CN110221006A - 一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法。该方法包括将巯基多肽进行烷基化，同时还对血样进行SSA蛋白沉淀。前处理无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下即可完成反应，可及时锁定巯基多肽的真实水平。巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法准确度和精密度更高。本发明还公开了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法。

Description

一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本 的检测方法

技术领域

本发明涉及仪器分析质谱检测领域，特别是涉及一种生物样本中含有自由巯基多肽的烷基化前处理和串联质谱检测方法。

背景技术

目前针对生物样本中含有巯基多肽的检测，全血分离出血浆后，在特定温度或pH条件下，用自合成的芳香季胺化咪唑进行较长时间衍生处理，使用灵敏度较低的方法进行检测。

目前生物样本中含巯基多肽的衍生化方法存在许多不足：

1、样本前处理复杂，部分需要预先分离出血浆；

2、操作烦琐，需要在特定温度，特定pH条件下反应；

3、所需时间长，衍生化不彻底，重复性和灵敏度差；

4、衍生化处理后直接上机检测，或使用pH接近中性或偏碱性的蛋白沉淀试剂，如甲醇、乙腈等，这类试剂沉淀蛋白效果不佳，导致杂质残留多，影响目标物的检测和分离。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，所述方法包括：

步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；

步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；

步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；

步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；

步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；

步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。

在一些实施例中，所述步骤01中的巯基烷化剂包括N-R基顺丁烯二酰亚胺。

在一些实施例中，所述N-R基顺丁烯二酰亚胺为N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺中的一种或几种。

在一些实施例中，所述步骤01中制备巯基烷化剂包括：

步骤11、准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠；

步骤12、将步骤11中称取的N-乙基顺丁烯二酰亚胺和乙二胺四乙酸二钠加入到40ml的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。

在一些实施例中，所述步骤03中充分混匀后需要在室温中静置15min。

在一些实施例中，所述步骤04中的SSA蛋白沉淀剂浓度为8％，离心处理条件：离心转速为15000rpm，温度为4摄氏度，离心时间为5min。

在一些实施例中，所述步骤05中上清液的体积为10μL，超纯水的体积为990μL。

在一些实施例中，所述步骤06具体为：

从步骤05各管中取出10μL混合液，分别加入含有990μL超纯水的1.5mLEP管中，涡旋混匀，转移200μL到96孔板中，封膜待测。

在一些实施例中，所述待测样品用EDTA抗凝管采集健康人全血后上下颠倒混匀；所述待测样品为抗凝全血、血清、血浆或者唾液中一种。

本发明还提出了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法，所述方法包括：

步骤01、将待测样品和标曲工作液按照上述的前处理方法进行处理；

步骤02、设置前处理后的标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的样品和前处理后的标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，进样量10μL，乙腈溶液为流动相B，甲酸铵和甲酸的混合溶液为流动相A，采用多反应监测模式进行检测。

本发明的有益效果是：本发明前处理方法简单，无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下15min就可完成反应，无需在特定温度或pH条件下反应，可及时锁定含巯基多肽的真实水平。含巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量含巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法经过方法学验证，准确度和精密度更高。

附图说明

图1为本发明较佳实施例一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法示意图；

图2为本发明实施例1中的线性回归曲线；

图3为本发明实施例3中的SSA蛋白沉淀色谱图；

图4为本发明实施例3中的未沉淀蛋白色谱图；

图5为本发明实施例4中的健康人GSH浓度分布图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

参照图1所示，本发明公开了一种含巯基的多肽—谷胱甘肽(GSH)的前处理方法，所述方法包括：

步骤1：在六个1.5mLEP管中加入200μL的巯基烷化剂，标记为1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管；

步骤2：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管加入100μL的C1-C5标曲工作液(其中C1-C5标曲工作液的浓度和配置方法参照图表1)，往6号EP管中加入待测样品；

步骤3：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管中各加入10μL的GSH-IS工作液，充分混匀后在室温中静置15min；

步骤4：分别往1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管加入200μL的8％SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，15000rpm，4℃离心5min；

步骤5：分别从1号EP管、2号EP管、3号EP管、4号EP管、5号EP管和6号EP管中取出10μL上清液，分别加入到含990μL超纯水的1.5mL EP管中，涡旋混匀；

步骤6：从步骤5各管中取出10μL，分别加入含有990μL超纯水的1.5mLEP管中，涡旋混匀，转移200μL到96孔板中，封膜待测。

需要说明的是，待测样品为抗凝全血、血清、血浆或者唾液中一种，优选地为EDTA抗凝全血。用EDTA抗凝管采集健康人全血后上下颠倒混匀，如样品未能及时检测，需冷藏保存。

巯基烷化剂包含N-R基顺丁烯二酰亚胺，如N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺等，优选的为N-乙基顺丁烯二酰亚胺。

巯基烷化剂制备方法如下：准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，加入到40mL的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。

8％SSA蛋白沉淀剂通过准确称取3.2g的5-磺基水杨酸(SSA)溶解于40mL的超纯水中制得。

GSH储备液即为还原型谷胱甘肽(GSH)储备液,其制备过程如下：准确称量50mgGSH，加入含50mL 15％甲醇的容量瓶中，摇匀。按每管0.5mL分装到1.5mL EP管中，-20℃储存备用。

GSH标曲工作液以GSH储备液为基础，配制而成，具体方法参照表1所示。

GSH-IS储备液即为还原型谷胱甘肽内标储备液(GSH-IS)，其制备过程如下：将0.25mg的GSH-IS溶解到10mL 15％甲醇的容量瓶中，摇匀。按每管0.1mL分装到1.5mL EP管中，-20℃储存备用。

GSH-IS标曲工作液通过将GSH-IS储备液涡旋10秒，取100μL GSH-IS储备液加到900μL超纯水中，涡旋10秒备用。

需要注意的是，将GSH,GSH-IS储备液从-20℃冰箱拿出，室温放置20min备用。

图表1不同浓度的GSH标曲工作液的配制方法

本发明还提出了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法，所述方法包括：

步骤01、将待测样品和标曲工作液按照上述的前处理方法进行处理；

步骤02、设置前处理后的标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的样品和前处理后的标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，进样量10μL，乙腈溶液为流动相B，甲酸铵和甲酸的混合溶液为流动相A，采用多反应监测模式进行检测。

具体地，流动相A为在500mL的超纯水中加入315mg甲酸铵和800μL甲酸，超声10min备用。

流动相B为500mL乙腈，超声10min备用。

其中液相色谱梯度条件见图表2：

图表2液相色谱梯度

其中质谱条件参照图表3：

图表3源气参数

气帘气(Psi)	45
		碰撞气(Psi)	8
喷雾电压(V)	5000
		源温度(℃)	550
雾化气(Psi)	60
		辅助气(Psi)	60

采用多反应检测模式检测GSH和GSH-IS，具体参数见图表4：

图表4多反应监测参数

实施例1

参照图2所示，用本发明所述方法进行方法学验证线性实验。配制浓度为203、406、812、1624、3248μM的GSH标准溶液，采用内标法进行线性回归分析，计算相关系数R2。相关系数为0.9998，说明峰面积与标准品浓度成正比，线性良好。

实施例2

根据本发明方法，按以下方式制备样品进行检测。

在已知GSH含量的样品(785μM)中加入低、高浓度的GSH标准品，每个浓度制备6份，并检测其响应值，计算回收率和变异系数(CV)，评估方法的准确度和精密度。方法学验证准确度和精密度实验结果见图表5，结果显示低高浓度GSH的回收率分别为97％和102％，CV在5％以内，说明本方法具有较高的准确度和精密度。

图表5准确度和精密度结果

实施例3

参照图3、图4所示，为了评价SSA沉淀蛋白效果，对比步骤4中是否加入SSA沉淀蛋白对检测结果的影响，进行实验，并描绘成图。结果显示，SSA沉淀蛋白后(图2)峰型比未蛋白沉淀(图3)的要好，干扰也较小。

实施例4

参照图5所示，采集46名年龄由12-73岁的健康人EDTA抗凝全血，检测结果显示健康人中GSH浓度为1086±444μM，GSH水平随着年龄增长而降低(r＝-0.24)。通过检测全血中GSH含量可以大致评判人体的抗氧化水平。

实施例5

取同一个健康人的EDTA抗凝全血，分成5份后进行烷基化前处理，然后分别在第1,2,3,4,5天进行检测，考察其稳定性。结果显示这5天结果的CV值在3％以内，证明GSH经过烷基化后较为稳定，不会受到其他氧化剂的影响，结果见图表6。

图表6稳定性结果

综上所述，本发明前处理方法简单，无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下15min就可完成反应，无需在特定温度或pH条件下反应，可及时锁定含巯基多肽的真实水平。含巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量含巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法经过方法学验证，准确度和精密度更高。

以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；

步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；

步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；

步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；

步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；

步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。

2.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤01中的巯基烷化剂包括N-R基顺丁烯二酰亚胺。

3.根据权利要求2所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述N-R基顺丁烯二酰亚胺为N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤01中制备巯基烷化剂包括：

步骤11、准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠；

步骤12、将步骤11中称取的N-乙基顺丁烯二酰亚胺和乙二胺四乙酸二钠加入到40mL的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。

5.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤03中充分混匀后需要在室温中静置15min。

6.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤04中的SSA蛋白沉淀剂浓度为8％，离心处理条件：离心转速为15000rpm，温度为4摄氏度，离心时间为5min。

7.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤05中上清液的体积为10μL，超纯水的体积为990μL。

8.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述步骤06具体为：

从步骤05各管中取出10μL混合液，分别加入含有990μL超纯水的1.5mL EP管中，涡旋混匀，转移200μL到96孔板中，封膜待测。

9.根据权利要求1所述的针对巯基多肽生物样本的前处理方法，其特征在于，所述待测样品用EDTA抗凝管采集健康人全血后上下颠倒混匀；所述待测样品为抗凝全血、血清、血浆或者唾液中一种。

10.一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、将待测样品和标曲工作液按照权利要求1-9中任意一项所述的前处理方法进行处理；

步骤02、设置前处理后的标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的样品和前处理后的标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，进样量10μL，乙腈溶液为流动相B，甲酸铵和甲酸的混合溶液为流动相A，采用多反应监测模式进行检测。