可酶切割接头，或在综述Waldmann等，2001，Chem.Rev.101：3367-3396中描述的酶不稳定保护基团的任何官能化衍生物。热不稳定的接头可以是在Meng等，2004，Angew.Chem.Int.Ed.，43：1255-1260中描述的类型。
B.捕获基团
本发明的接头包含捕获基团，其中捕获基团包含至少一个-NH2基。在受欢迎的形式中，捕获基团以通过任选的基团R连接至接头的-NH2基终止。因此捕获基团优选地具有结构R-NH2。R可以是简单烷基、芳基或者取代的烷基或芳基。优选地，R应当含有直接连接至-NH2基的杂原子以产生接头-M-NH2型结构，其中M是杂原子(即不是碳原子)，M优选地选自N、O和S。其中M是杂原子的化合物尤其受到欢迎，如在接头-O-NH2、接头-NH-NH2、接头-CO-NH-NH2、接头-NH-CO-NH-NH2、接头-S(O)2NH-NH2和接头-S-NH2结构中。
A+B→C.捕获方法
还原糖的捕获通过捕获基团的-NH2基与所述还原糖的还原性末端即与醛基或半缩醛基反应完成。该反应可以在任何pH值、但是最适宜在pH2-9发生。方法可以包括添加一种或多种添加剂，如可以促进或有利地改变(例如化合物A，图1)还原糖的开链醛形式与还原糖的半缩醛形式间平衡的添加剂，其中优选开链醛形式。添加剂可以例如是金属离子、代硼酸酯或硅酸酯。捕获产生通过共价双键(显示为C＝N)连接至固相支持物上的类型，共价双键中的C衍生自糖部分并且N来自捕获基团。这种固定化糖还可以与其环状链形式处于平衡态，尤其当还原糖是吡喃糖时，随后固定化糖可以与其环状六元环形式处于平衡态(见例如图1的化合物C和C′)，但是当糖上的合适-OH基未被取代时，固定化糖还可以与其五元环形式处于平衡态。
捕获反应可以在任何有用的溶剂中开展。本领域普通技术人员将能够容易地确定对任意给定化合物A或B有用的溶剂。溶剂可以例如选自水、含水缓冲液、有机溶剂和混合的含水溶剂及有机溶剂。溶剂还可以是包含一种或多种添加剂如酸、碱、盐、二价金属阳离子、去垢剂、络合剂(包括形成包合配合物的分子如环糊精或杯芳烃)、螯合剂(例如EDTA)、硼酸酯、代硼酸酯或硅酸酯的任何前述溶剂。
在优选的实施方案中，调节添加至反应的固相支持物(图1的化合物B)量以致于存在相对于还原糖摩尔过量的捕获基团，优选地所述的过量是巨大的，如至少2倍，优选地至少5倍，更优选地至少10倍，如至少50倍，例如至少100倍或更多倍。该过量将确保更有效地捕获还原糖。
捕获反应可以在任何温度、优选地在温度范围0至100℃内开展。
C.洗涤
一旦通过与捕获基团反应将还原糖固定在固相支持物上(图1的步骤A+B→C)，可以洗涤固相支持物以除去非共价结合的材料。因此，当还原糖在包含其它化合物(特别是不包含-NH2反应基的其它化合物)的溶液中提供时，可以从该溶液中纯化还原糖。因此本发明包含提供处于非纯化形式如粗制细胞提取物等形式的还原糖。本发明还包括可以从纯化的或部分纯化的糖蛋白、糖脂或糖苷中通过酶如糖苷酶或酰胺酶的作用或通过化学试剂切割糖苷键产生还原糖。
技术人员将能够容易地鉴定对给定的固定化糖(化合物C，图1)合适的洗涤条件。洗涤可以用以上提及的任何溶剂完成，其中溶剂除包含去垢剂和变性剂之外还任选包含以上提及的任何添加剂。洗涤可以在任何温度、但优选地在温度范围0至100℃内开展。
C→D.加帽
与固定化糖(如图1的化合物C)偶联的固相支持物仍含有未反应的游离-NH2基并且可以接受增加其应用范围的独特操作。
在本发明的一个优选实施方案中，在使还原糖固定化后，未反应的-NH2基通过加帽剂如酰化剂(例如乙酸酐)或本领域众所周知的其它氮活性试剂在C中C＝N键不反应的条件下进行加帽。在加帽后，固相支持物将不再包含任何游离的氨基，但是仅加帽的氮原子(N(H)CAP)具有对亲电体极为微弱的反应活性。化合物C的加帽产物具有含-R-N(H)CAP基的通用结构D(见图1)，其中根据CAP基的结构，(H)可以存在或不存在。
因此，若使糖连接至固相支持物的C＝N键还原成-NH-，它将是序列R-NH-CH2-中形式上SP3-杂化的氮原子。因此，可以向该基团导入特异性反应，允许在还原糖处发生特异性和化学计量的反应。
优选地，加帽剂特异性地与剩余的-NH2基反应，基本上不与C＝N官能度反应。此类试剂在本领域是众所周知的并包括用于酰胺键形成的常用酰化剂，例如乙酸酐、其它的链烷酸酐、芳香酸酐(例如苯甲酸酐)、环酐(例如琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐)、其它活性酯如N-羟琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯和包括肽键固相合成在内的酰胺键形成中常用的多种活性酯。-NH2基可以备选地通过添加相应的游离酸和肽键形成中常用的原位活化剂如DCC加帽，由此原位产生活性酯。可以使用已知对-NH2基有活性的其它试剂，如烷基异硫氰酸酯(R-NCS)、芳基异硫氰酸酯(Ar-NCS)、烷基化剂R-L(其中L是通常来自系列Cl、Br、I、OS(O)2R′(其中R′可以是烷基或芳基)中的离去基团)、Michael受体如α-β不饱和羰基化合物(CHR＝CH-CO-，其中R可以是H、烷基或芳基或取代的烷基或取代的芳基)或α-β不饱和砜(CHR＝CHS(O)2R′或Ar，其中R可以是H、烷基或芳基或取代的烷基或取代的芳基)、磺化剂(如RSO2Cl)及其衍生物。以相似的方式，-NH2基可以通过与通式为RO-C(O)L的碳酸酯的活性酯反应加帽，其中L如上所述。
D→E.还原
在本发明优选的实施方案中，使用还原剂将连接糖至接头的C＝N键(例如图1的化合物D)还原。C＝N键可以通过众所周知的众多还原剂还原，还原剂优选地能够使双键饱和，同时将氢原子安置在N上。
包含BH键的硼烷或氢硼化物是特别有价值的，实例包括NaBH4、NaCNBH3和BH3络合物如BH3-吡啶、BH3-二甲硫醚等。还可以使用具有结构R3SiH的硅烷，如包含SiH键的硅烷，如可以使用氢转运剂，如二亚胺或均相氢化催化剂或包含金属-H键的氢化催化剂。
还原产生了含有结构为糖CH-NH-的活性糖，该活性糖优选地通过接头和任选的间隔区连接至固相支持物。通常，若还原糖是醛，则还原将产生结构为糖CH2-NH-的化合物。若还原糖是酮，则还原将产生结构为糖CH-NH-的化合物。
还原的产物是例如含有形式上SP3杂化的N原子的通用结构E(图1)。
C→Cred→E
在本方法的另一个优选实施方案中，使加帽和还原的顺序颠倒。化合物C(图1)中C＝N键的还原可以通过以上D→E中所述的任何试剂实施以产生结构为Cred的化合物(图1)。还原还可以在原位上开展，这意味着还原剂(如NaCNBH3)可以同时与还原糖一起添加至固相支持物(例如化合物B)以致还原C＝N键，产生Cred。因此，本发明包括可以将包含还原糖的样品与固相支持物和还原剂同时温育。因此，C＝N键的还原(步骤v)将在还原糖与固相支持物的-NH2基起反应(步骤iii)后立即开展。Cred中的游离-NH2基随后可以使用以上C→D中所述的任何试剂在不引起与糖CH-NH-部分起反应的条件下加帽。特别地，在本发明的该实施方案中，优选加帽剂相对于仲胺优先与伯胺反应。还优选调节反应温度和时间使得相对于仲胺优先与伯胺反应。实际上，与氨基反应的所有化合物与伯胺的反应比与更高程度取代的氨基的反应更快，而当此化合物是空间体积巨大时，例如是活性苯甲酰酯、异丙醇酸(isopropanoic acid)活性酯、新戊酰活性酯、Boc酐或Boc-氮化物等情况更是如此。用于相对于仲胺优先与伯胺反应的有用化合物和条件在Greene等1999，Protective Groups in Organic Sythesis，第三版，第七章，第503-653页中描述。其它特别优选的加帽剂是NHS-酯或立体阻碍的五氟苯酯(PFP)或四氟苯酯(TFP)。
E→F.添加TAG
通过以上两个途径之一得到的图1化合物E含有如此的固体，其与具有对亲电体极微弱反应性的加帽的氮原子(N(H)CAP)和糖CH2-NH-R序列中形式上SP3-杂化的氮原子连接。E与合适的氮活性官能团(氮活性官能团优选地是温和亲电体)的反应因此导致亲电体排它地或几乎排它地添加至有效地添加分子结构(本文中描述为“TAG”)的SP3氮原子上，或将另一种衍生剂添加至与糖连接的氮原子上。添加TAG的产物显示为图1中的F。
本描述中通篇使用术语“氮反应基”以描述对形式上SP3杂化的氮原子的反应性，所述氮原子位于如结构为R-NH-R′的化合物中，例如胺，其中R和R′独立地为烷基或芳基(任选地被取代)，或位于化合物内，其中R′具有连接至-NH-的杂原子(如O或N)，如在羟胺衍生物(R-NH-OR′)或肼衍生物(R-NH-NH-R′)中。
衍生剂(例如TAG)的身份，即衍生剂的特定化学结构可以由使用者选择。为添加至E中的SP3氮上，衍生剂(例如TAG)自身应当包含在图1中命名为“X”的氮活性官能团，TAG优选地应当含有亲电体，或连接在氮活性官能团X上。衍生剂优选地具有TAG-X的通用结构(见图1)，其中X是氮活性官能团。X优选地是与SP3氮原子反应的任何温和亲电体，但优选地是与存在于糖上的-OH基起微弱反应的温和亲电体。此类温和亲电体包括异硫氰酸酯(TAG-NCS)、活性酯(TAG-C(O)-L)(其中L是在酰胺键形成中如在肽键的合成中常用的离去基团)、可以通过在酰胺键形成中如在肽键合成中常用的方法原位活化成为活性酯的羧酸(TAG-COOH)、烷基化剂(TAG-L)(其中L优选地但不排它地来自系列Cl、Br、I、OS(O)2R(其中R可以是烷基或芳基)中的离去基团)、包含Michael受体(通常含有序列-CR＝CH-C(O)-)或者α-β不饱和砜(-CR＝CH-S(O)2-)的TAG及其以上所提及任何TAG的衍生物、可以通过还原性胺化作用与糖CH2-NH-氨基起反应的醛或酮，或者取代的卤芳族基团(其中芳环携带负电基团如硝基，例如在Sanger试剂1-氟-2，4-二硝基苯或4-卤-7-硝基-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)试剂中的硝基，其中卤素优选地是F或Cl)。
TAG可以例如是荧光部分、质谱分析性TAG(mass spectrometryTAG)、能够结合至第二结合配偶体的第一结合配偶体、核酸，其中任何前述TAG优选地包含或连接至氮活性官能团上。具体而言，TAG特别可以是以下更详细加以描述的任何TAG，其中任何这些TAG可以连接至任何前述氮活性官能团上。
可以通过将TAG添加至化合物E而获得的化合物的实例显示为图1中的F。
F.洗涤
在一个实施方案中，在任何其它操作前洗涤标记的糖(例如化合物F，图1)。因此，除去任意量的未结合TAG。因为标记的糖固定在固相支持物上，故洗涤可以轻易地完成。
洗涤后，仅存在共价结合的TAG。因此，TAG的量将与固定化糖的量相关。因此，通过测定TAG的存在，可以测定固定化糖的量。若给定样品中的全部还原糖基本上被固定，则因此本方法在一个方面允许测定样品中存在的还原糖的量。
技术人员将能够容易地确定对于给定的标记的固定化糖(例如化合物F，图1)合适的洗涤条件。洗涤可以例如用选自水、含水缓冲液、有机溶剂以及混合的含水溶剂和有机溶剂的溶剂完成。溶剂还可以是包含如盐、二价金属阳离子、去垢剂、络合剂(包括形成包合配合物的分子如环糊精或杯芳烃)、螯合剂(例如EDTA)、硼酸酯、代硼酸酯或硅酸酯的一种或多种添加剂的任何前述溶剂。此外，溶剂可以任选地包含去垢剂和变性剂。洗涤可以在任何温度、优选地在温度范围0-100℃内开展。
H.可切割接头的切割
当使用的接头是可切割接头时，则本发明的方法可以包括切割所述的可切割接头释放已捕获糖的步骤。切割优选地在添加衍生剂如(使用TAG-X添加的)TAG或(使用X-连接索-Y添加的)连接索-Y至固定化糖的-NH-基后开展。因此，标记的糖(图1中的化合物G或化合物J)可以分别从F或从I中释放至溶液。G由氮原子(连接在切割后仍保留的接头残基(如果存在)上)上携带TAG的糖部分组成并且出于简便目的称作糖-TAG。J由氮原子上携带连接索的糖部分组成，其中所述氮原子连接在切割后仍保留的残基(如果存在)上。连接索可以任选地与TAG连接。
然而，可切割接头可以在本方法中在任何需要的时间切除。
若添加至化合物E的TAG具有有益的光谱特性，如荧光特性，则糖-TAG(化合物G，图1)的量可以在溶液中定量。此外，糖-TAG(化合物G，图1)可以进行分析性分离如HPLC或CE处理，并且若存在一种以上的糖，则可以分离单个成分、测定它们的相对比例，并且若可获得可靠标准物，则可以鉴定这些单个成分，并且可以对它们定量。还可以使用它们作为可以结合识别糖的蛋白质的配体，因而提供糖或蛋白质的结构上的信息。
若TAG是如此的结构，即其因增加的敏感性、简化光谱解释或允许使用同位素编码开展差异性分析而产生有益于实施质谱分析法的糖-TAG特性，则可以有益地通过质谱分析法分析释放至溶液的糖-TAG。
F.具有光谱特性的TAG
在本发明的一个优选实施方案中，添加至例如化合物E或化合物H的TAG具有有益的光谱特性。优选地，具有有益光谱特性的TAG利用结构为X-TAG的衍生物添加至例如化合物E，其中X是氮活性官能团，如在上文“E→F添加TAG”部分中所描述的任何氮活性官能团。有益的光谱特性意指TAG可以方便地例如通过光谱测定法可见。因此TAG可以是光谱可检测的。在优选的实施方案中，TAG是荧光TAG。此类标记的实例包括与异硫氰酸酯(例如FITC、TRITC)、活性酯、Michael受体、α-β不饱和磺酰(具体地是乙烯基磺酰)和烷基化剂如卤代烷和甲苯磺酸酯、卤-芳基化合物例如Sanger试剂的反应。
添加如此TAG的产物(例如图1的化合物F)可以吸收和再发射可以检测的光。存在于F上的此类TAG的数目将反映添加至B并被捕获以产生C的糖分子A的数目。样品中最初的还原糖分子(A)的数目因此可以通过化合物F的荧光进行估计，只要提供的固相支持物(化合物B)包含过量的捕获基团即可。还可以使用除荧光分子以外的TAG。这些TAG包括放射TAG、磷光TAG、化学发光TAG、紫外吸收TAG、纳米粒子、量子点、有色化合物、电化学活性TAG、红外活性TAG、在Raman波谱学或Raman扫描中具活性的TAG、通过原子力显微镜可检测的TAG或包含金属原子或金属原子簇的TAG。
如果化合物F的固相支持物是传感器，如表面声波传感器或表面等离子共振传感器，则添加特异性结合至TAG的如此类型传感器可以引起与TAG成正比并因此与糖分子数目成正比的信号产生。一个实例是当TAG是生物素残基时，该残基通常通过与生物素活性酯起反应而导入。当TAG是生物素残基时，向化合物E添加抗生物素蛋白-蛋白质可产生容易地由传感器检测并报告的信号。可以用于检测第二结合配偶体对固定化TAG结合的传感器的其它实例包括但不限于压电传感器、电流分析传感器、表面等离子荧光光谱传感器、双偏振极化干涉测量(DPI)传感器、波长查询光学传感器(WIOS)(wavelength-interrogated optical sensors)、阻抗传感器、波导光栅耦合传感器(optical waveguide grating coupler sensors)、声波传感器(acoustic sensors)和量热传感器。
一旦糖已经连接在具有光谱特性的TAG上，则可以测量该光谱特性。可以对仍固定在固相支持物上的糖(如对图1的化合物F或I)或对释放至溶液内的糖(例如对图1的化合物G或J)测量光学特征。后一种情况需要接头是可切割接头。取决于具有光谱特性的TAG的性质，光学特征可以使用常规方法如光谱测定法测定。本发明的方法因此可以包括通过光谱测定法检测连接在糖上的TAG的步骤。
F.质谱分析性TAG
在本发明的一个实施方案中，TAG是质谱分析性TAG。质谱分析性TAG优选地通过结构为X-TAG的试剂添加，其中X是氮活性官能团，如上文“添加TAG”部分中提及的任何氮活性官能团。术语“质谱分析性TAG”如本文中所用指这样的分子，其改善了通过质谱分析法对产物的检测和结构表征，优选地在产物从固相支持物上切下后(如上文“可切割接头的切割”部分中所述)。实例包括导入在质谱中赋予特征性同位素模式的溴标记物。可以如此添加溴标记物，例如通过向化合物E添加对-溴苯基异硫氰酸酯，产生其中TAG含有溴原子的结构F化合物。在糖的质谱测定法中含溴标记物的用途已经在例如Li等，2003，Rapid.Commun.MassSpectr.，17：1462-1466中描述。另一个实例包括导入这样的分子，即其赋予正电荷或负电荷，用于质量/电荷分离的阳离子模式或阴离子模式下增强检测。另一个实例包括导入如此的分子，即其改善电喷雾、MALDI或质谱分析法实施中常见的其它离子化技术的性能和敏感性。又一个实例包括导入如此的稳定同位素标记的分子，该分子允许标记的物质通过质谱分析定量。对同位素标记的有用方法例如在Tao等，2003，Current Opinion inBiotechnology，14：110-118中综述。
一旦糖已经连接在质谱分析性TAG上，则可以通过质谱分析法检测标记的糖(F或G或I或J，图1)。质谱分析法可以在仍固定于固相支持物上的糖(如对图1的化合物F或I)上开展，但优选地在例如通过可切割接头的切割释放至溶液内的糖(例如对图1的化合物G或J)上开展。因此优选接头是可切割接头。技术人员将能够根据质谱分析性TAG的性质开展合适的质谱分析法。本发明的方法因此可以包括通过质谱分析法检测连接在质谱分析性TAG上的糖的步骤。
F.结合配偶体TAG
在本发明另一个优选的实施方案中，TAG是能够与第二结合配偶体特异性相互作用的第一结合配偶体，其中所述第一结合配偶体通过与结构为X-TAG(其中X是氮活性官能团)的试剂(例如“衍生剂”)反应而添加至例如化合物E(或化合物H)。第二结合配偶体优选地用可检测标记物如染料、荧光标记物、放射性同位素、重金属或酶标记。第一结合配偶体可以例如是作为蛋白质的配体的分子，其中所述蛋白质用于化学计量地或扩增后检测所得到的固定化配体。第一结合配偶体还可以是蛋白质，并且第二结合配偶体是该蛋白质的配体。
结合配偶体的实例包括在ELISA测定法中常用的配体-蛋白质对。例如化合物E可以与生物素化试剂反应，并且在洗涤后，用经可检测标记物如荧光TAG、放射性同位素或重金属直接标记的链亲和素(或其它抗生物素蛋白)，或用缀合于可催化化学反应(导致产生可由光谱测定法检测的信号)的酶如辣根过氧化物酶的链亲和素(或其它抗生物素蛋白)对现在已固定化的生物素检测。
结合配偶体的其它实例是抗体-表位对。因此，一种结合配偶体可以包含表位而另一种结合配偶体可以是能够以高亲和力结合该表位的抗体，优选地是特异性结合该表位的抗体。
F.核酸TAG
在本发明另一个实施方案中，TAG是核酸。本发明的核酸可以是任何核酸，如DNA或RNA，或其类似物，如LNA、PNA、HNA等。核酸优选地是DNA，优选地是DNA寡聚物。优选地，该DNA用氮活性官能团，如上文“添加TAG”部分中提及的任何氮活性官能团加以衍生化。优选该核酸TAG的序列是已知的或至少是部分已知的，这将使技术人员能够使用标准方法容易地检测该TAG。
核酸TAG可以具有任意所需要的长度，优选地至少具有允许进行特异性检测的长度。因此，核酸优选地长至少6个核苷酸、更优选地长至少10个核苷酸，例如在10至5000个核苷酸范围内。
在向糖添加氮活性的核酸TAG后，则核酸如DNA寡聚物随后可以通过与它们互补的或基本互补的核酸杂交在固相支持物上直接检测到。基本互补的核酸意指这样的核酸，其可以与给定核酸在严格条件下杂交，如在Sambrook等，1989，″Molecular Cloning/A Laboratory Manual″，ColdSpring Harbor中所述的严格景件下杂交。优选地，所述的互补核酸可以连接在可检测的标记上。这种可检测的标记可以是荧光标记物或放射同位素或酶，优选地是荧光标记物。因此，核酸TAG可以例如通过与它们互补的荧光标记DNA杂交加以检测。备选地，核酸TAG可以使用本领域已知的常规方法如聚合酶链式反应或连接酶链式反应进行扩增。因此，固定化的核酸TAG可以接受PCR反应以扩增固定化的DNA寡聚物，该DNA寡聚物可以在溶液中通过多种在PCR中用于扩增的众所周知的技术进行测量。该方法特别用于对存在于固相支持物上的极少量的糖CH-NH-接头-间隔区-固体的间接检测和定量。备选地，与DNA结合的糖可以通过接头切割释放至溶液，并随后例如通过PCR在溶液中扩增或通过与基本互补的核酸杂交在溶液中检测。
E→H连接索
本发明的衍生剂还可以是与至少两种官能团偶联的连接索。此双功能试剂的结构通常是X-连接索-Y或X-连接索-Yp，其中X是氮活性官能团并且Y是第二活性官能团，Yp是潜活性官能团或受保护的反应基Y。化合物E与X-连接索-Y(或X-连接索-Yp)反应的产物可以例如具有图1化合物H的通用结构。第二活性官能团Y可以与固相合成中任何类型的试剂反应。例如糖CH-NH-接头-间隔区-固体中的N可以与双功能试剂(X-连接索-Y)反应，其中一个功能团通过与固定化的氮(氮活性官能团X)成键而反应，而另一个功能团可以是或者可以(例如通过去掩蔽、脱保护或其它反应)转换为第二活性官能团Y。
连接索可以是任何有用的连接索，例如烷基、链烯基或炔基(其可以是线型的、分支的或环状)、芳基或包含酰胺键(NC(O)R)或1，2-二亚乙醇基(-CH2CH2-O-)或以杂原子取代的任何前述基团或其衍生物。
第二官能反应基Y可以选自硫醇、羧基、活化的羧基、二硫化物、活化的二硫化物、烷基化剂、烯、炔、醛、酮和氮化物。烷基化剂可以是例如卤代烷或α-卤羰基。Yp可以是例如受保护的胺或前述任何基团Y的受保护的衍生物。因此，Yp可以例如选自受保护的胺、受保护的硫醇、受保护的羧基、受保护的醛和受保护的酮。受保护的反应基在本文总称作Yp，其中可以使Yp脱保护以产生官能反应基Y。有用的保护基可以在Greene等1999，“Protective Groups in Organic Sythesis”，第三版，John Wiley andSons，New York中找到，具体而言用于羰基(第4章，第293-368页)，用于羧基(第5章，第369-453页)，用于硫醇(第6章，第454-493页)及用于氨基(第7章，第494-653页)。受保护胺的实例包括但不限于在固相肽合成中常用的那些，如Fmoc、Boc、Alloc、对-硝基苄氧羰基、三苯甲基和取代的三苯甲基、邻-硝基苄氧羰基、N-氧硫基或叠氮基。然而，第二活性官能团可以是已经在固相上反应的任何官能团Y或受保护的官能团(Yp)，如固相合成以及小分子与固相支持物和表面偶联领域内众所周知的实例。这些官能化的基团随后可以直接捕获或对活性基脱保护后捕获包含能够与第二官能团Y反应的官能团(Z)的第二衍生剂。
如果化合物H中的Y含有NH2基或在脱保护时可以使Y变得含有NH2基，则可以使用E至F中所述的任何胺活性试剂(例如异硫氰酸酯)以添加TAG至具有通用结构I(图1)的产物化合物。
使得与化合物H(图1)中的任何官能团Y反应的第二衍生剂可以例如是光谱TAG或以上在E→F部分中提及的任何TAG，其中该TAG而非氮反应基包含能够与Y反应的官能团(Z)或用该官能团进行衍生化。它们还可以是小分子，如药物、显像剂、肽、蛋白质、酶和显示生物学活性的其它分子、核酸如DNA或RNA。
所述的小分子、显像剂、肽或核酸优选地包含能够与给定的第二官能反应基Y反应的官能团Z或与该官能团连接。技术人员将能够容易地确定有用的官能团Y和Z。第二衍生剂还可以是在以上“具有光谱特性的TAG”、“质谱分析性TAG”、“结合配偶体TAG”和“核酸TAG”部分中描述的任何上述TAG，其中所述TAG而非氮活性官能团含有能够与官能团Y反应的官能团Z。连接在H(图1)的连接索上的官能团还可以是潜基团或受保护的基团(Yp)，其可以通过化学反应或酶反应转换成Y，随后Y进一步如上所述发生反应。如果该潜基团可以转换成伯胺或仲胺(即Y包含结构-NH2或-NH-)，则可以添加以上E→F中所述的任何胺活性基以便产生具有结构I的标记化合物。
因此，本发明的方法包括步骤：
vii.将活性糖的-NH-基与X-连接索-Y或X-连接索-Yp结构的双功能试剂反应，其中X是氮活性官能团并且Y是第二活性官能团并且Yp是可以转换或脱保护成为活性官能团Y的潜官能团，由此得到共价连接至所述连接索-Y或所述连接索-Yp上的糖。
此步骤优选地使用图1的化合物E作为起始材料实施，因此该步骤可以例如产生具有图1的通用结构H的化合物。
在其中双功能试剂结构是X-连接索-Yp的本发明实施方案中，本方法优选地还包括使Yp转换或脱保护以得到活性官能团Y的步骤。此步骤可以在X与-NH-反应之前或之后开展，该步骤优选地在X与-NH-反应之后开展。
此外，本发明的方法可以还包括步骤：
viii.提供包含能够与Y反应的官能团(Z)的第二衍生剂，
ix.使官能团Z与Y反应，由此第二衍生剂经连接索和第一衍生剂共价连接至糖上。
备选地，本发明的方法还可以包括步骤：
viii.提供选自真核细胞、原核细胞、微生物、微团、噬菌体、病毒粒子和纳米粒子的粒子，其中粒子包含能够与Y反应的官能团(Z)，
ix.使官能团Z与Y反应，由此粒子经连接索和试剂共价连接至糖上。
因此步骤ix可以产生在图1中概述的通用结构I化合物，其中TAG是粒子。假如接头是可切割接头，本方法还可以包括切割接头由此产生图1的通用结构J化合物的步骤。
糖CH-NH-接头-间隔区-固体(例如图1的化合物E)与双功能试剂X-连接索-Y反应的产物例如具有通用结构H并且可以含有或可以使其含有其它反应基，所述的其它反应基可以与大于分子的装配物：例如细菌、噬菌体、酵母、微团、病毒、纳米粒子或者真核细胞或原核细胞形成共价键。随后切割接头产生通式为糖CH-N(装配体)-接头的物质，有效地将糖添加至装配体。因此，原则上糖可以从固相支持物转移至该装配体。
酶处理
若固相支持物是生物相容的，即允许与生物学大分子如酶接触而不显著改变生物学大分子的活性，则固定化的糖分子可以受到可改变糖分子结构的酶作用。固定化的糖分子可以是例如具有图1的通用结构C、Cred、D、E、F、H或I的任何化合物。
生物相容的固相支持物的非限制性实例包括玻璃、PEGA、SPOCC或多糖凝胶。在该实施方案中，优选接头是相对长的，并且因此优选接头包含至少2个原子、优选地是至少6个原子，接头更优选地包含至少6个原子的链，例如在接头中最长的原子链长度是至少6个原子，如在6至1000个原子长度范围内。还优选接头是亲水性的。
还可以使通过可切割接头的切割释放至溶液的糖如图1的化合物G或J与生物学大分子如酶接触。
酶可以属于可作用于糖的任何类别，如糖苷酶、糖基转移酶、以及通过酰化、磷酸化、硫酸盐化作用或氧化修饰醇基的酶。备选地，如果糖已经在-OH上被取代，如酰化、磷酸化、硫酸盐化，则脱酰酶、磷酸酶和硫酸酯酶可以改变糖的结构。因此，本发明的方法还可以包括使糖(例如图1中任何化合物C、Cred、D、E、F、G、H、I或J)与一种或多种选自糖基转移酶、硫酸酯酶、磷酸化酶、磺基转移酶、磷酸转移酶、糖苷合成酶和转糖苷酶的酶接触由此将该糖转换成新结构的步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括使糖(例如图1中任意的化合物C、Cred、D、E、F、G、H、I或J)与一种或多种糖苷酶接触由此产生新的还原糖的步骤，条件是最初的糖是所述糖苷酶的底物。
实例包括使仍含有游离-NH2基的未加帽的糖-C＝N-接头-间隔区-固体(例如图1的化合物C)与引起糖长度减少一个单糖残基的外切糖苷酶温育。切割单糖残基留下连接至固相支持物上的少一个单糖单位的寡糖，并产生可以通过相同或不同固相支持物(如图1中具有通用结构B的固相支持物)捕获的还原糖，该还原糖随后可以接受以上B至J中所述的任何操作处理。
因此，本发明的方法还包括步骤：
a)提供可以作用于糖的一种或多种酶，
b)使糖与所述的一种或多种酶接触。
这些步骤可以在此方法期间的任何特定时间上开展。酶可以是本部分所述的任何酶。
在特定的实施方案中，酶是糖苷酶并且在上文简述部分中描述的方法包括额外的步骤：
iii.a)提供可以作用于糖的一种或多种糖苷酶，
iii.b)使糖与所述的一种或多种糖苷酶接触，由此产生新的还原糖，条件是最初的糖是所述糖苷酶的底物，
iii.c)使新生成的还原糖固定在固相支持物上。
步骤iii.a-iii.c可以在上文“发明简述”部分中所概述的方法中的步骤iii后开展。然而，步骤iii.a至iii.c还可以在所述方法中的步骤iv、v、vi或vii的任何步骤后实施。因此。步骤iii.a-iii.c可以在图1的结构C、Cred、D、E、F、H或I所示例的任何固定化糖上实施。
特别地，所述的新生成的还原糖可以固定在相同固相支持物的游离-NH2基上或固定在其它固相支持物上。所述的其它固相支持物可以例如是非取代的或携带固定化的参考标准物。优选所述的其它固相支持物是如本文如上所述的固相支持物并且该固相支持物(任选地经间隔区)连接至接头，其中所述的接头包含捕获基团(详见上文对接头、捕获基团和间隔区的描述)。
为了得到结构信息，在相同或不同的固相支持物上还原并且荧光标记糖苷酶产物和已释放的单糖特别有价值。具体实例包括在结构B的NH2-接头-间隔区-固体(图1)上捕获Gal-GlcNAc-Gal-Glc(乳-N-四糖，LNT)，将捕获并固定的LNT(图1结构C化合物的实例)与β-半乳糖苷酶温育，随后在相同固相支持物(C)上捕获已释放的半乳糖以产生未反应的Gal-GlcNAc-Gal-GlcC＝N-接头-间隔区-固体和反应产物的混合物，其中所述反应产物是GlcNAc-Gal-GlcC＝N-接头-间隔区-固体和Gal-C＝N-接头-间隔区-固体。如以上步骤F→G中所述加帽、还原、用TRITC加以荧光标记并从固相上切下则可以通过三糖产物和单糖产物与已知标准物的共迁移证实固定的LNT具有末端β-半乳糖残基。
本领域中描述了众多有用的糖苷酶，例如在US 5,100,778或WO92/19974中描述的任何糖苷酶可以用于本发明。
如果固相支持物是生物相容的，则糖-C＝N-接头-间隔区-固体(例如化合物C，图1)中未反应的-NH2基可以加帽(例如如以上C→D中所述用乙酸酐加帽)并且随后与有糖活性的酶接触，或进一步还原为糖CH-NH-接头-间隔区-固体(例如以上D→E部分中所述)并且随后与有糖活性的酶接触。备选地，图1的化合物C可以还原为Cred并且随后与有糖活性的酶接触。糖CH-NH-接头-间隔区-固体(例如化合物E，图1)可以进一步经标记(如上文E→F部分中所述)以产生糖CH-N(TAG)-接头-间隔区-固体(例如化合物F，图1)，并且随后与有糖活性的酶接触。在任何这些方法中，仍连接在固相支持物上的酶反应产物可以根据本发明方法经进一步操作或通过在接头处的反应加以切除，用于其它分析。在切割固定化糖的片段中所产生的任何酶反应产物将在溶液中出现，在溶液中所述的酶反应产物可以使用已经建立的分析化学技术进行研究，或当酶反应产物本身是还原糖的情况下，可以对其进行对于图1中同属糖A所描述的操作处理。
单个的糖可以通过毛细管气相色谱(GC)、微柱超临界流体色谱(SFC)、微柱液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、离子交换层析或质谱分析法检测。单个糖的检测可以在用衍生剂标记之前或之后于溶液中或在固相上完成。
检测剂
在本发明的一个实施方案中，本方法包括步骤：
Viii.使糖与能够同该糖结合的检测剂接触，
ix.检测该检测剂。
优选地，该糖如上文所述固定在固相支持物上，并且因此图1中通用结构C、Cred、D、E、F、H或I的化合物可以与该检测剂接触。还可能所述的糖已经通过可切割接头的切割从固相支持物上释放，因此通用结构G或J的化合物也可以与该检测剂接触。
检测剂可以是能够与所述糖结合的任意试剂。优选的检测剂是这样的化合物，其与所述糖结合的亲和力远比任何其它化合物与该糖结合的亲和力高，如对糖具有比任何其它化合物高至少2倍，如至少5倍亲和力的化合物。
此外，优选该检测剂是通过技术人员已知的方法可直接或间接检测的。检测剂本身可以例如是荧光化合物或有色化合物。检测剂还可以是对于其可获得便利检测方法的化合物。
在本发明的一个实施方案中，检测剂包括芳基代硼酸酯或杂芳基代硼酸酯，其中芳基部分用光谱性反应基如荧光TAG或上文“F.具有光谱特性的TAG”部分中所述的任何其它可检测TAG取代。
在另一个实施方案中，检测剂是多肽，优选地是选自凝集素、选择素和任何其它结合糖的蛋白质、毒素、受体、抗体和酶的多肽。当检测剂是多肽时，该多肽可以与可检测标记物如酶或荧光化合物偶联。多肽还可以借助抗体或类似高亲和力化合物加以检测。
实施例
如下是本发明方法的说明性实施例并且不得被认为是限制本发明。除非从上下文中明示，大写字母A、B、C、Cred、D、E、F、G、H、I和J指图1中概述的通用结构。
实验
1.A的实施例：本发明中使用的还原糖
通过固相支持物B所捕获还原糖的结构示于图2。这些结构包括单糖D-Glc(1)和D-Gal(2)、二糖N-乙酰基乳糖胺(LacNAc，3)、三糖麦芽三糖(麦芽三糖G3，4)和四糖乳-N-四糖(LNT，5)。样品6和7分别含有比例为2∶3∶1和1∶3∶2的单糖Fuc∶Man∶GalNAc的混合物。样品8含有Gal(2)和LNT(5)的1∶1混合物。样品9含有大体等摩尔的麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)的混合物。样品10由通过PNG酶F(产品编号1365177，Boehringer MannheimGmbH，Germany)作用于核糖核酸酶B(Sigma)释放的N-连接寡糖链组成。
2.接头、间隔区和标记的-糖参考标准物
2.1接头和间隔区
可切割接头的合成和间隔区的结构示于图3并描述如下。
12：N-Fmoc-4-氨氧基甲基-苯甲酸
向4-氨氧基甲基-苯甲酸、二噁烷(20ml)中的氯化氢11(本材料如先前Deles，J.等；PJCHDQ；Pol.J.Chem.；EN；53；1979；1025-1032所述制备)(2.0g，0.010摩尔)和半饱和Na2CO3溶液(20ml)的溶液添加Fmoc-Cl(2.8g，0.011摩尔)并搅拌混合物2小时。添加乙酸乙酯(100ml)并通过小心添加HCl(浓的)调节水相的pH至1-3。混合物倾倒至分液漏斗并分离有机相，用水洗涤一次(100ml)，经Na2SO4干燥并在旋转蒸发器上除去溶剂以产生静置时固化的油。粗制产物通过快速柱层析(石油醚、乙酸乙酯、AcOH60∶40∶1)纯化。产率：3.5g(92％)1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝4.05(1H，t，J＝6.3Hz)、4.27(2H，d，J＝6.3Hz)、4.51(2H，s)、7.08-7.22(6H，m)、7.46(2H，d，J＝7.4Hz)、7.66(2H，d，J＝7.1Hz)、7.72(2H，d，J＝8.4Hz)、10.29(1H，br.s)、12.78(1H，br.s)。13C-NMR(63 MHz，DMSO-d6)δ＝47.04、66.03、76.91、120.51、125.41、127.45、128.03、128.89、129.33、129.63、130.82、141.19、144.01、157.12、167.48。MS(ES)m/z＝389(MH+)。
13：N-Fmoc-4-氨氧基甲基-苯甲酸(12)与溴乙酸叔丁酯的反应
N-Fmoc-4-氨氧基甲基-苯甲酸(12)(1.0g，2.57mmol)溶解于DMF(15ml)并且添加Cs2CO3(0.42g，1.28mmol，Aldrich)，随后在室温搅拌5分钟。添加溴乙酸叔丁酯(0.55g，2.28mmol，Fluka)并加热混合物至50℃，维持30分钟，并随后再次冷却至室温。添加CH2Cl2(70ml)并且混合物倾倒至分液漏斗，用半饱和NaHCO3溶液洗涤(3×50ml)，随后用水洗涤(2×50ml)，经MgSO4干燥。在减压下除去溶剂以产生作为油的粗制产物。在快速柱层析(石油醚中的20-40％乙酸乙酯)后，得到产率为1.15g(89％)的白色固体。1H-NMR(250 MHz，CDCl3)δ＝1.37(9H，s)、4.06(1H，t，J＝6.7Hz)、4.37(2H，d，J＝6.7Hz)、4.61(2H，s)、4.67(2H，S)、7.11-7.18(2H，m)、7.22-7.27(4H，m)、7.43(2H，d，J＝7.5Hz)、7.60(2H，d，J＝7.3Hz)、7.75(1H，s)、7.93(2H，dd，J＝1.7Hz，6.6 Hz)。13C-NMR(63 MHz，CDCl3)δ＝26.31、45.28、59.95、65.52、75.99、80.84、118.30、123.27、125.41、126.10、126.93、127.23、128.30、139.29、139.58、141.73、155.70、163.94、165.15。MS(ES)m/z＝542(MK+)。
14：接头的制备
前面实验中得到的白色固体13(1.15g)在CH2Cl2(30ml)中的50％的CF3CO2H溶液内搅拌3小时并蒸发至干燥。油性残余物溶解于少量乙酸乙酯内并且通过向溶液缓慢添加己烷使产物沉淀成精细白色固体。产物经过滤并用己烷洗涤两次并在真空下干燥以几乎定量的产率(1.0g，98％)产生需要的产物。1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝4.07(1H，t，J＝6,3Hz)、4.28(2H，d，J＝6,3Hz)、4.53(2H，s)、4.62(2H，S)、7.07-7.14(2H，m)、7.17-7.26(4H，m)、7.46(2H，d，J＝7.4Hz)、7.66(2H，d，J＝7.2Hz)、7.77(2H，d，J＝8.3Hz)、10.30(1H，br.s)。13C-NMR(63MHz，DMSO-d6)δ＝47.04、61.62、66.04、76.79、120.50、125.41、127.46、128.03、129.05、129.69、141.19、142.20、144.00、157.12、165.50、169.47。MS(ES)m/z＝446(M-H+)。HRMS(ES)计算质量(C25H2INO7Na+)：470.1210观察质量：470.1224。
2.2四甲基罗丹明(TMR)-标记的通用结构G单糖标准物的合成
使用8种单糖D-Glc、D-Gal、D-Man、D-Xyl、D-GlcNAc、D-GalNAc、L-Fuc和D-GlcA。通用合成方案对D-Gal(2)示于图4，并且产物21的结构示于图4并缩写为如所示的GalCH2-N(R)-TMR。制备的全部8种糖CH2-N(R)-TMR单糖衍生物的结构示于图5。
16：N-Fmoc-4-氨氧基甲基-苯甲酸(12)与溴甲基苯的反应
N-Fmoc-4-氨氧基甲基-苯甲酸(12，2.0g，5.14mmol)溶解于DMF(30ml)并且添加Cs2CO3(0.84g，2.57mmol)，随后在室温搅拌5分钟。添加溴甲基苯(1.05g，6.17mmol)并允许混合物在室温继续搅拌30分钟。添加水(200ml)并且用CH2Cl2萃取混合物(2×100ml)，汇合的有机相用水洗涤(3×50ml)，经MgSO4干燥，蒸发至干燥以产生用于下步实验中的无需进一步表征的油。
17：从苄基-(N-Fmoc-4-氨氧基甲基)-苯甲酸酯中除去Fmoc基团
前面实验中得到的粗制产物(16)与DMF(20ml)中的20％哌啶一起搅拌1分钟，并经过硅胶床以通过吸取除去大部分的DMF和哌啶。产物用乙酸乙酯和石油醚(1∶1)的混合物从硅胶床洗脱并在旋转蒸发器上浓缩。通过快速柱层析(乙酸乙酯，石油醚1∶1)完成再纯化产生澄清的油，产率为1.16g(88％，两步骤)。1H-NMR(250MHz，CDCl3)δ＝4.66(2H，s)，5.29(2H，s)，7.25-7.39(7H，m)，7.99(2H，dd，J＝1.7Hz，6.5Hz)。13C-NMR(63MHz，CDCl3)δ＝67.11、77.59、128.32、128.57、128.66、129.02、129.19、130.32、136.48、143.47、166.64。MS(MALDI-TOF)m/z＝258(MH+)。
制备TMR标记的单糖标准物的一般方法通过制备半乳糖标准物示例。
18：在半乳糖与苄基-(4-氨氧基甲基)-苯甲酸酯间形成肟
半乳糖(90mg，0.50mmol)溶解于DMSO与AcOH(7∶3，3ml)的混合物内并且添加17(128mg，0.50mmol)。混合物在55℃加热3小时并倾倒至水(30ml)中，在冰浴上冷却，引起产物结晶成精细白色晶体。产物经过滤分离，用水洗涤(2×10ml)并在真空下干燥，得到作为单异构体的170mg(83％)产物。1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝3.38-3.55(4H，m)、3.67-3.75(1H1 m)、4.27-4.33(1H，m)、5.12(2H，s)、5.37(2H1s)、7.36-7.52(7H，m)、7.56(1H，d，J＝7.6Hz)、8.00(2H，d，J＝8.1Hz)。13C-NMR(63MHz，DMSO-d6)δ＝63.40、66.52、68.37、69.21、70.04、72.63、74.27、128.25、128.33、128.49、128.91、129.13、129.67、136.52、144.22、154.00、165.78.MS(MALDI-TOF)m/z＝442(MNa+)。
19：用BH3-吡啶还原“半乳糖-肟”(18)
前面实验中得到的肟(18，150mg，0.36mmol)溶解于甲醇(10ml)。添加BH3-吡啶(225μl，吡啶中的8M溶液，1.80mmol，Fluka)和CCl3CO2H(0.50ml，50％水溶液)并且混合物在室温搅拌1小时。小心倾倒反应混合物至半饱和Na2CO3溶液(20ml)并用乙醚和己烷的1∶1混合物(2×10ml)萃取以便除去过量的硼烷试剂。现在通过小心添加浓HCl调节pH至2-3并在旋转蒸发器上缩减体积至最初体积的一半。蒸发期间，产物作为白色结晶固体析出，过滤这种结晶固体，用水(2×10ml)、乙醚(2×10ml)洗涤并且产物最后在真空下干燥产生112mg(75％)纯产物。1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝3.31-3.33(2H，m)、3.40-3.55(5H，m)、3.74(1H，t，J＝6.3Hz)、5.24(2H，s)、5.37(2H，s)、7.36-7.50(5H，m)、7.60(2H，d，J＝8.2Hz)、8.04(2H，d，J＝8.2Hz)。13C-NMR(63MHz，DMSO-d6)δ＝53.34、63.40、64.73、66.68、69.37、70.19、70.89、74.20、128.36、128.53、128.92、129.47、129.87、130.27、136.41、139.73、165.62.MS(MALDI-TOF)m/z＝422(MH+)。
20：使用TRITC标记还原产物(19)
前面实验中制备的少量产物(19，4.2mg，10μmol)溶解于DMF(1ml)并添加TRITC(4.4mg，10μmol)。搅拌1小时后，添加水(10ml)并通过添加浓HCl再次溶解沉淀产物，并将澄清的红色溶液加载在小型C-18Sep-Pak柱上以便结合产物。该柱用水(总体积30ml)洗涤数次，随后用甲醇(5ml)释放产物。将体积缩减至大约0.5ml并且通过快速柱层析在硅胶上用CH2Cl2、甲醇、水、AcOH(70∶20∶9∶1)的混合物纯化材料。化合物的身份通过MS证实并直接用于下一实验。MS(MALDI-TOF)m/z＝865(MH+)。
21：水解酯保护基以产生终末标准物
前面实验中得到的全部材料(20)溶解于1M LiOH(1ml)并搅拌30分钟，随后添加水(10ml)并用浓HCl酸化以产生清亮的红色溶液。产物在小型C-18 Sep-Pak柱上通过用水(总体积30ml)反复洗涤脱盐，随后用甲醇(5ml)释放产物。将体积缩减至大约0.5ml并且通过快速柱层析在硅胶上用氯仿、甲醇、水(120∶85∶20)的混合物纯化产物。化合物的身份通过高分辨率MS证实并且其纯度使用CE分析。HRMS(ES)计算质量(C39H43N4O11S)：775.2649观察质量：775.2700。
其余单糖(葡萄糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、果糖和葡糖醛酸)的标准物使用如对半乳糖所述相同的方法以类似的产率和纯度制备。化合物的身份类似地通过高分辨率质谱证实(见下表)。每种化合物在CE中产生单峰，并且全部8种化合物(21-28)可以在CE中解析(图10)。
  I.标准物   II.计算质量   III.观察质量   变异
  半乳糖(21)   775.2649(C39H43N4O11S)   775.2700   Δ＝6.58ppm
  葡萄糖(22)   775.2649(C39H43N4O11S)   775.2696   Δ＝6.06ppm
  甘露糖(23)   775.2649(C39H43N4O11S)   775.2695   Δ＝5.93ppm
  木糖(24)   745.2543(C38H41N4O10S)   745.2536   Δ＝0.94ppm
  果糖(25)   759.2700(C39H43N4O10S)   759.2728   Δ＝3.69ppm
  N-乙酰葡糖胺(26)   816.2914(C41H46N5O11S)   816.2983   Δ＝8.45ppm
  N-乙酰半乳糖胺(27)   816.2914(C41H46N5O11S)   816.2995   Δ＝9.92ppm
  葡糖醛酸(28)   789.2441(C39H41N4O12S)   789.2507   Δ＝8.36ppm
3.实施例B：固相支持物的制备和命名
使用PEGA树脂(PEGA 1900，Versamatrix A/S)和可控孔径玻璃(CPG)制备具有通用结构B的固相支持物(图1)。BP表示这样的PEGA树脂，其中接头直接连接至商业化树脂上的氨基，而无间隔区。B0、B1和B2表示其中接头已经分别通过0、1和2个间隔区连接至氨丙基化玻璃的CPG(AMP-CPG，CPG-Biotech)。四种固相支持物的结构示于图6。
3.1BP(具有通用结构B的PEGA树脂)
在甲醇中溶胀的1g商业化PEGA 1900树脂(氨基的负载量：0.23mmol/g)，用DMF重复洗涤以确保彻底除去甲醇。接头(14)(308mg，0.69mmol)、TBTU(207mg，644mmol)和DIPEA(119mg，0.92mmol)在DMF(10ml)内混合并放置使其预活化5分钟，加入到树脂中。3小时后，通过吸取除去试剂并用CH2Cl2洗涤树脂(5×20ml)。
取出少部分树脂用于Kaiser试验，该试验证实接头成功地偶联至树脂。类似地，接头在树脂上的负载量如实施例3.3中所述测定并且通过与标准曲线相比较确定为大约0.20mmol/g。羟胺保护基(Fmoc)现在通过DMF中的20％哌啶(15ml持续2分钟并且15ml持续18分钟)处理，随后用DMF(5×20ml)和CH2Cl2(7×20ml)彻底洗涤从剩余树脂中除去。树脂在高真空下干燥24小时以产生最终PEGA树脂(BP)，用于全部后续实验。
3.2B0、B1和B2(可控孔径玻璃，CPG)
B0：接头14与CPG-NH2的偶联
AMP CPG(250mg，负载量＝50.1μmol/g，0.0125mmol.Millipore，产品编号AMP1400B)用DMF(3×2ml)、DMF中的50％DIPEA(3×2ml)和DMF(3×2ml)洗涤。珠子用14(17mg，0.038mmol)、TBTU(12mg，0.037mmol)和DMF中的DIPEA(8.6μl，0.05mmol)的混合物在室温处理过夜。珠子用DMF(3×2ml)、CH2Cl2(3×2ml)洗涤，并用吡啶中的50％Ac2O在室温处理15分钟，用CH2Cl2(3×2ml)、DMF(3×2ml)、CH2Cl2(3×2ml)洗涤，并干燥。如对B1所述测定负载量，负载量为14.2μmol/g。Fmoc基团使用DMF中的20％哌啶在室温持续2×10分钟除去并用DMF(3×2ml)、CH2Cl2(3×2ml)和乙醇(3×2ml)，以及CH2Cl2(3×2ml)洗涤。树脂在真空中干燥。
B1：一个间隔区15和接头14与CPG-NH2的偶联
AMP CPG(2.26g，负载量＝50.1μmol/g，0.11mmol.Millipore，产品编号AMP1400B)用DMF(3×2ml)、DMF中的50％DIPEA(3×2ml)和DMF(3×2ml)洗涤。珠子用15(168mg，0.34mmol)、TBTU(105mg，0.33mmol)和DMF中的DIPEA(78μl，0.45mmol)的混合物在室温处理3小时。树脂用DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并用吡啶中的50％Ac2O在室温处理15分钟。珠子用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并用CH2Cl2中的50％TFA在室温处理2小时。用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)和CH2Cl2(3×5ml)洗涤。1/3的珠子(2.5ml，约0.70g，约35μmol)用DMF(3×5ml)洗涤。用14(47mg，0.11mmol)、TBTU(33mg，0.10mmol)和DMF中的DIPEA(34μl，0.20mmol)在室温处理过夜。珠子用DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并以吡啶中的50％Ac2O在室温处理15分钟，用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并干燥。测定负载量(29μmol/g)并且珠子用DMF中的20％哌啶在室温处理2×10分钟。珠子用DMF(3×2ml)、CH2Cl2(3×2ml)和乙醇(3×2ml)，以及CH2Cl2(3×2ml)洗涤，并干燥。
B2：二个间隔区15和接头14与CPG-NH2的偶联
具有一个来自B1的间隔区的树脂的2/3(5.5ml，约1.54g，约77μmol)用DMF(3×5ml)洗涤。珠子用15(114mg，0.23mmol)、TBTU(72mg，0.22mmol)和DMF中的DIPEA(53μl，0.31mmol)的混合物在室温处理过夜。珠子用DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤并用吡啶中的50％Ac2O在室温处理15分钟，用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并用CH2Cl2中的50％CF3CO2H在室温处理2小时，用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)和CH2Cl2(3×5ml)洗涤。一半量的珠子(约42μmol)用DMF(3×5ml)洗涤并用14(56mg，0.13mmol)、TBTU(39mg，0.12mmol)和DIPEA(29μl，0.17mmol)在室温处理过夜。珠子用DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤并用吡啶中的50％Ac2O在室温处理15分钟，用CH2Cl2(3×5ml)、DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)洗涤并干燥。如对B1所述测定负载量，负载量为36μmol/g。树脂用DMF中的20％哌啶在室温覆盖2×10分钟，用DMF(3×5ml)、CH2Cl2(3×5ml)、乙醇(3×5ml)和CH2Cl2(3×5ml)洗涤，并在真空中干燥。
3.3估计捕获基团在通用结构B(图1)固相支持物上的负载量的实施例
在DMF中的20％哌啶内制备七种浓度的Fmoc-Gly-OH(0.0mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM)。释放的富烯的UV吸光度使用纳米微滴技术(Saveen Werner Nanodrop，型号：ND-1000，系列号：0911)在290nm测量。吸光度对浓度作图，产生具有斜率0.581mM-1的线性曲线。
Fmoc保护的B1珠子(4.8mg)用DMF中的20％哌啶(200μl)处理10分钟。在290nm的UV吸光度测量为0.410并且计算释放的富烯的浓度，
[富烯]＝absobs/斜率标准曲线
[富烯]＝0.410/0.581M-1＝0.706mM
随后使用负载量＝[富烯]×V溶剂/m珠子计算负载量，
B1的负载量：
负载量＝0.706mmol/L×200μl÷4.8mg＝29.4μmol/g
4.A+B→C的实施例以及C的加工
4.1使用葡萄糖作为还原糖以及B2作为固相支持物的捕获条件的变体形式
测试多种溶剂、温度和添加剂以便找到用于在具有通用结构B的固相支持物上捕获还原糖以产生C的优选条件。使用D-Glc作为模式化合物，因为溶液中未捕获的Glc量可以使用来自Molecular Probes的Amplex Red测定法以高敏感性容易地加以估计。已捕获的Glc量因此可以计算为已添加的量减去温育后保留在溶液中的量。
15-20mg珠子(B2)用葡萄糖溶液在不同条件下处理，在终末反应时间后，取出上清液并使用Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒(A-22189，Molecular Probes)评估。
使用不同溶剂、浓度、温度和反应时间捕获葡萄糖
  编号   Glc   体积   [Glc]   溶剂   pH   温度   时间   捕获
  C2A1C2A2C2A3C2A4   1eq1eq1eq1eq   108μL108μL108μL108μL   4.0mM4.0mM4.0mM4.0mM   柠檬酸盐*DMSO/AcOH柠檬酸盐DMSO/AcOH   5353   37℃37℃37℃37℃   4h4honon   8％2％16％21％
  C2A5C2A6C2A7C2A8C2A9C2A10   1eq1eq1eq1eq0.1eq0.1eq   108μL108μL108μL108μL104μL104μL   4.0mM4.0mM4.0mM4.0mM0.4mM0.4mM   柠檬酸盐DMSO/AcOH柠檬酸盐DMSO/AcOH柠檬酸盐DMSO/AcOH   535353   55℃55℃55℃55℃55℃55℃   4h4honononon   13％16％35％35％85％94％
＊0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 5.0。
4.2捕获、加工和分析BP上的代表性还原糖。
在下文使用如下名称以描述通用结构为C、Cren、D、E、F、G、H、I和J(图1)的化合物。首先给出描述所讨论特定结构的特定字母，例如C或E。随后的上标数字表明使用图6中的四种固相支持物中的哪一种。因此，例如，如果使用BP(图6)捕获糖，则产物具有通用结构C，其进一步命名为CP。下一数字表明捕获在图2中所示的十种还原糖样品中的哪一种。因此，CP2指具有已捕获半乳糖(图2的化合物2)的PEGA树脂BP的产物。同理，D25指当固相支持物B2已经捕获四糖LNT(5，图2)以产生C25并随后进一步经加帽成为D25时所得到的产物。
4.2.1捕获和加工还原糖3
CP3：在BP上捕获LacNAc(3)
如此产生贮存溶液，即首先将LacNAc(3)(38mg，0.10mmol)溶解于水(1.0ml)，并且随后样品用DMSO与AcOH(7∶3，9ml)的混合物稀释十倍以产生LacNAc(3)的10mM贮存溶液。随后从贮存溶液中取出40μl(0.40μmol)并进一步用DMSO与AcOH(7∶3，150μl)的混合物稀释，并全部添加至BP(10mg，2μmol)，放置在60℃温育过夜。将树脂用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP3：乙酸酐加帽CP3
实验CP3中得到的全部树脂用Ac2O和甲醇1∶1(0.4ml)的混合物处理1小时，随后用DMF(5×0.5ml)、水(2×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP3：用BH3-吡啶还原DP3
实验DP3中得到的树脂用甲醇(0.1ml)覆盖并添加BH3-吡啶(20μl，8M在吡啶中)，随后添加水中的50％CCl3CO2H酸(40μl)。放置，使反应室温进行2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)和CH2Cl2(5×0.5ml)洗涤。树脂直接用于下一步骤。
FP3：使用TRITC标记EP3
TRITC(0.89mg，2μmol)溶解于DMF(0.2ml)并将该溶液添加至树脂(EP3)并在室温放置2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)及最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
GP3：从支持物上切割TMR标记的LacNAc
前面实验FP3中得到的树脂用1M LiOH溶液(0.2ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至中性。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附深红色溶液，用水(2ml)洗涤并用甲醇(0.5ml)洗脱。产物的身份通过MS(ES)m/z＝978(MH+)证实并且曲线通过CE记录(图11)。
4.2.2捕获和加工还原糖5
CP5：在BP上捕获乳-N-四糖(5)
在DMSO与AcOH 7∶3(3ml)的混合物中溶解5(5.0mg，7.1μmol)制备溶液。该混合物添加至PEGA树脂BP(175mg，35μmol)并在60℃温育过夜。将树脂用DMF(5×5ml)、甲醇(5×5ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP5：用乙酸酐将CP5加帽
实验CP5中得到的全部树脂用Ac2O与甲醇1∶1的混合物(5ml)处理1小时，随后用DMF(5×5ml)、水(2×5ml)、甲醇(5×5ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP5：用BH3-吡啶还原DP5
实验DP5中得到的树脂在甲醇(2ml)中溶胀并添加BH3-吡啶(200μl，在吡啶中8M)，随后添加在水中的50％CCl3CO2H酸(400μl)。放置，使反应室温进行2小时，随后用DMF(5×5ml)、甲醇(5×5ml)和CH2Cl2(5×5ml)洗涤。最后，树脂在真空下干燥过夜并在室温贮存用于后续用途。
FP5：用含溴的MS-标记物标记EP5
少量的干燥树脂EP5(10mg，0.4μmol)用CH2Cl2(3×0.5ml)洗涤以便溶胀树脂。在DMF(0.2ml)中溶解4-异硫氰酸溴苯酯(0.85mg，4μmol)产生溶液并加至树脂中并放置以便室温反应2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)及最后用水(5×0.5ml)洗涤树脂。树脂直接用于下一步骤。
GP5：从支持物上切割溴标记的乳-N-四糖
前面实验FP5中得到的树脂用1M LiOH溶液(0.2ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至微酸性(pH 3-4)。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附含有所需产物的溶液，用水洗涤(2ml)并用甲醇(0.5ml)洗脱。产物的身份通过MS(ES)m/z＝1072(98％，MH+)、1074(100％，MH+)、m/z＝1070(98％，M-H+)、1072(100％，M-H+)证实。图12显示具有内插放大图的质谱，其中可以清晰地区分溴的两种同位素。
4.2.3捕获和加工还原糖混合物6
CP6：在BP上捕获单糖混合物6(Fuc∶Man∶GalNAc，2∶3∶1)
如此产生一系列的3种贮存溶液，即将3种单糖(Fuc：16mg，0.10mmol，Man：18mg，0.10mol，GalNAc：22mg，0.10mmol)分别溶解于水(3×1.0ml)，并且随后样品用DMSO与AcOH(7∶3，3×9ml)的混合物稀释十倍以产生3种单糖的10mM贮存溶液。现在通过从3种贮存溶液取出如下的量而制备混合物：Fuc(20μl，0.2μmol)、Man(30μl，0.3μmol)和GalNAc(10μl，0.1μmol)。这种单糖溶液通过添加DMSO与AcOH(7∶3，150μl)的混合物进一步稀释并全部添加至PEGA树脂BP(10mg，2μmol)并放置在60℃温育过夜。树脂用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP6：用乙酸酐将CP6加帽
实验CP6中得到的全部树脂用Ac2O与甲醇的1∶1混合物(0.4ml)处理1小时，随后用DMF(5×0.5ml)、水(2×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP6：用BH3-吡啶还原DP6
实验DP6中得到的树脂用甲醇(0.1ml)覆盖并添加BH3-吡啶(20μl，8M在吡啶中)，随后添加水中的50％CCl3CO2H酸(40μl)。将反应物放置以在室温进行2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)和CH2Cl2(5×0.5ml)洗涤。将树脂分配至两个独立的容器(EP6a和EP6b，每一容器约5mg)并直接用于下一步骤。
FP6a：使用TRITC标记EP6a
TRITC(0.5mg，1.2μmol)溶解于DMF(0.2ml)并将该溶液添加至树脂(EP6a)并在室温放置2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)并且最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
GP6a：从支持物上切割TMR标记的单糖混合物
前面实验中得到的树脂(FP6a)用1M LiOH溶液(0.1ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至中性。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附深红色溶液，用水(2ml)洗涤并用甲醇(0.5ml)洗脱。3种标记产物的身份通过MS(ES)m/z＝759(Fuc，MH+)、775(Man，MH+)、816(GalNAc，MH+)证实并且它们的曲线通过CE记录(图13)。
FP6b：用乙酸酐标记EP6b
将Ac2O与甲醇的1∶1混合物(0.2ml)添加至树脂(EP6b)并在室温放置16小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)并且最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤。树脂直接用于下一步骤。
GP6b：从支持物上切割乙酸标记的单糖混合物
前面实验中得到的树脂(FP6b)用10％NH4OH溶液(0.1ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并在旋转蒸发器上蒸发至干燥，再次溶解于水(1ml)并冻干。3种标记产物的身份通过MS(ES)m/z＝356(Fuc，M-H+)、372(Man，M-H+)、413(GalNAc，M-H+)证实。三种信号的强度比率大致是1.3∶2∶1。
4.2.4捕获和加工还原糖混合物7
CP7：在BP上捕获单糖混合物7(Fuc∶Man∶GalNAc，1∶3∶2)
实验CP6中所用3种单糖的相同贮存溶液(每种单糖10mM)用于如下实验。通过从3种贮存溶液取出如下的量而制备混合物：Fuc(10μl，0.1μmol)、Man(30μl，0.3μmol)和GalNAc(20μl，0.2μmol)。这种单糖溶液通过添加DMSO与AcOH(7∶3，150μl)的混合物进一步稀释并全部添加至PEGA树脂BP(10mg，2μmol)并放置在60℃温育过夜。树脂用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP7：用乙酸酐将CP7加帽
实验CP7中得到的全部树脂用Ac2O与甲醇的1∶1混合物(0.4ml)处理1小时，随后用DMF(5×0.5ml)、水(2×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP7：用BH3-吡啶还原DP7
实验DP7中得到的树脂用甲醇(0.1ml)覆盖并添加BH3-吡啶(20μl，8M在吡啶中)，随后添加水中的50％CCl3CO2H(40μl)。放置，使反应室温进行2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)和CH2Cl2(5×0.5ml)洗涤。将树脂分配至两个独立的容器(EP7a和EP7b，每一容器约5mg)并直接用于下一步骤。
FP7a：使用TRITC标记EP7a
TRITC(0.5mg，1.2μmol)溶解于DMF(0.2ml)并将该溶液添加至树脂(EP7a)并室温放置2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)并且最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
GP7a：从支持物上切割TMR标记的单糖混合物
前面实验中得到的树脂(FP7a)用1M LiOH溶液(0.1ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至中性。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附深红色溶液，用水(2ml)洗涤并用甲醇(0.5ml)洗脱。3种标记产物的身份通过MS(ES)m/z＝759(Fuc，MH+)、775(Man，MH+)、816(GalNAc，MH+)证实并且它们的曲线通过CE记录(图14)。
FP7b：用氘乙酸酐标记EP7b
将氘乙酸酐与甲醇的1∶1混合物(0.2ml)添加至树脂(EP7b)并在室温放置16小时。随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)并且最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤。树脂直接用于下一步骤。
GP7b：从支持物上切割氘标记的单糖混合物
前面实验中得到的树脂(FP7b)用NH4OH的10％溶液(0.1ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并在旋转蒸发器上蒸发至干燥，再次溶解于水(1ml)并冻干。3种标记产物的身份通过MS(ES)m/z＝359(Fuc，M-H+)、375(Man，M-H+)、416(GalNAc，M-H+)证实。三种信号强度比率大致是1∶4∶4。
4.2.5捕获和加工还原性寡糖混合物9
CP9：在BP上捕获寡糖混合物9(G2-G7)
溶液通过等摩尔量(每种寡糖10μmol)的纯寡糖G2-G7溶解于水(1ml)产生。将100μl含寡糖的溶液添加至DMSO与AcOH(7∶3，0.9ml)的混合物内并全部添加至PEGA树脂BP(60mg，12μmol)并放置在50℃温育过夜。树脂用DMF(5×2ml)、甲醇(5×2ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP9：用乙酸酐将CP9加帽
实验中得到的全部树脂CP9用Ac2O与甲醇的1∶1混合物(2ml)处理1小时，随后用DMF(5×2ml)、水(2×2ml)、甲醇(5×2ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP9：用BH3-吡啶还原DP9
实验DP9中得到的树脂用甲醇(1ml)覆盖，添加BH3-吡啶(150μl，8 M在吡啶中)，随后添加在水中的50％CCl3CO2H酸(300μl)。放置，使反应室温进行2小时，随后用DMF(5×2ml)、甲醇(5×2ml)和CH2Cl2(5×2ml)洗涤。树脂直接用于下一步骤。
FP9：使用FITC标记EP9
FITC(12mg，30μmol)溶解于DMF与甲醇的1∶1混合物(1ml)内并将该溶液添加至树脂(EP9)并在室温放置2小时。随后用DMF(5×2ml)、CH2Cl2(5×2ml)、甲醇(5×2ml)并且最后用水(5×2ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
GP9：从支持物上切割使用FITC标记的寡糖混合物
前面实验中得到的树脂(FP9)用1M LiOH溶液(1ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×3ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至中性。在Sep-Pak柱(350mg)上吸附强黄色的溶液，用水洗涤(10ml)并用甲醇(3ml)洗脱。全部6种标记寡糖的存在通过MS(ES)m/z＝881(G2，MH+)、1043(G3，MH+)、1205(G4，MH+)、1367(G5，MH+)、1529(G6，MH+)、1691(G7，MH+)证实并且化合物的曲线通过CE记录(图15)。
4.2.6捕获、加工从核糖核酸酶B释放的寡糖
CP10：在BP上捕获和加工来自RNA酶B(10)的寡糖
来自PNG酶F消化RNA酶B(Sigma，R-7884)的粗制寡糖在Centricon-10浓缩器(Millipore)上除去蛋白质，随后在Carbograph SPE柱(150mg床重量；Scantec Lab)上进行糖纯化后加以使用。来自RNA酶B(10)2的粗制寡糖(300μg，大约0.2μmol)溶解于含有0.9M柠檬酸的DMSO和THF的2∶1混合物(100μl)制备溶液。将该混合物添加至PEGA树脂BP(5mg，1.0μmol)并在60℃温育过夜。将树脂用DMF(5×0.3ml)、甲醇(5×0.3ml)洗涤数次并直接用于下一实验。
DP10：用乙酸酐将DP10加帽
实验CP10中得到的全部树脂用Ac2O与甲醇的1∶1混合物(0.2ml)处理1小时，随后用DMF(5×0.3ml)、水(2×0.3ml)、甲醇(5×0.3ml)洗涤并直接用于下一实验。
EP10：用BH3-吡啶还原Dp10
实验Dp10中得到的树脂用甲醇(0.2ml)覆盖并添加BH3-吡啶(10μl，8M在吡啶中)，随后添加在水中的50％CCl3CO2H(20μl)。放置，使反应室温进行2小时，随后用DMF(5×0.3ml)、甲醇(5×0.3ml)和CH2Cl2(5×0.3ml)洗涤。树脂直接用于下一步骤。
FP10：使用FITC标记EP10
FITC(1.9mg，5μmol)溶解于DMF与甲醇(1∶1，0.2ml)的混合物内并将该溶液添加至树脂(EP10)并在60℃放置2小时。随后用DMF(5×0.3ml)、CH2Cl2(5×0.3ml)、甲醇(5×0.3ml)并且最后用水(5×0.3ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
Gp10：从支持物上切割使用FITC标记的来自RNA酶的寡糖
前面实验中得到的树脂(FP10)用1M LiOH溶液(0.2ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH至中性。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附含有所需产物的黄色溶液，用水(2ml)洗涤并用甲醇(0.5ml)洗脱。标记寡糖的曲线通过CE分析。CE(图16)显示存在数种寡糖和一些未鉴定的杂质。至少一种已知成分的身份通过MS(ES)m/z＝1775证实(Man5GlcNAcGlcNAcCH2-N-(R)-TAG，MH+)。
4.3在CPG支持物上捕获和加工代表性还原糖
4.3.1在B1上捕获和加工2
C12：在B1上捕获半乳糖(2)
B1(20mg，0.6μmol)用在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(113μl)中的2(6.6μl，1mg/ml水，0.03μmol)处理并在55℃放置过夜。将珠子转移至注射器并用水(3×0.5ml)和乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生C12。
D12：用乙酸酐将C12加帽
C12(0.6μmol)用乙醇中的50％Ac2O在室温加帽15分钟并用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生D12。
E12：用BH3-吡啶还原D12
D12(0.6μmol)用100μl的BH3-吡啶(25μl)、乙醇(500μl)中的50％CCl3CO2H(50μl)的溶液处理。混合物在室温放置2小时。珠子用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生E12。
F12：用TRITC标记E12
E12(0.6μmol)用TRITC(1.0mg溶于300μl NMP与300μl CH2Cl2内，100μl)处理并在室温放置2小时。珠子用CH2Cl2(3×0.5ml)、乙醇(3×0.5ml)和水(3×0.5ml)洗涤，产生F12(红色珠子)。
G12：碱处理F12
F12(0.6μmol)用1M LiOH溶液(100μl)在室温处理1小时并且分离红色溶液并用水中的50％AcOH中和，产生G12(红色溶液)，使G12通过Sep-Pak柱(在水中的30％CH3CN)并通过MS(775.3，MH+)和CE(图17)分析。
4.3.2在B1上捕获和加工5
C15：在B1上捕获LNT(5)
B1(20mg，0.6μmol)用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(113μl)中的5(25μl，2mg/ml水，0.03μmol)处理并在55℃放置过夜。将珠子转移至注射器并用水(3×0.5ml)和乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生C15。
D15：用乙酸酐将C15加帽
C15(0.6μmol)用乙醇中的50％Ac2O在室温处理15分钟并用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生D15。
E15：用BH3-吡啶还原D15
D15(0.6μmol)用100μl的BH3-吡啶(25μl)、乙醇(500μl)中的50％CCl3CO2H(50μl)的溶液处理。混合物在室温放置2小时。珠子用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生E15。
F15：用TRITC标记E15
E15(0.6μmol)用TRITC(1.0mg溶于300μl NMP与300μl CH2Cl2内，100μl)处理并在室温放置2小时。珠子用CH2Cl2(3×0.5ml)、乙醇(3×0.5ml)和水(3×0.5ml)洗涤，产生F15(红色珠子)。
G15：碱处理F15
树脂用1M LiOH溶液(100μl)在室温处理1小时，并且红色溶液经过滤分离并且珠子用水洗涤(3×75μl)，并且用水中的50％AcOH中和，产生G15(红色溶液)，使G15通过Sep-Pak柱(在水中的30％CH3CN)并通过MS(ES)m/z＝1300.6(M-H+)、1302.4(MH+)和通过CE分析(图18)。
备选地，E15可以如下用1-氟-2，4-二硝基苯(Sanger试剂，(图8))标记。树脂用Sanger试剂(20当量，0.4μl，Sigma)和乙醇(70μl)中的TEA(10当量，0.2μl)在55℃处理2小时。用乙醇(3×0.5ml)、CH2Cl2(3×0.5ml)、乙醇(3×0.5ml)和水(3×0.5ml)洗涤珠子(黄色珠子)，随后用1M LiOH溶液(70μl)在室温处理1小时(棕色溶液)。溶液经过滤收集并且珠子用水(3×50μl)洗涤。混合物用50％AcOH中和(黄色溶液)。使混合物与在水中的30％CH3CN一起通过Sep-Pak柱。MS(ES)m/z＝1023.1(M-H+)。
4.3.3在B1上捕获和加工混合物8
C18：在B1上捕获半乳糖(2)和LNT(5)
B1(20mg，0.6μmol)用2(6.6μl，1mg/ml水，0.03μmol)、5(25μl，2mg/ml水，0.03μmol)和柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(100μl)处理并在55℃放置过夜。将珠子转移至注射器并用水(3×0.5ml)和乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生C18。
D18：用乙酸酐将C18加帽
C18(0.6μmol)中剩余的羟胺用乙醇中的50％Ac2O在室温加帽15分钟并用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生D18。
E18：用BH3-吡啶还原D18
D18(0.6μmol)用100μl由BH3-吡啶(Fluka，25μl)、乙醇(500μl)中的50％CCl3CO2H(50μl)组成的溶液处理。混合物在室温放置2小时。珠子用乙醇(3×0.5ml)洗涤，产生E18。
F18：使用TRITC标记E18
E18(0.6μmol)用TRITC(1.0mg溶于300μl NMP与300μl CH2Cl2内，100μl)处理并在室温放置2小时。珠子(红色珠子)用CH2Cl2(3×0.5ml)、乙醇(3×0.5ml)和水(3×0.5ml)洗涤，产生F18。
G18：碱处理F18
F18用1M LiOH溶液(100μl)在室温处理1小时，并且分离红色溶液并且用水中的50％AcOH中和，产生G18(红色溶液)，使G18通过Sep-Pak柱(在水中的30％CH3CN)并经CE分析(图19)。
5.固定化寡糖与酶的反应
5.1固定化的标记寡糖与糖苷酶的反应
5.1.1具有结构F的固定化乳-N-四糖(LNT，5)(帽＝乙酰基，TAG＝TMR)与β-半乳糖苷酶(牛睾丸，SIGMA产品G-4142，1U/ml)在CPG支持物上反应，其中CPG没有(F05)间隔区，有一个(F15)间隔区和两个(F25)间隔区。基本如对F15(4.3.2部分)所述制备全部三种固定化的寡糖。
固相支持物(5mg)与β-半乳糖苷酶(在pH 5.0的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(含有0.2％BSA)内的0.2U/ml溶液，100μl)在37℃温育23小时，并且随后树脂用3×水、3×乙醇、3×CH2Cl2、3×乙醇和3×水洗涤。珠子用1M LiOH溶液(60μl)在室温处理1小时，产生在溶液中具有通用结构G05、G15和G25的产物。经过滤收集每种红色溶液。滤液用50％AcOH中和并使用CE分析。
图20显示对于F05，不存在可检测的半乳糖切割；对于F15，存在39％的转化率(即39％的四糖已经丢失末端Gal残基并且转换成三糖)并且对于F25，存在83％的转化率。因此发现间隔区的性质对酶反应的过程是重要的。
5.1.2固定化的麦芽三糖F24(帽＝乙酰基，TAG＝TMR)与来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶2(由Carlsberg Laboratories的BirteSvensson博士惠赠)在具有两种间隔区的CPG上反应。
F24基本上如对F15(4.3.2部分)所述进行制备，但是使用麦芽三糖(G3，图2)作为还原糖和使用B2作为固相支持物。F24(大约5mg)与50μl在pH5.5的0.1M乙酸钠缓冲液(含有0.2％BSA)内的0.1mg/ml酶在37℃温育23小时。在如上所述洗涤并切割后，产物通过CE分析(图21)，显示固定化的标记麦芽三糖完全转化成一个新的峰，该峰在标记的麦芽三糖和标记的葡萄糖间之间洗脱，因而称作麦芽糖(G2)TMR加合物。
5.2固定化的未标记寡糖与糖苷酶在相同支持物上反应并捕获释放的还原性单糖
具有结构C25的固定化LNT(未还原、未加帽、未标记)与β-半乳糖苷酶(牛睾丸)的反应在具有两种间隔区的CPG固相支持物上开展。C25基本上如对C15(4.3.2部分)所述进行制备。在使用前，使用Microcon YM-3离心滤器装置(Millipore)通过反复离心使酶溶液不含小分子杂质。C25(5mg)与55μl在pH 5.0的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(含有0.2％BSA)内的0.9U/ml酶在37℃温育23小时，随后在55℃继续温育20小时以允许捕获释放的半乳糖。将固相洗涤、还原、用乙酸酐加帽、使用TRITC标记并如以上所述用LiOH切割以将C15转化成G15。切割产物的CE示于图22，该图显示存在未反应的LNT(32％)和类似量的TMR标记产物三糖和已切割的半乳糖。这个实验证实在未加帽的相同支持物(糖从其上切下)上捕获了已切割的糖。
6.加帽剂的变化
6.1.C加帽以产生D
使用选择的加帽剂以实现C至D的转化(图1)。使用C22作为底物(其中固相是具有2种间隔区的CPG并且捕获的糖是半乳糖)。C上的氨基随后用乙酸酐、苯甲酸酐、三氯乙酸酐和二溴二甲苯及其它加帽剂(图6)加帽。用乙醇中的50％加帽剂溶液在室温处理15-120分钟实施加帽。样品随后如对C12至G12(4.3.1部分)的转化所述进行加工，即还原、使用TRITC标记、碱切割并通过CE分析。结果示于图23，该图显示所有条件均产生靶标-TMR标记的半乳糖(化合物21，图5)，同时数量不定的其他杂质在电泳图中出现于化合物21之前。
6.2将Cred加帽以产生E的实施例
如以上对D12转化成E12(4.3.1部分)所述，来自以上6.1部分的C22用BH3-吡啶还原。产物Cred 22与E12的不同在于Cred 22含有未加帽的NH2基。将Cred 22(5mg)与DMF(50μl)中的苯甲酸NHS-酯(0.4mg，1.75μmol)和TEA(1.0μl)在60℃反应过夜。随后将具有通用结构E22(具有苯甲酸酯帽)的反应产物常规进行洗涤和加工、使用TRITC标记、切割并通过CE分析。图24显示与通过C至D至E和至G所形成的产物基本上相同的产物。该产物的身份通过它的MS(ES)m/z＝775.0(MH+)证实。
7.连接索用途的实施例：E至H至I至J(图1)
合成29作为X-连接索-YP的实施例
29：(4-异硫氰酸基-苄基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
向无水CH2Cl2(20ml)中的4-氨基苄胺(0.93ml，8.20mmol)的溶液添加TEA(1.15ml，8.27mmol)，随后添加无水CH2Cl2(20ml)中的Fmoc-N-羟琥珀酰亚胺酯(2.48g，7.35mmol)的溶液。搅拌30分钟后，添加CH2Cl2(100ml)并且混合物依次用饱和NaHCO3水溶液(2×50ml)和盐水(50ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。溶剂在减压下除去并且残余物通过干柱真空色谱(正庚烷中的0-60％EtOAc)纯化以产生Fmoc保护的物质(4-氨基-苄基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(2.30g，91％)。1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝4.03(2H，d，J＝5，3Hz)、4.22(1H，t，J＝6，8Hz)、4.33(2H，d，J＝6，8Hz)、4.95(2H，s)、6.53(2H，d，J＝8.3Hz)、6.92(2H，d，J＝8.2Hz)、7.29-7.44(4H，m)、7.64-7.72(3H，m)、7.88(2H，d，J＝7.3Hz)。13C-NMR(63MHz，DMSO-d6)δ＝43.97、47.19、65.65、114.09、120.46、121.75、125.58、127.11、127.42、127.96、128.47、129.30、141.13、144.32、147.89、156.63.MS(ES)m/z＝345(MH+)。
将CH2Cl2(30ml)中的(4-氨基-苄基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯的溶液(718mg，2.09mmol)逐滴添加至CH2Cl2-水混合物(40ml，1∶1，v/v)中的二氯硫化碳(199μl，2.61mmol)的溶液内。混合物搅拌过夜后，分离并干燥(Na2SO4)有机相。溶剂在减压下除去并且残余物通过干柱真空色谱(正庚烷中0-100％CH2Cl2)纯化以产生29(643mg，80％)。1H-NMR(250MHz，DMSO-d6)δ＝4.18-4.25(3H1m)、4.38(2H，d，J＝6.7Hz)、7.25-7.45(8H，m)、7.69(2H，d，J＝7.3Hz)、7.87-7.90(3H，m)。13C-NMR(63MHz，DMSO-d6)δ＝43.64、47.19、65.70、115.55、120.48、125.15、125.49、126.20、127.42、127.98、128.72、128.83、133.55、136.29、140.26、141.16、144.23、156.74。MS(ES)m/z＝387(MH+)。
HP5：使用29(图9)将Fmoc保护的氨基连接索连接至EP5
5mg干燥树脂(EP5)(0.2μmol)用CH2Cl2洗涤两次以确保使树脂适当地溶胀。Fmoc保护的连接索(29)(0.8mg，2μmol)溶解于DMF(0.2ml)并添加至树脂并且反应2小时。树脂用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)洗涤并且在标准条件(DMF中的20％哌啶，0.5ml，2×10分钟)下除去Fmoc保护基。树脂在用DMF(5×0.5ml)洗涤后直接用于下一实验。
IP5：使用TRITC标记HP5
实验HP5中得到的含有游离伯胺的树脂与DMF(0.2ml)中的TRITC(0.9mg，2μmol)在室温温育2小时，随后用DMF(5×0.5ml)、CH2Cl2(5×0.5ml)、甲醇(5×0.5ml)并且最后用水(5×0.5ml)彻底洗涤以除去过量染料。树脂直接用于下一步骤。
JP5：切割使用TRITC经氨基连接索加以标记的乳-N-四糖
前面实验(IP5)中得到的树脂用1M LiOH溶液(0.2ml)覆盖并放置2小时。通过吸取从珠子收集液体，随后用水洗涤珠子(3×0.5ml)。汇集所收集的液体和洗涤物并用10％AcOH调节pH用至微酸性(pH 3-4)。在Sep-Pak柱(50mg)上吸附含有所需要产物的深红色溶液，用水洗涤(2ml)并用甲醇(0.5ml)洗脱。产物的身份通过MS(ES)m/z＝1465(MH+)证实。
标记糖的毛细管电泳分析
毛细管电泳(CE)使用自动化PrinCE 2-lift，560型CE系统(PrinceTechnologies，荷兰)开展。在75μm ID的未涂层熔融硅毛细管中实施分离，所述的毛细管具有50-75cm的有效长度(外加从检测窗口至出口的30cm额外长度)，在25℃恒温控制。CE背景电解质(BGE)是(A)pH 9.3的50mM硼酸盐缓冲液(含有150mM SDS)或(B)pH 9.3的0.2M硼酸盐缓冲液(含有0.8％(w/v)γ-CD(Sigma，C-4892))。条件A用于图11和图15-22中所示的分析。条件B用于图10、13、14、23和24中所示的分析。
毛细管在使用前于室温、2000毫巴下用1M NaOH淋洗30分钟、用水淋洗10分钟并用BGE淋洗10分钟。在运行期间，毛细管于2000毫巴下用1M NaOH洗涤3分钟、用水洗涤3分钟并用BGE洗涤10分钟。将样品于50毫巴下水压注射6秒并跨越25kV电势差进行电泳。全部实验在正常极性即阳极入口(inlet anodic)上实施。检测使用配备适合滤光片的荧光检测仪(Argos 250B，Flux Instruments，Switzerland)实施。对于使用TRITC标记的样品，激发滤光片和发射滤光片分别是546.1/10nm和570nm。对于使用FITC标记的样品，激发滤光片和发射滤光片分别是UG11(200-400nm)和495nm。
缩写
已经在本申请通篇范围使用如下缩写。
AMP CPG  氨丙基可控孔径玻璃
BGE      背景电解质
BSA      牛血清白蛋白
CE       毛细管电泳
CPG      可控孔径玻璃
DIPEA    N，N-二异丙基乙胺
DMF      N，N-二甲基甲酰胺
ES       电喷雾
FITC     异硫氰酸荧光素
Fmoc     9-芴基甲氧羰基
HRMS     高分辨率质谱
LNT      乳-N-四糖
MS       质谱
NHS      N-羟琥珀酰亚胺
NMP      1-甲基-2-吡咯烷酮
PEGA     聚乙二醇丙烯酰胺多聚体
RNAse B  核糖核酸酶B
rt       室温
TBTU     N，N，N′，N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1基)铀四氟硼酸酯
TEA      三乙胺
TMR      四甲基罗丹明
TRITC    四甲基罗丹明异硫氰酸酯

Claims (45)

1.制备活性糖的方法，所述方法包括步骤：
i.提供包含还原糖的样品；
ii.提供共价连接至包含含有-NH2基的捕获基团的接头上的固相支持物(固体)，其中所述接头任选地通过间隔区连接至该固相支持物；
iii.使所述还原糖与所述-NH2基反应，由此得到固定化的糖；
iv.使游离-NH2基与加帽剂反应，其中加帽剂包含能够与-NH2基反应的反应基；
v.用还原剂还原C＝N键；
vi.由此得到经接头和任选的间隔区连接至固相支持物上的结构为糖CHn-NH-的活性糖，其中n是1或2；
其中步骤iv和v可以以任意顺序开展。
2.根据权利要求1所述的方法，其中方法还包括步骤：
vii.使活性糖的-NH-基与包含氮活性官能团(X)的衍生剂反应，由此得到共价连接至所述试剂的糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的氮活性官能团选自异硫氰酸酯、活性酯、羧酸、Michael受体、α-β不饱和砜、烷基化剂、醛、酮和携带负电基团的取代卤芳基。
4.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述的衍生剂是用氮活性官能团衍生化的可光谱检测的化合物。
5.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述的衍生剂是用氮活性官能团衍生化的荧光化合物。
6.根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中所述的方法还包括步骤：
viii.通过光谱测定法检测连接至糖上的所述试剂。
7.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述的衍生剂是用氮活性官能团衍生化的质谱分析性TAG，其中质谱分析性TAG能够改善糖的检测和/或结构表征。
8.根据权利要求7所述的方法，其中质谱分析性TAG是包含溴的分子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中质谱分析性TAG是带电的分子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中质谱分析性TAG是同位素标记的分子。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤：
viii.通过质谱分析法检测连接至所述糖上的所述质谱分析性TAG。
12.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述的衍生剂是能够与第二结合配偶体特异性相互作用的第一结合配偶体，并且其中所述的第一结合配偶体经氮活性官能团衍生化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中一个结合配偶体是蛋白质并且另一个结合配偶体是所述蛋白质的配体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中一个结合配偶体包含表位并且另一个结合配偶体是特异性地识别所述表位的抗体。
15.根据权利要求12所述的方法，其中一个结合配偶体是生物素并且另一个结合配偶体是抗生物素蛋白。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中第二结合配偶体与可检测标记物缀合。
17.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中衍生剂是用氮活性官能团或受保护的氮活性官能团衍生化的核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的核酸是DNA。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤：
viii.检测连接至所述糖上的所述核酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的核酸通过缀合至可检测标记物的基本互补的核酸加以检测。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸的检测包括扩增核酸。
22.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中所述的试剂是结构为X-连接索-Y或X-连接索-Yp的双功能试剂，其中X是氮活性官能团并且Y是第二活性官能团并且Yp是受保护的反应基Y。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的第二活性官能团Y选自硫醇、羧基、活化的羧基、二硫化物、活化的二硫化物、烷基化剂、烯、炔、醛、酮和氮化物或Yp选自前述基团Y的受保护的衍生物以及受保护的胺。
24.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤：
viii.提供包含能够与Y反应的官能团(Z)的第二衍生剂；
ix.使官能团Z与Y反应，由此第二衍生剂经连接索和第一衍生剂共价连接至糖上。
25.根据权利要求24所述的方法，其中第二衍生剂选自药物、显像剂、肽、多肽、蛋白质、酶、核酸、可光谱检测的化合物、质谱分析性TAG和能够与第二结合配偶体特异性相互作用的第一结合配偶体。
26.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中方法还包括步骤：
viii.提供选自微生物、微团、噬菌体、病毒粒子和纳米粒子的粒子，其中该粒子包含能够与Y反应的官能团(Z)；
ix.使官能团Z与Y反应，由此粒子经连接索和试剂共价连接至糖上。
27.根据权利要求1所述的方法，其中方法还包括步骤：
viii.使糖与能够同所述糖结合的检测剂接触；
ix.检测该检测剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的检测剂包含芳基代硼酸酯或杂芳基代硼酸酯。
29.根据权利要求27所述的方法，其中检测剂是多肽。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的多肽选自凝集素、选择素、毒素、受体、抗体和酶。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获基团包含结构M-NH2或由该结构组成，其中M是杂原子。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接头是选自烷基、芳基、醚和酰胺的不可切割接头，其中任何前述的基团可以任选地被取代。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中接头是可切割接头。
34.根据权利要求33所述的方法，其中接头可以通过与酸、碱、亲核体、亲电体、氧化、还原、自由基、光、热或酶的反应切割。
35.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中方法还包括切割所述的可切割接头从而释放糖的步骤，其中此步骤可以在步骤v、vi、vii、viii或ix后开展。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接头经间隔区连接至所述固相支持物上。
37.根据权利要求36所述的方法，其中间隔区的长度为0至1000个原子并且任选地是分支的。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中固相支持物选自多聚体、固体、不可溶粒子和表面。
39.根据前述权利要求1至37中任一项所述的方法，其中固相支持物是传感器。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中方法还包括使糖与一种或多种糖苷酶接触从而生成新的还原糖的步骤，条件是第一种糖是所述糖苷酶的底物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中方法还包括使新生成的还原糖固定在固相支持物上的步骤。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中方法还包括使糖与一种或多种酶接触从而将所述糖转换成新结构的步骤，所述的酶选自糖基转移酶、硫酸酯酶、磷酸化酶、磺基转移酶、磷酸转移酶、糖苷合成酶和转糖苷酶。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法。包括检测新生成的糖或结构。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中还原剂是硼烷或包含BH键的氢硼化物或包含SiH键的硅烷。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中方法包括将包含还原糖的样品、固相支持物和还原剂同时温育。
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