KR101101375B1 - 당류의 고정화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당류의 고정화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 당류를 고체 기재에 고정화시키는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제작된 탄수화물 칩에 관한 것이다. 본 발명의 당류의 고정화 방법은 당류의 구조나 방향성에 변화를 주지 않고, 당류를 고체 기재에 직접 고정화할 수 있는 방법으로, 상기 방법으로 제조된 탄수화물 칩은 당류와 생체분자간의 상호작용을 용이하게 분석하여 맞춤형 바이오센서, 신약 개발 등 다양한 응용분양에 널리 사용될 수 있다.
당류, 탄수화물, 고정화, 칩, 아민기, 아민

Description

당류의 고정화 방법{Immobilization method of carbohydrates}
본 발명은 당류의 고정화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 당류를 고체 기재에 고정화시키는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제작된 탄수화물 칩에 관한 것이다.
일반적으로 당류는 단당으로 존재할 때에는 세포의 주된 에너지원으로 이용되고, 올리고당이나 다당의 구조체를 형성할 때에는 에너지의 축적뿐만 아니라 세포 표면에서 지지체로서의 역할과 동시에 세포간의 신호를 인식하는 표식자로서 역할을 한다. 따라서 당류는 핵산이나 단백질과 같이 기본적인 생물학 기능을 결정하는 데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 다양한 범위의 생리학적 작용에 영향을 미치는 중요한 생화학적 요소이다.
이러한 당류는 화학, 생물학, 물리화학, 재료공학 및 관련된 분야의 응용에 중요한 역할을 한다. 특히 생물학 분야에서 당류의 연구는 기초적인 생화학적인 작용을 밝히고 새로운 의약물질을 개발하는 데 있어서 중요하게 인식되고 있다. 이와 같이 세포 내에서 중요한 역할을 하는 당류는 최근에 그 중요성이 증가되고 있을 뿐만 아니라, 이러한 당류에 관한 수많은 연구들이 진행되고 있다.
그러나 당류를 특정 표면에 고정화시키기가 매우 어려워 당류에 관한 연구는 한계가 있다. 단백질이나 DNA와 같은 세포 내 물질들은 고체 기재 표면에 고정화할 수 있는 많은 방법이 개발되어 다양한 분석이나 응용에 용이하게 사용될 수 있으며, 단백질이나 DNA 센서와 같은 새로운 응용 분야에도 널리 사용되고 있다. 단백질이나 다른 세포 내 물질에서도 문제가 되고 있기는 하지만, 당류를 고정화시키는 데 있어서 가장 큰 문제점은 세포 내와 동일한 형태로 당류의 활성 부분을 유지하면서 고정화시켜야 한다는 것이다. 이러한 방향성 문제는 단백질의 고정화에서도 쉽게 해결되지 못하고 있는 실정이다. 단백질의 N-말단 혹은 C-말단을 이용하여 화학적인 결합을 유도하거나, protein G와 같은 물질을 이용하여 단백질의 방향성 문제를 해결하려는 연구들이 많이 연구되고 있다. 그러나 당지질이나 당단백질과 같은 당류의 경우는 복잡한 구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 단백질의 경우에서처럼 특정 N-말단 혹은 C-말단이 존재하지 않기 때문에 더욱 고정화가 쉽지 않지 때문이다. 상기와 같은 이유로 다른 세포 내 물질과 달리 당류를 분석하거나 응용하는데 있어서 복잡한 과정을 거쳐야 하기 때문에 그 이용이 매우 제한적이다.
특히 세포 표면이나 세포 내에서의 중요한 역할을 하는 당류는 당단백질이나 당지질로 존재하며 면역학적인 기능에 중요한 부분을 담당한다. 이러한 당단백질이나 당지질의 당류를 분석하기 위해서는 단백질이나 지질을 제거하는 과정을 거친 후 형광 표지를 하여 분석하는 방법이 주로 이용되어왔다 (Neville DCA, Coquard V, Priestman DA, et al. Analysis of fluorescently labeled glycosphingolipid-derived oligosaccharides following ceramide glycanase digestion and anthranilic acid labeling. Ana . Biochem . 331: 275-282, 2004). 그러나 상기 방법은 당의 분리나 분석에만 한정되어 사용할 수 있고 당을 고정화시킬 수는 없는 문제점이 있다.
당을 고체 표면에 고정화시키기 위해서는 상기와 같이 방향성과 구조를 고려해서 고정화를 시켜야 한다. 따라서 당을 당지질이나 당단백질로부터 분리해 내지 않고 지질이나 단백질을 직접적으로 표면에 고정화를 시킴으로써 당을 고정화시키는 연구도 수행되었다(MacKenzie CR, Hirama T, Lee KK, et al. Quantitative analysis of bacterial toxin affinity for specificity for glycolipid receptors by surface plasmon resonance. J. Biol . Chem . 272: 5535-5538, 1997). 상기 방법은 당의 구조를 유지하면서 고정화시키기 때문에 활성의 문제를 해결할 수 있다는 장점이 있지만, 이러한 방법으로 고정화를 할 경우 당지질의 고정화는 지질을 이용한 소수성 결합으로 고정화되기 때문에 결합이 매우 약하다는 문제점이 있다. 또한 당단백질의 경우에는 이러한 방법으로 고정화를 시키더라도 방향성의 문제는 해결할 수 없다.
또한, 지질이나 단백질의 항체를 먼저 표면에 고정화시키고 항원-항체 반응을 이용한 고정화 방법도 연구되었으나(MacKenzie CR, Hirama T, Lee KK, et al. 1997 Quantitative analysis of bacterial toxin affinity for specificity for glycolipid receptors by surface plasmon resonance. J. Biol . Chem . 272: 5535-5538), 상기 방법 또한 화학적인 결합이 아닌 수소결합에 의존하기 때문에 고정화에 문제점이 있 있다.
기존의 이러한 연구들에서의 문제점들을 해결하고 화학결합을 통한 당의 고정화를 위한 방법들이 개발되었다(Nyquist RM, Eberhardt AS, Silks III LA, et al. 2000 Characterization of self-assembled monolayers for biosensor applications. Langmuir 16: 1793-1800; Ni J, Singh S, and Wang LX. 2003 Synthesis of maleimid-activated carbohydrates as chemoselective tags for site-specific glycosylation of peptides and proteins. Biocon . Chem . 14: 232-238). 상기 방법들은 당을 특정 고체 기재 표면(주로 금 표면)에 고정화시키기 위해서 개발된 방법들로서 단백질과 결합되어 있는 환원당 부분에 특정한 표지를 하거나 지질을 변형시켜서 화학결합을 유도하는 방법을 이용하였다. 하지만 이러한 방법들은 특정한 당류만을 사용해야 하거나, 상기 방법을 이용하기 위해서는 당류를 새로 합성해야 하는 문제점이 있다.
상기 연구에서의 문제점을 해결하기 위해서 유리 슬라이드(glass slide)나 투명한 고체 기판을 기반으로 한 탄수화물 칩이 탄수화물과 생체분자 간의 상호작용을 고속처리분석을 위한 플랫폼으로 제안되고 있다(Wang DN, Liu SY, Trummer BJ, Deng C, Wang AL, et al. 2002 Carbohydrate microarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microbes and host cells. Nat . Biotechnol . 20: 275-281; Lee M, Shin I, et al. 2005 Facile preparation of carbohydrate microarrays by site-specific, covalent immobilization of unmodified carbohydrates on hydrazide-coated glass slides. Org . Lett . 7: 4269-4272; Fukui S, Feizi T, Galustian C, Lawson AM, Chai WG, et al. 2002 Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat . Biotechnol . 20: 1011-1017). 상기 방법을 실용화 하기 위해서는 유리 슬라이드와 같은 고체 기판 상에 다양한 종류의 탄수화물들을 공유결합으로 특정한 위치에 고정화시키는 효율적인 고정화 방법이 절실히 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 당류의 구조나 방향성에 변화를 주지 않고, 당류를 고체 기재에 고정화할 수 있는 방법에 관하여 연구하던 중, 환원당을 가지고 있는 당류와 아민 화합물을 반응시켜 제조된 아민기가 도입된 당류를 고체 기재에 고정화시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 (a) 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아민 화합물을 반응시켜 당류에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계 및 (b) 아민기가 도입된 당류를 고체 기재에 고정화하는 단계를 포함하는 당류의 고정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 고정화된 당류 및 고체 기재를 포함하는 탄수화물 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 탄수화물 칩에 생체분자를 투여하여 탄수화물과 생체분자의 결합여부를 확인하는 단계를 포함하는 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법 또는 탄수화물과 상호작용하는 생체분자를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아민 화합물을 반응시켜 당류에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계 및 (b) 아민기가 도입된 당류를 고체 기재에 고정화하는 단계를 포함하는 당류의 고정화 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 고정화된 당류 및 고체 기재를 포함하는 탄수화물 칩을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 탄수화물 칩에 생체분자를 투여하여 탄수화물과 생체분자의 결합여부를 확인하는 단계를 포함하는 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법 또는 탄수화물과 상호작용하는 생체분자를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 당류의 고정화 방법에 사용될 수 있는 당류는 환원당을 가지고 있는 당류라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 당류는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 단당류(monosaccharide), 이당류(disaccharide), 올리고당(oligosaccharide) 및 다당류(polysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 이당류는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 셀로비오스(cellobiose), 니게로스(nigerose), 이소말토스(isomaltose), 멜리비오스(melibiose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 키토비오스(chitobiose), 갈락토비오스(galactobiose), 만노오스(mannose) 및 만노비오스(mannobiose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 이당류는 락 토오스(lactose), 말토오스(maltose), N,N'-디아세틸키토비오스(N,N'-diacetylchitobiose), β1-6 갈락토비오스(β1-6 galactobiose), N-아세틸글루코사민 β1-2 만노오스(GlcNAcβ1-2Man) 및 α1-3 만노비오스(α1-3 mannobiose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 올리고당은 LS-테트라사카라이드 비(LS-tetrasaccharide b) 및 Lewis 에이(Lewis a trisaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 다당류는 GM1 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide; Gal-GalNAc[Neu5Ac]-Gal-Glc), 아시알로 GM1(asialo GM1; Gal-GalNAc-Gal-Glc) 및 GM3 강글리오사이드(GM3 ganglioside; Neu5Ac-Gal-Glc)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 당류는 당단백질 또는 당지질에서 분리된 당류를 사용할 수도 있으나, 당단백질 또는 당지질 자체를 사용할 수도 있다.
본 발명의 당류의 고정화 방법에 사용될 수 있는 아민 화합물은 아민기(-NH2)를 가지고 있는 화합물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 아민 화합물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 NH2-R-NH2로 표시되는 화합물일 수 있고 이때 상기 R은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 탄소수 6 내지 20의 아릴기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아민 화합물로 아미노에틸 아닐린(aminoethyl aniline) 또는 아미노벤질아민(4-aminobenzylamine)을 사용할 수 있으며 상기 R이 아릴기인 경우 아릴기의 방향족 링에 N을 포함하지 않는 것이 보다 바람직하다. 이는 방향족 링에 N을 포함하지 않는 아릴기는 소수성(hydrophobic) 특성을 나타내어 분리 정제 시 용이할 수 있기 때문이다.
상기 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아민 화합물을 반응시키면, 상기 환원당에 포함된 알데하이드기는 쉬프 베이스 반응(Schiff base reaction)을 통하여 상기 아민 화합물의 아민기의 질소 원자로부터 전자를 받아 -CH=N- 결합을 형성한다. 상기 반응을 위하여 아민 화합물은 용매에 녹여 사용할 수도 있으며, 상기 용매는 아민 화합물의 종류에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 아미노에틸 아닐린의 경우 아세트산(acetic acid), 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile) 등에 녹여 사용될 수 있다.
상기 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아민 화합물은 바람직하게는 당류 1몰에 대하여 아민 화합물 1몰을 반응시키는 것이 바람직하며, 반응 온도 및 반응 시간은 20℃ 내지 90℃에서 30분 내지 2시간이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 40℃에서 1시간 동안 반응시킬 수 있다.
또한 상기 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아민 화합물을 반응하여 생성된 -CH=N- 결합을 안정화시킴으로써 당류를 더욱 강하게 고정화시키기 위해, 상기 아민기가 도입된 당류를 환원시킬 수 있다. 상기 환원 과정을 통하여 상기 아민기가 도입된 당류는 -CH2-NH- 결합을 가질 수 있다. 상기 환원 과정에 사용될 수 있는 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 디메틸아민 보란(dimethylamine borane), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 시아노 보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 아민기가 도입된 당류 1몰에 대하여 환원제를 1 내지 10몰로 사용할 수 있으며, 상기 환원제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 20℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 2 동안 처리할 수 있다.
또한 당류에 아민기를 도입한 다음, 실제 아민기에 당류가 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여 당업계에 공지된 HPLC 분석, 질량분석, 1H NMR 분석 방법을 사용할 수 있다(<실시예 2> 참조).
상기 아민기가 도입된 당류를 고체 기재에 고정화 시키기 위하여, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 기재를 사용할 수 있으며, 상기 고체 기재는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 아민기가 도입된 당류의 아민기와 결합할 수 있는 작용기를 포함하도록 처리된 것이 바람직하다. 상기 작용기는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 알데하이드(aldehyde), 케톤(keton), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 에폭시드(epoxide), 이미도에스터(imidoester), 무수물(anhydride) 및 카보네이트(carbonate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 고체기재에 작용기를 처리하기 위해서 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 작용기가 처리된 고체기재를 구입하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 일실시예에서는 N-하이드록시숙신이미드가 처리된 상업화된 글라스 슬라이드를 구입하여 사용하였다(<실시예 3> 참조).
상기 아민기가 도입된 당류를 고체 기재 표면에 고정화시키기 위하여, 당업자에게 공지된 코팅기술을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 당류를 고체 기재 표면에 분무, 분사, 페인팅, 침지, 스포팅(spotting), 롤코팅 또는 플로우 코팅 방법을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 아민기가 도입된 당류를 핀을 이용하여 스포팅(spotting)하는 방법을 사용할 수 있다.
한편 본 발명의 탄수화물 칩은 상기 당류의 고정화 방법에 의하여 고정화된 당류 및 고체 기재를 포함한다. 상기 탄수화물 칩은 단당류 또는 다당류의 탄수화물을 고밀도로 고체 기재 표면에 일정한 간격으로 고정화시킨 마이크로 칩을 말한다.
또한 상기 탄수화물 칩은 이에 생체분자를 투여하여 탄수화물과 생체분자의 결합여부를 확인하는 단계를 포함하는 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법에 사용될 수 있으며, 또는 탄수화물과 상호작용하는 생체분자를 검출하는 방법에 사용될 수 있다.
상기 생체분자는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 핵산 또는 단백질일 수 있다.
상기 탄수화물과 생체분자의 결합여부는 이에 한정되지 않지만 생체분자에 당업자에게 공지된 형광물질을 삽입하고, 상기 탄수화물 칩에 투여한 다음, 당업자에게 공지된 형광이미지 분석방법을 이용함으로써 확인할 수 있다. 또한 탄수화물과 상호작용하는 생체분자를 검출하기 위하여 상기 탄수화물 칩에 시료를 투여하여 상 기와 같이 탄수화물과 결합하지 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여 단백질과의 상호작용 여부를 확인하기 위해, 단백질의 검출 제한 농도는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 5 ng/ml 내지 2.5 mg/ml 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 mg/ml 내지 2.5 mg/ml일 수 있다(<실시예 5> 참조).
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 탄수화물 칩을 사용하여 당류와 콘카나발린 에이(Concanavalin A, Con A)의 상호작용 여부, 당류와 리시누스 코뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis Agglutinin, RCA)의 상호작용 여부 및 당류와 밀배아응집소(wheat germ agglutinin, WGA)의 상호작용 여부를 분석하였다(<실시예 4> 참조). 또한 실제 생체내 고분자로써 병원성 균인 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 유래의 단백질인 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트와 당류의 상호작용 여부도 분석하였다(<실시예 6> 참조).
본 발명의 당류의 고정화 방법은 당류의 구조나 방향성에 변화를 주지 않고, 당류를 고체 기재에 직접 고정화할 수 있는 방법으로, 상기 방법으로 제조된 탄수화물 칩은 당류와 생체분자간의 상호작용을 용이하게 분석하여 맞춤형 바이오센서, 신약 개발 등 다양한 응용분양에 널리 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
아민기(-NH 2 )가 도입된 당류의 제조
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 물에 녹인 당 100 mM과 100 % 아세트산으로 녹인 아미노에틸 아닐린 100 mM를 부피비 1:1로 섞은 다음, 쉬프 베이스 반응(schiff base reaction)을 이용하여, 상기 당의 알데하이드기와 아미노에틸 아닐린의 아민기와 40℃에서 1시간 동안 반응시켜 당류에 아민기를 도입하였다 (Guttman A, Chen F-TA, Evangelista RA, Cooke N, et al., High-Resolution Capillary Gel Electrophoresis of Reducing Oligosaccharides Labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Anal . Chem . 233: 234-242, 1996). 상기 반응이 완료된 다음, 100 mM 디메틸아민 보란을 첨가하여 1시간 정도 환원반응을 시켰다 (도 2 및 3 참조).
< 실시예 2>
아민기가 도입된 당류의 분석
<2-1> HPLC 분석
상기 <실시예 1>에서 아민기가 도입된 당류의 수득여부를 확인하기 위하여 당업자에게 널리 알려진 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하고 그 결과를 도 4에 기재하였다.
상기 도 4에 기재한 바와 같이, 상기 HPLC 수행시 0.5 ml/분으로 유속을 유지하고 0.1 % 트리플루오로아세트 산(trifluoroacetic acid)를 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile)을 10%에서 50%으로 선형적으로 증가시킨 경우 6.460 분에서 88.8 %의 순도로 아민기가 도입된 락토오스가 제조됨을 확인하였다. 또한 상기와 동일한 조건으로 HPLC를 수행한 경우 10.152분에서 92.9%의 순도로 아민기가 도입된 말토오스가 제조됨을 확인하였다.
<2-2> 질량분석
상기 <실시예 1>에서 아민기가 도입된 당류의 분자량을 측정함으로써 아민기가 도입된 당류의 수득여부를 다시 확인하였다.
상기 <실시예 1>에서 아민기가 도입된 당류를 별도로 분리나 정제하지 않고, 당업자에게 널리 알려진 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) MS분석을 수행하고 그 결과를 도 5 및 도 6에 기재하였다(Seo JH, Adachi K, Lee BK, Kang DG, Kim YK, Kim KR, Lee HY, Kawai T, Cha HJ, et al., Facile and Rapid Direct Gold Surface Immobilization with Controlled Orientation for Carbohydrates. Bioconjugate Chem. 18: 2197-2201, 2007).
상기 도 5 및 도 6에 기재한 바와 같이, 아민기가 도입된 락토오스 또는 말토오스의 경우 알데하이드기의 수정(modification) 반응이 일어나면 463에서 메인피 크를 보이게 되는데, 463-464에서 메인피크가 발생하므로 아민기가 도입된 락토오스 (도 5) 또는 말토오스 (도 6)가 제조됨을 확인할 수 있었다.
<2-3> 1 H NMR 분석
상기 <실시예 1>에서 아민기가 도입된 당류의 1H NMR 분석을 통하여 아민기가 도입된 당류의 수득여부를 다시 확인하였다. 구체적으로 1H NMR을 통해서 알데하이드기 수정(modification) 반응이 제대로 일어났는지를 프로톤 수를 통해서 확인할 수 있으며 당류의 알데하이드기가 아민 화합물의 두 개의 아민기 중 어떤 아민기와 주로 결합하는지도 알 수 있다. 상기 분석 결과를 도 7 및 도 8에 기재하였다.
상기 도 7은 아민기가 도입된 락토오스의 프로톤 수를 분석한 1H NMR 그래프이며, 상기 도 8은 아민기가 도입된 말토오스의 프로톤 수를 분석한 1H NMR 그래프이다. 상기 도 7 및 도 8에 기재한 바와 같이, 아민 화합물의 두 개의 아민기 중 하나의 아민기가 당류의 알데하이드기와 결합하여 아민기가 도입된 락토오스와 말토오스가 제조됨을 확인하였다.
< 실시예 3>
아민기가 도입된 당류를 이용한 탄수화물 칩의 제조
상기 <실시예 1>에서 제조된 아민기가 도입된 당류들을 150mM 인산염(phosphate), 0.04% 트윈 20(Tween 20), 5% 글리세롤(glycerol), 0.1mg/ml 보비인 세룸 알부민(bovine serum albumin: BSA)으로 구성된 pH 8.5의 프린트 용액(print buffer)에 녹인 다음 Chip Maker 2 핀(pin)과 Microssys 5100 microarrayer를 이용해서 75% 습도 하에 N-하이드록시숙신이미드로 처리된 글라스 슬라이드(Schott Nexterion, 독일)에 찍은 다음 같은 습도 조건 하에서 12시간 이상 반응시켜 탄수화물 칩을 제작하였다.
< 실시예 4>
탄수화물 칩을 이용한 단백질과의 상호작용 분석
상기 <실시예 3>에 기재된 방법을 이용해 도 9에 기재된 탄수화물 칩의 플랫폼을 제조하여 하기 실험을 진행하였다.
<4-1> 당류와 콘카나발린 에이(Concanavalin A, Con A)의 상호작용 분석
콘카나발린 에이는 터미날 글루코스(terminal glucose)와 터미날 만노오스(terminal mannose)에 높은 친화력을 가지고 있지만 터미날 글루코스에 비해 터미날 만노오스에 더 높은 친화력을 가지고 있다고 알려져 있다 (Brewer CF, Bhattacharyya L, et al., Specificity of Concanavalin A Binding to Asparagine-linked Glycopeptides. J. Biol . Chem . 261: 7306-7310, 1986).
상기 <실시예 3>에서 제조된 아민기가 도입된 당류가 고정되어 있는 탄수화 물 칩에서 반응하지 않은 N-하이드록시숙신이미드을 불활성시키기 위해, 50mM 붕산 나트륨(sodium borate)에 50mM 에탄올아민(ethanolamine)을 녹인 pH 8.0의 블로킹 용액과 한 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 블로킹 용액을 제거하고 137mM 염화나트륨(NaCl), 2.7mM 염화칼륨, 4.3mM 인산이수소나트륨(Na2HPO4), 1.4mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 그리고 0.5% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 pH 7.5의 워싱 용액 Ⅰ(washing buffer Ⅰ)과 워싱 용액 Ⅰ에서 0.5% 트윈 20(Tween 20)을 제외한 pH 7.5의 워싱 용액 Ⅱ(washing buffer Ⅱ)로 반응하지 않고 남아있는 블로킹 용액을 씻어내고 원심분리기(centrifugal machine)을 이용해서 건조시켰다. 당류와 콘카나발린 에이 간의 상호작용을 분석하기 위해서, 형광물질인 로다민이 결합된 콘카나발린 에이 40㎕을 탄수화물 칩 위에 떨어뜨린 다음 커버 글라스를 덮어 75% 항습기(humidity chamber)에서 한 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 워싱 용액 Ⅰ과 워싱 용액 Ⅱ을 이용해서 반응하지 않고 남아있는 콘카나발린 에이를 제거하였다. 이후 원심분리기를 이용해서 건조시킨 다음 공초점 레이저 스캐너(confocal laser scanner)를 이용해서 당류들과 콘카나발린 에이 간의 상호작용을 형광이미지로 분석하였다.
상기와 같은 분석결과를 도 10a 및 10b에 나타내었다. 구체적으로 상기 도 10a는 고체 기재 표면에 고정화된 여섯 가지의 이당류들과 로다민(rhodamine)이 붙은 콘카나발린 에이 간의 상호작용을 당업계에 공지된 공초점 레이져 스캐너(confocal laser scanner)인 ScanArray Lite를 통한 형광이미지를 보여주는 도면이며, 도 10b는 도 10a의 일부분을 확대한 도면이다.
상기 도 10a 및 도 10b에 기재한 바와 같이, 콘카나발린 에이는 터미날 글루코오스를 가진 말토오스와 터미날 만노오스를 가진 α1-3 만노비오스(α1-3 mannobiose)에 결합한 것을 알 수 있었으며, 특히 터미날 글루코스를 가진 이당류에 비해 터미날 만노오스를 가진 이당류에 높은 친화력을 가지고 결합하였다는 것을 알 수 있었다.
<4-2> 당류와 리시누스 코뮤니스 아글루티닌( Ricinus communis Agglutinin , RCA )의 상호작용 분석
리시누스 코뮤니스 아글루티닌은 터미날 갈락토스 (terminal galactose)에 대해 높은 친화력을 가지는데, 특히 β1-4 결합을 가진 터미날 갈락토스의 경우 다른 결합을 가진 터미날 갈락토스에 비해 높은 친화력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다 (Baenziger JU, Fiete D, et al., Structural Determinants of Ricinus communis Agglutinin and Toxin Specificity for Oligosaccharide. J. Biol . Chem . 254: 9795-9799, 1979; Green ED, Brodbeck RM, Baenziger JU, et al., Lectin Affinity High-perfomance Liquid Chromatography. J. Biol . Chem . 262: 12030-12039: 7306-7310, 1987).
상기와 같은 사실을 바탕으로 상기 <실시예 4-1>과 동일한 방법으로, 본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여, 당류와 리시누스 코뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis Agglutinin, RCA)의 상호작용을 분석하고 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 기재하였다. 구체적으로 상기 도 11a는 고체 기재 표면에 고정화된 여섯 가지의 이 당류들과 로다민이 붙은 리시누스 코뮤니스 아글루티닌 간의 상호작용을 당업계에 공지된 공초점 레이져 스캐너(confocal laser scanner)인 ScanArray Lite를 통해 형광이미지로 보여주는 도면이며, 도 11b는 도 11a의 일부분을 확대한 도면이다.
상기 도 11a 및 도 11b에 기재한 바와 같이, 리시누스 코뮤니스 아글루티닌은 터미날 갈락토스를 가지는 두 가지 이당류인 락토오스와 β1-6 갈락토비오스에 결합한다는 것을 알 수 있었으며, β1-6 결합을 가진 갈락토비오스에 비해 β1-4 결합을 가진 락토오스에 더 높은 친화력을 가지고 결합한다는 것을 알 수 있었다.
<4-3> 당류와 밀배아응집소( wheat germ agglutinin , WGA )의 상호작용 분석
밀배아응집소는 터미날 N-아세틸글루코사민 (terminal N-acetylglucosamine)에 높은 친화력을 가지고 있지만, N-아세틸글루코사민의 수가 많을수록 더 높은 친화력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다 (Nagata Y, Burger MM, et al., Wheat Germ Agglutinin. J. Biol . Chem . 249: 3116-3122, 1974).
상기와 같은 사실을 바탕으로 상기 <실시예 4-1>과 동일한 방법으로, 본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여, 당류와 밀배아응집소의 상호작용을 분석하고 그 결과를 도 12a 및 도 12b에 기재하였다. 구체적으로 상기 도 12a는 고체 기재 표면에 고정화된 여섯 가지의 이당류들과 로다민이 붙은 밀배아응집소간의 상호작용을 당업계에 공지된 공초점 레이져 스캐너(confocal laser scanner)인 ScanArray Lite를 통해 형광이미지로 보여주는 도면이며, 도 12b는 도 12a의 일부분을 확대한 도면이다.
상기 도 12a 및 도 12b에 기재한 바와 같이, 밀배아응집소는 터미날 N-아세틸글루코사민을 가진 N,N'-디아세틸키토비오스 (N,N'-diacetylchitobiose)와 β1-2 N-아세틸글루코사민 만노오스 (β1-2 N-acetylglucosamine mannose)에 결합한다는 것을 알 수 있었으며, 특히 두 개의 N-아세틸글루코사민을 가진 N,N'-디아세틸키토비오스의 경우 하나의 N-아세틸글루코사민을 가진 β1-2 N-아세틸글루코사민 만노오스에 비해 높은 친화력을 가진다는 것을 알 수 있었다.
이상과 같이, 상기 <실시예 4>를 통하여 본 발명에 의해 제조된 탄수화물 칩이 당류와 생체 분자들간의 상호작용을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 5>
탄수화물 칩의 검출 제한 농도
<5-1> 단백질의 검출 제한 농도
상기 <실시예 3>에 기재된 방법을 이용하여 도 13에 기재된 탄수화물 칩의 플랫폼을 제조하여 하기 실험을 진행하였다.
상기 <실시예 1>에서 제조된 N,N'-디아세틸키토비오스를 아민기와 반응할 수 있는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)로 표면 처리된 글라스 슬라이드에 고정화한 다음, 상기 <실시예 4-3>과 동일한 방법으로 2.5 mg/ml에서 5 ng/ml까지 다양한 농도의 밀배아응집소와 반응시킨 후 그 결과를 도 14에 기재하였다.
상기 도 14에 기재한 바와 같이, 2.5 mg/ml에서 1 mg/ml까지는 형광세기가 비슷하지만 그 이하의 농도에서는 농도가 감소하면 할수록 형광세기가 더욱 감소함을 알 수 있었다. 특히 5 ng/ml의 밀배아응집소의 경우에도 본 발명의 탄수화물 칩으로 검출이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
<5-2> 탄수화물의 최소 농도
본 발명자들은 상기 탄수화물 칩을 이용해서 일정한 농도의 렉틴이 존재하였을 때, 렉틴과 상호작용할 수 있는 칩 상의 탄수화물의 최소 농도를 확인하기 위하여 하기 실험을 진행하였다.
상기 <실시예 3>에 기재된 방법을 이용하여 도 15에 기재된 탄수화물 칩의 플랫폼을 제조하여 하기 실험을 진행하였다.
상기 <실시예 1>에서 제조된 N,N'-디아세틸키토비오스를 여러 가지 농도로 고체 기재 표면에 고정하였다. 보다 구체적으로 100 mM, 10 mM, 5 mM, 1 mM, 500 μM, 100 μM 농도로 아민기와 결합할 수 있는 N-하이드록시숙신이미드로 표면 처리된 글라스 슬라이드에 고정화한 다음, 상기 <실시예 4-3>과 동일한 방법으로 1 mg/ml 농도의 로다민이 붙은 밀배아응집소를 처리하여 당류의 검출 제한 농도를 확인하고 그 결과를 도 16a 및 도 16b에 기재하였다. 구체적으로 상기 도 16a는 N,N'-디아세틸키토비오스를 여러 가지 농도로 고체 기재 표면에 고정화한 후 형광이 달린 밀배아응집소를 검출할 수 있는 당류의 농도를 공초점 레이져 스캐너(confocal laser scanner)인 ScanArray Lite를 통해 형광이미지로 분석한 전체적 인 도면이며, 도 16b는 도 16a의 일부분을 확대한 도면이다.
상기 도 16a 및 도 16b에 기재한 바와 같이, 100 mM에서 1 mM 까지의 N,N'-디아세틸키토비오스는 검출이 가능할 만큼의 형광세기를 보였지만 1 mM 이하의 N,N'-디아세틸키토비오스는 매우 약한 형광세기를 보이는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 6>
탄수화물 칩을 이용한 세포 내 상호작용 분석
상기 <실시예 3>에 기재된 방법을 이용하여 도 17에 기재된 탄수화물 칩의 플랫폼을 제조하여 하기 실험을 진행하였다.
상기 <실시예 1>에서 제조된 GM1 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide), 아시알로 GM1(asialo GM1) 그리고 GM3 강글리오사이드(GM3 ganglioside)를 N-하이드록실숙신이미드로 표면 처리된 글라스 슬라이드에 고정화한 다음, 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC)이 붙은 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트(Vibrio cholera toxin B subunit)와 반응시켰다. 상기 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트는 병원성 균인 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 유래의 단백질로서 호스트 세포(host cell) 표면에 존재하는 GM1 펜타사카라이드를 인식하여 비브리오 콜레라를 호스트 세포에 유입시키는 활성이 있다(KAPER JB, MORRIS Jr. JG, Levine MM, et al., Cholera. Clin . Microbiol . Rev . 8: 48-86; 1995). 상기 실험결과를 도 18a 내지 18c에 기재하였다. 구체적으로 상기 도 18a는 고체 기재 표면에 고정화된 GM1 펜타사카라이드와 GM1 유사체들과 형광이 달린 비 브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트 간의 상호작용을 공초점 레이져 스캐너(confocal laser scanner)인 ScanArray Lite를 통해 형광이미지로 분석한 전체적인 그림이고, 도 18b는 도 18a의 일부분을 확대한 그림이며, 도 18c는 도 18b에서 보여주는 GM1 펜타사카라이드, 아시알로 GM1 그리고 GM3 강글리오사이드와 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트이 달린 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트 간의 상호작용에 의한 형광세기를 Gel-Pro Analyzer 프로그램을 통해 분석한 막대 그래프이다.
상기 도 18a 내지 18c에 기재한 바와 같이, 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트는 GM1 펜타사카라이드와 매우 높은 친화력을 보이지만 GM1 유사체들인 아시알로 GM1 그리고 GM3 강글리오사이드와는 매우 약한 친화력을 보인다는 것을 형광세기로 확인하였다. 따라서 본 발명의 탄수화물 칩은 세포 내의 상호작용을 분석하기 위한 기구로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
도 1은 아민기(-NH2)가 도입된 당류를 고체 기재 표면에 고정화시켜 탄수화물 칩을 제작하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2은 이당류에 아민기를 도입하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 다당류에 아민기를 도입하는 방법을 나타내는 모식도이다. (GM1 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide): Gal-GalNAc[Neu5Ac]-Gal-Glc, 아시알로 GM1(asialo GM1): Gal-GalNAc-Gal-Glc 및 GM3 강글리오사이드(GM3 ganglioside): Neu5Ac-Gal-Glc)
도 4은 HPLC를 이용하여 아민기가 도입된 락토오스와 말토오스의 순도를 분석한 그래프이다.
도 5는 아민기가 도입된 락토오스의 MALDI-TOF MS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아민기가 도입된 말토오스의 MALDI-TOF MS 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 아민기가 도입된 락토오스의 1H NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 아민기가 도입된 말토오스의 1H NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 당류와 생체 분자들간의 상호작용을 분석하기 위한 탄수화물 칩의 플랫폼을 예시한 그림이다. (Con A: 콘카나발린 에이, RCA: Ricinus communis agglutinin, WGA: wheat germ agglutinin)
도 10a는 본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여 당류와 콘카나발린 에이 간의 상호작용을 형광이미지 분석방법을 이용하여 분석한 전체적인 그림이다.
도 10b는 도 10a의 전체적인 그림의 일부분을 확대한 그림이다.
도 11a는 본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여 당류와 리시누스 코뮤니스 아글루티닌 간의 상호작용을 형광이미지 분석방법을 이용하여 분석한 전체적인 그림이다.
도 11b는 도 11a의 전체적인 그림의 일부분을 확대한 그림이다.
도 12a는 본 발명의 탄수화물 칩을 이용하여 당류와 밀배아응집소 간의 상호작용을 형광이미지 분석방법을 이용하여 분석한 전체적인 그림이다.
도 12b는 도 12a의 전체적인 그림의 일부분을 확대한 그림이다.
도 13은 단백질의 검출 제한 농도를 분석하기 위한 탄수화물 칩의 플랫폼을 예시한 그림이다.
도 14는 탄수화물 칩을 이용하여 밀배아응집소의 검출 제한 농도를 분석한 그림이다.
도 15는 탄수화물의 검출 제한 농도를 분석하기 위한 탄수화물 칩의 플랫폼을 예시한 그림이다.
도 16a는 탄수화물 칩을 이용하여 당류의 검출 제한 농도를 분석한 전체적인 그림이다.
도 16b는 도 16a의 전체적인 그림의 일부분을 확대한 그림이다.
도 17은 당류와 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트(Vibrio cholera toxin B subunit)의 상호작용을 분석하기 위한 탄수화물 칩의 플랫폼이다.
도 18a는 탄수화물 칩을 이용하여 당류와 비브리오 콜레라 톡신 비 서브유니트의 상호작용을 분석한 전체적인 그림이다.
도 18b는 도 18a의 전체적인 그림의 일부분을 확대한 그림이다.
도 18c는 18b에 나타난 형광세기를 분석한 막대 그래프이다 (GM1: GM1 펜타사카라이드, asialo GM1: 아시알로 GM1, GM3: GM3 강글리오사이드).

Claims (16)

  1. (a) 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아미노에틸 아닐린(aminoethyl aniline)을 반응시켜 당류에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
    (b) 아민기가 도입된 당류를 유리에 고정화하는 단계; 및
    (c) 상기 당류가 고정화된 유리 표면에 형광물질과 결합한 생체분자를 투여하여 형광이미지 분석을 통해 당류와 생체분자의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환원당을 가지고 있는 당류는 단당류(monosaccharide), 이당류, 올리고당(oligosaccharide) 및 다당류(polysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이당류는 셀로비오스(cellobiose), 니게로스(nigerose), 이소말토스(isomaltose), 멜리비오스(melibiose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 키토비오스(chitobiose), 갈락토비오스(galactobiose), 만노오스(mannose) 및 만노비오스(mannobiose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 올리고당은 LS-테트라사카라이드 비(LS-tetrasaccharide b) 및 Lewis 에이(Lewis a trisaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 다당류는 GM1 펜타사카라이드(GM1 pentasaccharide; Gal-GalNAc[Neu5Ac]-Gal-Glc), 아시알로 GM1(asialo GM1; Gal-GalNAc-Gal-Glc) 및 GM3 강글리오사이드(GM3 ganglioside; Neu5Ac-Gal-Glc)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아미노에틸아닐린을 20℃ 내지 90℃에서 30분 내지 2시간 동안 반응시키는 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에 아민기가 도입된 당류를 환원시키는 단계를 추가적으로 포함하는 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 환원은 디메틸아민 보란(dimethylamine borane), 소듐보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 환원제를 처리하는 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 환원제의 처리는 환원제를 20℃ 내지 80℃에서 1시간 내지 2 동안 처리하는 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 유리는 알데하이드(aldehyde), 케톤(keton), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 에폭시드(epoxide), 이미도에스터(imidoester), 무수물(anhydride) 및 카보네이트(carbonate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기가 도입된 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 아민기가 도입된 당류를 유리 표면에 분무, 분사, 페인팅, 침지, 스포팅(spotting), 롤코팅 또는 플로우 코팅하여 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
  14. (a) 환원당을 가지고 있는 당류(saccharide)와 아미노에틸 아닐린(aminoethyl aniline)을 반응시켜 당류에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계 및 (b) 아민기가 도입된 당류를 유리에 고정화하는 단계에 의하여 고정화된 당류 및 유리를 포함하는 탄수화물 칩.
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서, 상기 생체분자는 핵산 또는 단백질인 것인 탄수화물과 생체분자의 상호작용 유무를 확인하는 방법.
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