CN117606896A - 一种人血清样品中gnp浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血清样品中GNP浓度的检测方法，所述检测方法包括人血清样本的前处理方法及酶联免疫检测。人血清中的基质成分对传统GNP多肽的酶联免疫检测有显著干扰，空白血清测定响应值存在较大差异，影响实验结果的准确性。本发明公开了一种快速简便且成本低廉的前处理方法，能有效降低人血清样品中的基质干扰。并对传统GNP多肽的酶联免疫检测进行了改进，以适用人血清样品GNP浓度的检测，其标准曲线的有效定量分析范围为3.125ng/mL～200ng/mL，且准确性、精密度和选择性等均满足相关法规需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种人血清样品中GNP浓度的检测方法。
背景技术
GNP属于利钠肽家族，是从东非绿曼巴蛇的毒腺组织中分离得到的一种由38个氨基酸组成的小分子多肽，具有与其他利钠肽相同的核心结构：由17个氨基酸形成的通过一对半胱氨酸二硫键连接的环状结构。公开资料显示GNP具有显著的治疗肺动脉高压的效果，因而能被制备成治疗肺动脉高压相关适应症或心衰合并肺动脉高压的药物，具有广阔的医学推广价值。目前，国内已有药物公司正在开发GNP多肽药物，中国专利(CN112710852A)也有公开的《一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法》，采用GNP多肽有限的抗原表位构建竞争性ELI SA分析方法进行GNP浓度测定。
然而在使用该方法进行人血清样品中GNP多肽含量测定时，存在一定比例的不同个体来源人血清中的基质成分对分析过程有显著干扰，空白血清测定响应值存在较大差异，从而影响实验结果的准确性，由此可知，人血清样品自身的基质效应使得传统GNP多肽含量检测方法并不适用于人血清GNP浓度检测。
引起酶联免疫(ELISA)分析出现干扰的物质从来源看分为内源性物质和外源性物质，内源性物质包括类风湿因子、嗜异性抗体、补体、嗜靶抗原自身抗体、交叉反应物质、人抗动物抗体等等，外源性物质包括样本凝集不全残留的纤维蛋白原，细菌污染产生的内源性辣根过氧化物酶、溶血产生的血红蛋白等等，外源性的干扰物质较易采取相应措施排除并规避，而内源性的干扰物质尤其是特异性干扰物质却较难判断和消除，且不同类型的干扰物质需要采取不同的干扰消除手段，根据不同干扰物质采用阻断剂处理、样品稀释、酸和热处理、固相吸附剂处理等手段，但这些方法成本高，实施难度大，在实际应用中都有一定的局限性。比如在样品中加入阻断剂的方法用于消除抗动物抗体，阻断效果依赖于样品中抗动物抗体的浓度、类或亚类、特异性和结合价以及阻断剂的物种性和亚类，而抗动物抗体检测和确定困难，且使用阻断剂稀释样品的方式处理样品，也会导致检测灵敏度下降；而样品稀释一方面会降低灵敏度，另一方面对于特异性干扰物只能在一定程度上减弱干扰程度，难以真正消除干扰。
引起免疫干扰的内源性干扰物基本为蛋白类物质，在发明人前期研究过程中发现，通过沉淀去除空白血清基质中的蛋白质即可消除对GNP多肽检测的干扰，但基于小分子药物质谱法使用有机溶剂沉淀蛋白的前处理方式引入了有机溶剂，无法直接实施后续检测，而通过挥干有机溶剂再用合适的缓冲液复溶样品，对GNP多肽的稳定性影响很大，使得结果的准确度和精密度都无法满足相关法规要求。
此外，有应用酸类化合物和焦亚硫酸钠配合使用去除血清/血浆基质效应，并使用液相色谱-质谱法进行检测的报导，但ELISA方法中，影响抗原抗体特异性结合的因素有很多，且多肽类物质与小分子药物理化性质存在很大差异，调节pH可能会使多肽物质发生沉淀，质谱法中的基质效应去除思路并不能应用于ELISA反应体系或多肽类物质的检测。
GNP作为一种治疗肺动脉高压的药物，其有效性已经得到了公开资料的证实，然而，药物的安全性和有效性是需要综合考虑的，其中药物的血药浓度是一个非常重要的因素，血药浓度检测可用于药物动力学研究，了解药物吸收、分布、代谢和排泄的过程。通过监测血药浓度-时间曲线，可以计算药物的药代动力学参数，如半衰期、最大血药浓度、时间到达最大浓度等，从而更好地理解药物在体内的行为。因此，针对人血清样品中GNP浓度的检测在GNP多肽药物的开发中是非常重要的一环。但是人血清样品中GNP多肽含量测定时严重的基质效应干扰并不常见，目前国内外并没有合适的前处理方式可以消除GNP检测过程中的基质干扰，传统GNP多肽含量检测方法也不适用于人血清样品GNP浓度检测。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种人血清样品中GNP浓度的检测方法。
本发明的第一个目的是提供一种基于ELISA法测定人血清样品GNP浓度基质干扰消除的前处理方法。
本发明的第二个目的是提供一种人血清GNP浓度酶联免疫检测方法。
本发明的第三个目的是提供一种消除待测血清样本基质干扰的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种能消除待测血清样本基质干扰的前处理方法，所述前处理方法用于使用ELISA法测定人血清样品中的GNP浓度，包括以下步骤：
S1.待测血清样品与空白全血基质稀释液混合得到样品混合液，其中，空白全血基质稀释液为体积比为3:1～1:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液，待测血清样品与空白全血基质稀释液的体积比为50:1～20:1；
S2.取步骤S1得到的样品混合液与5-磺基水杨酸混合，5-磺基水杨酸与样品混合液体积比为0.8～1.2:9，混匀后离心取上清液；
S3.步骤S2得到的上清液与pH＝8.5～9.2的Tris-HCl按照体积比按5:4～5.6:1充分混匀，混匀后得到处理后待检测血清样品。
优选地，步骤S1中，空白全血基质稀释液为体积比为3:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液。
优选地，步骤S1中，待测血清样品与空白全血基质稀释液的体积比为50:1。
优选地，步骤S2中，按照步骤S1得到的样品:5-磺基水杨酸＝9:1的体积比加入5-磺基水杨酸。
优选地，步骤S2中，所述5-磺基水杨酸为2.5M 5-磺基水杨酸。
更优选地，步骤S2中，所述5-磺基水杨酸为2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液。
优选地，步骤S3中，加入pH＝8.5的Tris-HCl。
优选地，步骤S3中，步骤S2得到的上清液与pH＝8.5～9.2的Tris-HCl按照体积比5:4充分混匀。
更优选地，步骤S3中，步骤S2得到的上清液与pH＝8.5的Tris-HCl按照体积比5:4充分混匀。
所述前处理方法在消除人血清酶联免疫检测中基质干扰的应用也应在本发明的保护范围之内，所述基质干扰为与GNP多肽相近分子量的多肽药物生物样品基质干扰。
优选地，所述人血清酶联免疫检测为人血清GNP浓度酶联免疫检测。
一种人血清GNP浓度酶联免疫的检测方法，所述检测方法为使用所述前处理方法，处理待测血清样品，得到处理后人血清，通过酶联免疫方法检测处理后人血清GNP浓度。
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
S1.生物素偶联的GNP多肽与包被链霉亲和素的固相载体相结合，得到固相化抗原；
S2.使用权利要求1～4任一所述前处理方法，处理待测血清样品，得到处理后样品；
S3.处理后样品与一抗混合孵育；
S4.步骤S3得到的混合孵育后产物与步骤S1得到的固相化抗原充分反应，洗涤后拍干；
S5.加入二抗充分反应后，洗涤后拍干，加入ECL化学发光试剂，测定RLU值。
优选地，步骤S1中在酶标板上预先包被0.5～2μg/mL链霉亲和素，2～8℃过夜孵育，洗板后加入封闭液封闭，获得所述固相载体；
更优选地，步骤S1中在酶标板上预先包被1μg/mL链霉亲和素，2～8℃过夜孵育，洗板后加入封闭液封闭，获得所述固相载体。
优选地，步骤S2中，所述待测血清样品包括标准曲线样品、质控样品及待检测样品。
优选地，步骤S3中所述一抗为GNP免疫小鼠单克隆抗体腹水、纯化的GNP单克隆抗体或纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体
进一步优选地，步骤S3中所述一抗为GNP免疫小鼠单克隆抗体。
更优选地，步骤S3具体为，处理后样品加入使用一抗稀释液以1:10000～14000稀释的纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体，所述处理后样品与一抗的体积比为1～11:1～9，混合孵育25～35min。
更优选地，步骤S3具体为，处理后样品加入使用一抗稀释液以1:10000稀释的纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体，所述处理后血清样品与一抗的体积比为11:9，混合孵育25～35min。
优选地，步骤S4具体为，步骤S3得到的混合孵育后产物加入到步骤S1得到的固相化抗原中，室温550～650rpm振荡孵育55～65min，洗涤后拍干。
优选地，步骤S5中，所述二抗为辣根过氧化物酶标记的二抗。
更优选地，步骤S5中，所述二抗为羊抗小鼠IgG-HRP。
最优选地，步骤S5中，所述二抗为使用二抗稀释液以1:10000～1:15000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP。
进一步最优选地，所述二抗为使用二抗稀释液以1:10000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP。
进一步更优选地，步骤S5具体为，加入二抗100～150μL/孔，室温550～650rpm振荡孵育55～65min，甩去酶标板中液体，洗涤后拍干，加入100～200μL/孔的ECL化学发光试剂，测定RLU值。
最优选地，步骤S5具体为，加入二抗100μL/孔，室温550～650rpm振荡孵育55～65min。
优选地，步骤S5中，加入200μL/孔的ECL化学发光试剂。
更优选地，步骤S5中，加入200μL/孔的ECL化学发光试剂一小时内测定RLU值。
优选地，根据标准品回归拟合标准曲线及步骤S5得到的RLU值，计算质控样品及人血清样品中GNP浓度。
所述人血清GNP浓度酶联免疫的检测方法在非疾病治疗和/或诊断目的的人血清GNP浓度检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种消除待测血清样本基质干扰的试剂盒，所述试剂盒包括：
组分A：5-磺基水杨酸；
组分B：空白全血基质稀释液，所述空白全血基质稀释液为体积比为3:1～1:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液；
组分C：pH＝8.5～9.2的Tris-HCl；
所述基质干扰为与GNP多肽相近分子量的多肽药物生物样品基质干扰。
优选地，组分A为2.5M 5-磺基水杨酸。
更优选地，组分A为2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液。
优选地，组分B所述空白全血基质稀释液为体积比为3:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液。
优选地，组分C为pH＝8.5的Tris-HCl。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)使用本发明的前处理方法，可有效去除人血清样品中GNP浓度测定时的基质干扰成分，且不会导致GNP的损失，在前处理过程中，创造性地加入一定比例稀释后的全血基质，可有效提高方法的稳定性，同时使用Tris-HCl对酸化后的样品进行中和，对抗体的活性影响较小。
(2)本发明结合GNP多肽分子量等特点，利用磺基水杨酸沉淀蛋白但不会造成GNP多肽沉淀的原理，将酸沉淀蛋白去除基质干扰的思路应用到多肽类药物生物样品检测中，在常规稀释和酸处理都无法解决基质干扰，且在无法简单判断具体干扰物质，通过添加阻断剂等思路进行去除干扰的情况下，提供一种简便快速，且成本低的前处理方法，也可为其它相近分子量多肽药物生物样品基质干扰去除提供借鉴思路。
(3)使用本发明进行人血清中GNP浓度的测定，标准曲线的有效定量分析范围为3.125～200.000ng/mL，对人血清基质进行低、中、高三个浓度提取回收率测定，得到提取回收率为96.98％～100.84％，且方法的准确度、精密度、选择性等考察均满足相关法规要求，可应用于非疾病治疗诊断目的的人血清样品中GNP浓度的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
在实施例部分，精密度采用变异系数(CV)表示，准确度用相对误差(RE)表示。目前行业对CV的要求为≤20％(定量上限ULOQ及定量下限LLOQ为25％)，RE的要求为±20％，(ULOQ、LLOQ为±25％)。
所用的缩略语Std表示曲线样品、ULOQ定量上限质控样品，HQC表示高浓度质控样品、MQC表示中浓度质控样品、LQC表示低浓度质控样品、LLOQ表示定量下限质控样品、Sel为选择性考察样品、Dil表示稀释线性考察样品、AVG表示平均检测结果、BLQ表示低于定量下限。
本发明研究所用的全血为健康人全血，血清为健康人全血分离的血清，他们自愿参加研究并签署知情同意书。
除注明为单个个体或不同个体血清外，本发明所述空白血清基质为不同健康人个体来源血清混合后的血清；本发明所述空白全血基质为不同健康人个体来源全血混合后的全血。
实施例1 5-磺基水杨酸二水合物消除血清基质效应的效果
本实施例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、确定人血清样品中的GNP浓度检测存在基质干扰
(1)实验方法
选择60例健康人单个个体空白血清基质，分别加入10μg/mL GNP溶液，配制100.000ng/mL GNP浓度的血清样品，检测OD响应值，具体做法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
(2)实验结果
测得的OD响应值如表1(检测方法为竞争法，响应值越高，对应样品中GNP浓度越低)，由表1可知，不同个体来源血清配制的相同浓度GNP的血清样品，检测结果有较大差异，超40％的血清有明显的基质干扰。
表1人血清样品OD响应值
二、5-磺基水杨酸二水合物消除血清基质效应的效果
(1)样品的制备
根据表1结果，随机选取高基质效应(OD响应值>1.5)及低基质效应(OD响应值<1.0)空白血清各3个，共6个不同个体来源血清，将所述不同个体来源血清分为两份，其中一份分别加入一定量10μg/mL GNP溶液，配制得到80.000ng/mL GNP浓度的血清样品，记为Sel01～Sel06；另一份同步分别加入一定量10μg/mL GNP溶液，配制得到10.000ng/mL GNP浓度的血清样品，记为Sel07～Sel12。
同步在空白血清基质中添加10μg/mL GNP溶液，先进行100倍稀释配制GNP浓度为100.000ng/mL的Std01样品，再以Std01样品2倍连续梯度稀释，分别配制GNP浓度为50.000ng/mL、25.000ng/mL、12.500ng/mL、6.250ng/mL、3.125ng/mL和1.563ng/mL的标准曲线样品，记为Std02～Std07。
(2)前处理流程
取步骤(1)配制得到的标准曲线样品及待测样品至1.5mL EP管，按血清样品:2.5M5-磺基水杨酸二水合物体积比9:1分别加入2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液，用涡旋振荡器上下振荡3min后，置于离心机14000rpm离心5min，移取一定体积上清液，按5:4的体积比加入pH＝8.5的Tris-HCl进行中和。
(3)酶联免疫检测
使用酶联免疫检测方法检测步骤(2)前处理后的标准曲线样品及待测样品，具体方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
(4)实验结果
标准曲线拟合及样品检测结果如表2所示，由表2可知，标准曲线在GNP浓度为1.563～100.000ng/mL间除个别浓度点复孔CV较大，曲线拟合良好，且80.000ng/mL GNP高浓度样品精密度及准确度均符合行业接受标准要求，10.000ng/mL GNP低浓度样品中1/3样品准确度偏高，2/3样品准确度符合要求，说明采用本实施例的前处理方法，用于消除基质干扰存在一定的可行性，但灵敏度较差，需针对后续ELISA检测方法进行改进。
表2标准曲线拟合及样品检测结果
对比例1稀释处理消除血清基质效应的效果
本对比例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
根据表1结果，随机选取实施例1中高基质效应及低基质效应血清各5个，共10个不同个体来源血清，向所述不同个体来源血清中分别加入10μg/mL GNP溶液，配制成100.000ng/mL GNP浓度的血清样品，采用纯化水10倍稀释处理的方式消除基质干扰，检测OD响应值的方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
二、实验结果
实验结果如表3所示，稀释处理不能有效解决基质干扰问题，不同个体来源血清配制的同浓度GNP样品OD值差异大且完全无规律。
表3稀释处理后检测得到的人血清样品OD响应值
对比例2酸化处理消除血清基质效应的效果
本对比例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
根据表1结果，随机选取实施例1中高基质效应及低基质效应空白血清各5个，共10个不同个体来源血清，向所述不同个体来源血清中分别加入10μg/mL GNP溶液，配制成100.000ng/mL GNP浓度的血清样品，按2倍样品体积向所述血清样品中加入300mM乙酸溶液，室温酸化处理1h，检测OD响应值的方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
二、实验结果
实验结果如表4所示，酸化处理不能有效解决基质干扰问题，不同个体来源血清配制的同浓度GNP样品OD值差异大且完全无规律。
表4酸化处理后检测得到的人血清样品OD响应值
| 样本 | OD450 | OD450 | OD450 | OD450 | OD450 |
| 高基质效应血清酸化样品 | 2.606 | 3.238 | 2.324 | 1.962 | 3.113 |
| 低基质效应血清酸化样品 | 0.927 | 0.918 | 1.092 | 1.042 | 0.955 |
对比例3前处理过程中沉淀剂对检测结果的影响
本对比例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
(1)样品的制备
在空白血清基质中，加入10μg/mL GNP溶液，配制150.000ng/mL GNP浓度的Std01标准曲线样品，再以Std01样品2倍梯度稀释，分别配制浓度为75.000ng/mL、37.500ng/mL、18.750ng/mL、9.375ng/mL、4.688ng/mL和2.344ng/mL的标准曲线样品，记为Std02～Std07。
同时使用单个个体空白血清基质，分别加入10μg/mL GNP溶液，100倍稀释配制100.00ng/mL GNP浓度的样品，再分别连续稀释从而形成最终GNP理论浓度为10.000ng/mL、5.000ng/mL和3.000ng/mL的质控样品，记为QC1～QC3。
(2)前处理流程
按照实施例1中，二(2)前处理流程的方法进行，区别在于将2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液换为25％TCA水溶液。
(3)酶联免疫检测
使用酶联免疫检测方法检测步骤(2)前处理后的标准曲线样品及待测样品，具体方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
二、实验结果
结果如表5所示，TCA是一种常用的有机酸类蛋白沉淀剂，由表5可知，TCA对人血清样品中GNP多肽浓度测定中的基质干扰也有明显的去除作用，但对比实施例1中，二(2)前处理流程使用2.5M 5-磺基水杨酸二水合物作为前处理过程沉淀剂的处理效果，复孔精密度较差。
表5使用TCA沉淀后检测结果
实施例2前处理过程中和液不同pH值对检测结果的影响
本实施例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
(1)样品的制备
在空白血清基质中，加入10μg/mL GNP溶液，配制150.000ng/mL GNP浓度的Std01标准曲线样品，再以Std01样品2倍连续梯度稀释，分别配制浓度为75.000ng/mL、37.500ng/mL、18.750ng/mL、9.375ng/mL、4.688ng/mL和2.344ng/mL的标准曲线样品，记为Std02～Std07。
向空白血清基质中加入10μg/mL GNP溶液，配制得到GNP理论浓度为150.000ng/mL、120.000ng/mL、10.000ng/mL和3.000ng/mL的质控样品，记为QC1～QC4。
(2)前处理流程
按照实施例1中，二(2)前处理流程的方法进行，设置8.50、9.13和9.20共三个pH值浓度梯度的Tris-HCl，按照所述上清液与Tris-HCl体积比5:4加入不同浓度的Tris-HCl进行中和，得到前处理后的标准曲线样品及待测样品。
(3)酶联免疫检测
使用酶联免疫检测方法检测步骤(2)前处理后的标准曲线样品及待测样品，具体方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法。
二、实验结果
实验结果如表7所示，根据实验结果可知，当中和液为pH＝8.50的Tris-HCl时，不同GNP浓度的标准曲线样品CV值及RE值均符合行业规范，且低点的质控相对最佳。
表7不同pH值Tris-HCl中和后检测结果
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实施例3人血清样品GNP浓度ELISA检测方法的改进
本实施例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
(1)样品的制备
在空白血清基质中，加入10μg/mL GNP溶液，配制150.000ng/mL GNP浓度的Std01标准曲线样品，再以Std01样品2倍连续梯度稀释，分别配制浓度为75.000ng/mL、37.500ng/mL、18.750ng/mL、9.375ng/mL、4.688ng/mL和2.344ng/mL的标准曲线样品，记为Std02～Std07。
在空白血清基质中加入10μg/mL GNP溶液，配制得到GNP理论浓度为100.000ng/mL、10.000ng/mL、5.000ng/mL和3.000ng/mL的质控样品，记为QC1～QC4。
(2)前处理流程
与实施例1中，二(2)前处理流程的步骤相同。
(3)酶联免疫检测
具体方法见中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法，区别在于，将酶促反应TMB底物换成ECL化学发光试剂，一小时内测定RLU值。
二、实验结果
实验结果如表8所示，与表2所示数据相比，使用ECL化学发光试剂，曲线的拟合及标曲样品复孔间的CV明显趋好，即ELISA方法的精密度提高，故选择使用ECL化学发光试剂进行后续实验。
但曲线及质控样品低点准确度、精密度仍无法完全满足要求，还需要针对ELISA检测方法进一步改进。
表8使用100μL ECL化学发光试剂的检测结果
实施例4人血清样品GNP浓度非平衡竞争ELISA检测方法对检测效果的影响
本实施例所用10μg/mL GNP溶液为称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制的GNP储备液。
一、实验方法
(1)样品的制备
在空白血清基质中添加10μg/mL GNP溶液，先进行50倍稀释配制GNP浓度为200.000ng/mL的Std01样品，再2倍连续梯度稀释Std01样品，分别配制GNP浓度为100.000ng/mL、50.000ng/mL、25.000ng/mL、12.500ng/mL、6.250ng/mL、3.125ng/mL和1.563ng/mL的标准曲线样品，记为Std02～Std08。
在空白血清基质中加入10μg/mL GNP溶液，配制得到GNP理论浓度为200.000ng/mL、160.000ng/mL、32.000ng/mL、8.000ng/mL、3.125ng/mL质控样品，分别记为ULOQ、HQC、MQC、LQC。
(2)前处理流程
与实施例1中，二(2)前处理流程的步骤相同。
(3)酶联免疫检测
为提高样品检测的准确度和精密度，将中国专利CN112710852A一种GNP多肽的检测试剂盒及检测方法中所述的方法改为非平衡竞争ELISA实验方法，具体步骤如下：
S1.在酶标板上预先包被链霉亲和素并封闭以制备固相载体，将生物素偶联的GNP多肽结合在所述固相载体上形成固相化抗原；
S2.将经步骤(2)前处理流程处理后的标准品、质控品、受试血清样本加入酶标板，随后同步加入纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体进行孵育；
S3.受试血清样本中的游离态GNP与生物素偶联的GNP竞争结合纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体上的位点，将步骤S2孵育后产物加入步骤S1制备得到的固相化抗原，以在固相载体上形成抗原抗体复合物，充分反应，洗涤后拍干；
S4.向步骤S3的酶标板中加入二抗充分反应后，洗涤拍干后，向酶标板中加入200μL ECL化学发光试剂，采用发光模式进行测定；
S5.根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及受试血清样本中的GNP浓度值。
二、实验结果
标准品检测结果如表9所示，采用非平衡竞争法后，标准曲线拟合良好，各曲线点准确度、精密度均符合行业法规要求，除定量下限点外，各浓度质控样品检测结果也均符合法规要求。
但各浓度质控样品检测结果如表10所示，同一分析批内，定量下限点存在变异系数过高或实测浓度与理论浓度相对误差偏大的情况，进行多个分析批重复试验，均存在相同情况。
表9标准曲线样品检测结果
注：曲线定量下限为3.125ng/mL，1.563ng/mL为锚定点。
表10各浓度质控样品检测结果
实施例5人血清样品GNP浓度测定前处理方法
一、实验方法
(1)样品的制备
制备过程同实施例4一、(1)样品的制备过程相同。
(2)前处理流程
按照实施例1中，二(2)前处理流程的方法进行，区别在于，向待测样品中加入2％使用1×PBS 4倍稀释的空白全血基质，混匀后，再按样品:2.5M 5-磺基水杨酸二水合物＝9:1的体积比例加入2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液。
(3)酶联免疫检测
按照实施例5中，一、实验方法(3)酶联免疫检测的方法进行。
二、实验结果
检测得到的标准曲线样品结果如表11所示，质控样品检测结果如表12所示，结果以复孔测定平均值表示。由表11和表12可知，本实施例在前处理流程中加入稀释的健康人空白全血基质后，使用实施例4中，一、实验方法(3)酶联免疫检测的非平衡竞争ELISA检测方法检测得到的结果均符合行业接受标准要求，说明本实施例中的前处理方法可以有效消除血清中的干扰物质，改进后的非平衡竞争ELISA检测方法在测定人血清样品中GNP的浓度时，准确度和精密度都得到了提高。
表11标准曲线样品检测结果
注：Std08为锚定点，参与曲线拟合，但准确度和精密度无需满足行业接受标准要求
表12质控样品检测结果
实施例6一种人血清样品中GNP浓度的检测方法
(1)样品配制：
洗涤液：取100mL的10×PBS溶液和2mL的Tween-20溶于900mL的一级水中，混匀；
Biotin-GNP溶液：
S1.精密称取GNP工作对照品用1×PBS溶液配制成10mg/mL GNP溶液；配制10mmol/L生物素溶液；
S2.取0.250mL GNP溶液加入到0.140mL生物素溶液中，室温避光孵育2h后，用1×PBS溶液定容至50mL，作为50ug/mL Biotin-GNP溶液，分装后置于-20℃冰箱冻存；
S3.取50ug/mL Biotin-GNP溶液1支，取2mL用7000MWCO脱盐柱1000×g离心2min，取流出液置于新的7000MWCO脱盐柱继续以1000×g离心2min，分装后置于-20℃或-80℃冰箱中储存备用；
分析缓冲液：用Aaaay Buffer稀释Biotin-GNP至10ng/mL混匀，以100μL/孔加入已封闭的酶标板中，置于摇板仪600rpm，室温孵育1.5h±20min；
一抗稀释液：称取BSA5.0g、CHAPS2.5g、γ-球蛋白2.0g、NaCl 20.5g，加入0.5MEDTA 10mL、Tween20 500μL，溶解于200mL 1×PBS溶液中，定容至250mL；
二抗稀释液：称取1g脱脂奶粉溶于100mL 1×PBS溶液中，混匀。
(2)前处理流程
S1.取待检测血清样品至离心管中，加入1×PBS 3倍稀释的空白全血基质，添加量为待检测血清样品体积的2％，混匀；
S2.取步骤S1混匀后样品，按照样品:5-磺基水杨酸二水合物水溶液＝9:1的体积比，加入2.5M 5-磺基水杨酸二水合物水溶液，用涡旋振荡器上下振荡3min后，置于离心机14000rpm离心5min，移取一定体积上清液；
S3.取步骤S2得到的上清液，按照样品:Tris-HCl＝5:4的体积比加入pH＝8.5的Tris-HCl，混匀后得到处理后待检测血清样品。
(3)酶联免疫检测
S1.用碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至0.5～2μg/mL，然后以50～150μL/孔加入酶标板，于2～8℃孵育至少15h，洗板后加入封闭液封闭，以获得固相载体；
S2.用分析缓冲液稀释生物素偶联的GNP(Biotin-GNP)至10ng/mL混匀，以100μL/孔加入已封闭的酶标板中，置于摇板仪600rpm，室温孵育1.5h±20min，将Biotin-GNP结合在固相载体上形成固相化抗原；
S3.取步骤(2)得到的处理后待检测血清样品，加入一抗稀释液与纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体体积比为10000:1的一抗，所述血清样品与一抗的体积比为11:9，混匀后室温孵育25～35min；
S4.取步骤S2得到的已包被Biotin-GNP的固相载体，甩掉板中液体，用洗涤液洗板3次(300μL/孔，每次浸泡1min)，拍干，以200μL/孔加入步骤S3与纯化GNP免疫小鼠单克隆抗体共孵育的样品，置于酶标板振荡器600rpm，室温孵育55～65min；
S5.甩去步骤S4孵育后的酶标板中液体，用洗涤液洗板4次(300μL/孔，每次浸泡1min)，拍干，加入二抗稀释液与羊抗小鼠IgG-HRP体积比为10000:1的二抗(100μL/孔)，置于摇板仪600rpm，室温孵育55～65min；
S6.甩去步骤S5孵育后的酶标板中液体，用洗涤液洗板4次(300μL/孔，每次浸泡1min)，拍干，加入200μL/孔的ECL化学发光试剂，一小时内测定RLU值；
S7.根据标准品回归拟合标准曲线及步骤S6得到的RLU值，计算质控样品及人血清样品中GNP浓度，具体地，用Molecular Devices SoftMax Pro7.1.2GxP软件进行数据分析与处理，以4参数方程对标曲个浓度点仪器响应值及理论浓度的关系进行回归从而确定标准曲线；质控样品和/或待测样品的测量值可以由标准曲线计算得出，若待测样品经稀释，可以将测量值乘以相应的稀释倍数得到最终的测量浓度。
实施例7人血清样品GNP浓度非平衡竞争ELISA检测方法的可行性证明
本实施例基于实施例6的人血清样品GNP浓度的检测方法，结合行业规范《中国药典》(2020年版)9012生物样品定量分析方法验证指导原则四、配体结合分析，对检测方法的各主要参数进行验证。
本实施例中，ULOQ为定量上限质控样品、HQC为高浓度质控样品、MQC为中浓度质控样品、LQC为低浓度质控样品和LLOQ为定量下限质控样品。
验证结果如下：
1.标准曲线
使用实施例6确定的人血清样品中GNP浓度的检测方法，对涉及批内和批间准确度与精密度考察的8个分析批的标准曲线进行了统计，统计结果如表13所示。由表13可知，除1.563ng/mL作为锚定点不用满足任何接受标准外，其余浓度点均符合相关接受标准要求，说明标曲在3.125ng/mL～200.000ng/mL范围内是稳健的。
表13 8个分析批的标准曲线统计结果
注：--为检测过程中样品不小心泼洒点，未纳入统计。
2.批内准确度与精密度
使用实施例6确定的人血清样品中GNP浓度的检测方法，对8个精密度和准确度考察分析批进行检测，各浓度质控样品均配制3个平行样，每个样均复孔分析，结果如表14所示。由表14可知，所有接受批内各浓度水平的质控样品的相对误差均在理论浓度±20％以内(定量上限和定量下限为±25％)，批内各浓度水平的质控样品精密度均不超过20％(定量上限和定量下限为25％)，符合行业规范要求。
表14 8个分析批批内精密度和准确度考察结果
/>
/>
注：％RE数据**表示不符合接受标准要求。
3.批间准确度与精密度
使用实施例6确定的人血清样品中GNP浓度的检测方法，对8个准确度与精密度考察分析批进行检测，各浓度质控样品均配制3个平行样，复孔分析，结果如表15所示。由表15可知，批间各浓度水平的质控样品的平均浓度均在理论浓度±20％以内(定量上限和定量下限为±25％)，批间各浓度水平的质控样品精密度均不超过20％(定量上限和定量下限为25％)，且总误差都在±30％以内，符合行业规范要求。
表15 8个分析批批间精密度和准确度考察结果
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4.选择性
分别取15个不同来源健康人空白血清基质，配制ULOQ和LLOQ两个浓度梯度样品，同时分析相应未加入目标分析物的空白基质(记为NC)。使用实施例6确定的人血清样品中GNP浓度的检测方法，进行人血清样品GNP浓度检测，检测结果如表16所示，表16中BLQ是指测定浓度低于定量下限LLOQ。根据表16的数据可知，采用实施例6的方法进行检测，将GNP添加到健康人血清基质中不存在基质效应。
表16选择性考察实验结果
/>
5.稀释线性
使用空白血清基质对配制的0.1mg/mL样品先分别进行50倍、5倍稀释，然后再分别进行5倍、2倍、2倍稀释。使用实施例6确定的人血清样品中GNP浓度的检测方法，进行人血清样品GNP浓度检测，检测结果如表17所示，表17的数据表明，每个稀释的样本的测定值乘以相应稀释倍数后所得结果与实际参考值间的相对误差在±20％内，且所有稀释样品测定值乘以相应稀释倍数后回算浓度的精密度不超过20％，实施例6公开的方法适用于稀释后的人血清样品GNP浓度检测。
表17稀释线性结果
6.提取回收率
称取一定量的GNP工作对照品，使用空白血清基质配制10μg/mL GNP溶液。
在一个分析批次中，使用空白血清基质，按照实施例1中，二(2)前处理流程处理空白血清，取上清液，在上清液中加入10μg/mL GNP溶液，分别配制得到GNP浓度为160.000ng/mL、32.000ng/mL和8.000ng/mL三个浓度的样品，按照浓度从高到低，记为HQC、MQC和LQC，作为提取后样品。将提取后的样品与使用空白血清基质配制的160.000ng/mL、32.000ng/mL和8.000ng/mL三个浓度梯度的样品(作为未提取样品)的响应值进行比较评价。每个浓度级别独立配制3个平行样品，使用实施例6确定的人血清样品GNP浓度的检测方法，进行样品GNP浓度的检测，并进行复孔分析。实验结果如表18所示，各浓度质控样品的平均回收率未出现与浓度相关的趋势，各浓度水平质控样品之间的回收率RSD均不超过20％。
表18各浓度质控样品的平均回收率
以上结果表明，所验证的参数均符合《中国药典》(2020年版)9012生物样品定量分析方法验证指导原则四、配体结合分析中的要求，即实施例6公开的人血清样品GNP浓度ELISA检测方法可以很好地满足人血清中GNP浓度的测定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种能消除待测血清样本基质干扰的前处理方法，其特征在于，所述前处理方法用于使用ELISA法测定人血清样品中的GNP浓度，包括以下步骤：
S1.待测血清样品与空白全血基质稀释液混合得到样品混合液，其中，空白全血基质稀释液为体积比为3:1～1:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液，待测血清样品与空白全血基质稀释液的体积比为50:1～20:1；
S2.取步骤S1得到的样品混合液与5-磺基水杨酸混合，5-磺基水杨酸与样品混合液体积比为0.8～1.2:9，混匀后离心取上清液；
S3.步骤S2得到的上清液与pH＝8.5～9.2的Tris-HCl按照体积比5:4～5.6:1充分混匀，混匀后得到处理后待检测血清样品。
2.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S1中，空白全血基质稀释液为体积比为3:1的1×PBS和空白全血基质的混合溶液。
3.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S1中，待测血清样品与空白全血基质稀释液的体积比为50:1。
4.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S2中按照样品:5-磺基水杨酸＝9:1的体积比加入5-磺基水杨酸。
5.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S3中，步骤S2得到的上清液与pH＝8.5～9.2的Tris-HCl按照体积比5:4充分混匀，混匀后得到处理后待检测血清样品。
6.权利要求1～5任一所述前处理方法在消除人血清酶联免疫检测中基质干扰的应用，其特征在于，所述基质干扰为与GNP多肽相近分子量的多肽药物生物样品基质干扰。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述人血清酶联免疫检测为人血清GNP浓度酶联免疫检测。
8.一种人血清GNP浓度酶联免疫的检测方法，其特征在于，使用权利要求1～5任一所述前处理方法，处理待测血清样品，得到处理后人血清，通过酶联免疫方法检测处理后人血清GNP浓度。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.生物素偶联的GNP多肽与包被链霉亲和素的固相载体相结合，得到固相化抗原；
S2.使用权利要求1～4任一所述前处理方法，处理待测血清样品，得到处理后样品；
S3.处理后样品与一抗混合孵育；
S4.步骤S3得到的混合孵育后产物与步骤S1得到的固相化抗原充分反应，洗涤后拍干；
S5.加入二抗充分反应后，洗涤后拍干，加入ECL化学发光试剂，测定RLU值。
10.权利要求8或9所述的方法在非疾病治疗和/或诊断目的的人血清GNP浓度检测中的应用。
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