JP5073505B2 - アミン含有化合物分析法 - Google Patents
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Description
アミン含有化合物は重要な生物学的並びに薬学的に重要な化学物質である。アミン含有化合物の例としては蛋白、ペプチド、ポリアミン、アミノ酸、カテコールアミンおよびニトロフラン代謝物などがある。アミン含有化合物を定量するための現在の方法には、紫外線蛍光を用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、または電気化学的検出、液体クロマトグラフィーと質量分析との組合わせ(LC/MS)およびタンデム質量分析(MS/MS)などがある。
本教示は1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物を同重体標識および親−娘イオン遷移モニタリング(PDITM)を使用して分析する方法を提供する。種々の局面において、本教示は1試料中の1種類以上のアミン含有化合物の相対濃度、絶対濃度、またはその両方を測定する方法を提供する。種々の実施形態において、本教示はある試料中の相対濃度、絶対濃度またはその両方を、または複数の試料中の1種類以上のアミン含有化合物、またはそれらの組合わせを多重方式で測定できる方法を提供する。
種々の局面において、本教示は同重体標識および親−娘イオン遷移モニタリング(PDITM)を使用して1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物を分析する方法を提供する。種々の実施形態において、本教示は1種類以上のアミン含有化合物の濃度を測定する方法を提供する。例えば図1により、種々の実施形態において、一方法は、1種類以上の各アミン含有化合物を同重体タグセット由来の異なる同重体タグで標識し、その際同重体タグセット由来の各同重体タグはリポータイオン部分を含み(工程110);同重体標識した各アミン含有化合物の少なくとも一部を組合わせて組合わせ試料を作り(工程120);上記組合わせ試料の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングにかけ(その際送られる親イオンm/z範囲は同重体標識されたアミン含有化合物のm/z値を包含し、送られる娘イオンm/z範囲は上記同重体標識アミン含有化合物の同重体タグに対応するリポータイオンのm/z値を包含する);1つ以上の送られるリポータイオンのイオンシグナルを測定し(工程130);その後、対応するリポータイオンの測定イオンシグナルを標準化合物の1つ以上の測定イオンシグナルに比較することに基づいて1種類以上の同重体標識アミン含有化合物の濃度を決定する(工程140)諸工程を含んでなる。上記イオンシグナルは、例えばイオンピークの強度(平均、中間値、最大値など)、イオンピークの面積、またはそれらの組合わせに基づくことができる。
(ii)上記アミン含有化合物を含む組合わせ試料中の標準化合物の、標準化合物−リポータイオン遷移シグナル。
本教示の方法は、非制限的に、アミノ酸、カテコールアミン、ニトロフラン代謝産物、ポリアミン、ペプチド、蛋白、ポリペプチドおよびこれらの組合わせを含む広範囲の第一級および第二級アミン含有化合物に適用できる。
種々の化合物が標準化合物として使用できる。種々の実施形態において、標準化合物は対象のアミン含有化合物の1つを含む。種々の実施形態において、上記標準化合物は1つ以上の対照試料、濃度既知の試料またはこれらの組合わせである。種々の実施形態において、分析において対象となる各アミン含有化合物に対して1つの標準化合物が用意される。
種々の実施形態において、同重体タグは一般式(I)によってあらわされる:
R−L−ARG (I)
上記式中、Rは、切断可能のリンカー基(L)によってアミン反応基(ARG)に共有結合しているリポータ基(R)であり、上記リンカー基は、R+Lの質量が同重体タグセットの各同重体タグで実質的に同じになるような質量を有するバランス基を含む。例えば種々の実施形態において、リンカー基Lは一般式(II)によってあらわされる:
X−B−Y (II)
上記式中Xはバランス基とリポータ基との間の結合をあらわし、ここで結合Xは標識被験体が中性ガスと衝突すると破壊され(例えば衝突によって誘起される解離)、Yは、バランス基と被験体との結合をあらわす。その際被験体の反応基は被験体と反応して被験体を標識している。Bは上記バランス基をあらわす。被験体は、被験体と式(I)の試薬、その塩および/またはその水加物との反応によって標識される。
アミン反応基の例には、非制限的に、アミン官能基と選択的に反応してアミン含有化合物の特異的部位と共有または非共有結合を形成する基が含まれる。アミン反応基は先在していてもよいし、現場で作ることもできる。アミン反応基の現場での生成は上記被験体が存在しない条件下で進めることができるし、または被験体の存在下でも進められる。例えばカルボン酸基は現場で水溶性カルボジイミド(例えば1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸;EDC)で修飾され、それによってアルキルまたはアリールアミン基のような求核基と反応できる求電子基を形成することができる。種々の実施形態において、EDCによる標識試薬のカルボン酸基の活性化はアミン(求核性)含有被験体の存在下で行うことができる。種々の実施形態において、アミン(求核性)含有被験体はEDCと最初に反応した後でも加えることができる。種々の実施形態において、上記反応基は、保護基の現場除去によって現場で生成できる。したがって求核および/または求電子試薬の反応によって被験体を誘導体化できるあらゆる既存のまたは新たに作られる試薬または試薬が考慮される。
本教示の種々の実施形態に用いられる同重体タグのリポータ基は測定できる特異的質量(または質量対電荷比)を有する基である。例えばあるセットの各リポータは特異的な総質量を有することができる。種々のリポータは1つ以上の重原子同位体を含み、それらの特徴的質量を獲得できる。例えば炭素の同位体(12C、13Cおよび14C)、窒素の同位体(14Nおよび15N)、酸素の同位体(16Oおよび18O)または水素の同位体(水素、重水素および三重水素)が存在し、これらを使用してリポータ部分の大グループを作ることができる。安定な重原子同位体の例としては非制限的に13C、15N、18Oおよび重水素がある。
本教示の種々の実施形態で使用する標識試薬または試薬のリンカーは、被験体との反応が起きているかいないかに応じて、上記リポータを被験体に連結するかまたはリポータを被験体反応基(ARG)に連結する。上記リンカーは、XおよびYの両結合が分解するときに(例えばXおよびY両結合の分解でニュートラルロスを受けるとき)中性種を生ずるように選択できる。上記リンカーはカルボニルまたはチオカルボニル基のような非常に小さい部分でよい。上記リンカーはより大きい部分でもよい。リンカーはポリマーまたはビオポリマーでもよい。リンカーは解離性エネルギーレベルにさらされるとサブフラグメントとなる(そのリンカーの中性フラグメントだけを生ずるようなサブフラグメンテーションを含む)ように設計することができる。
Xはリポータの原子とリンカーの原子との間の結合である。Yはリンカーの原子と、アミン反応基の原子、或いは標識試薬が被験体と反応している場合はその被験体の原子との間の結合である。結合Xは、上記標識被験体(例えばR−X−B−Y−被験体)の選択されるイオンの少なくとも一部において、十分な解離エネルギーレベルにさらされた際に結合Xが分解するように選択される。種々の実施形態において、結合Yも、標識被験体(例えばR−X−B−Y−被験体)の選択されたイオンの少なくとも一部において、十分な解離エネルギーレベルにさらされた際には結合Yが切れるように選択される。質量分析系において解離エネルギーレベルは、標識被験体の選択されたイオンの少なくとも一部において結合X、結合Y、または結合XおよびYの両方が分解するように調節できる。結合Xの分解は被験体からリポータを放出し、そのリポータは上記被験体とは無関係に測定できる。結合Yの分解は、結合Xがすでに分解しているか否かによって、被験体からリポータ/リンカー組合わせを放出するか、または被験体からリンカーを放出する。種々の実施形態において、結合Yは結合Xより不安定であることがあり、結合Xは結合Yより不安的であることがあり、或いは結合XとYとは実質的に同じ相対的不安定さを有することがある。
1種類以上の同重体標識標準化合物、1種類以上の同重体標識アミン含有化合物、またはそれらの組合わせの、任意の適切な組合わせが本教示の方法に使用できる。例えば、一般に、組合わせ試料中の異なる同重体標識化合物の数、N、は、同重体タグセットの同重体タグの数、T、より小さいか等しい。任意のある組合わせ試料において、同重体標識標準化合物と1種類以上の同重体標識アミン含有化合物との組合わせの可能性は次のようにあらわされる。
上記式中、Tは同重体タグセット中の同重体タグの数であり;Sは異なる同重体タグをつけた同重体標識標準化合物の数で、0からTまでの範囲であり;Cは異なる同重体標識ををつけた同重体標識アミン含有化合物の数で、0からTまでの範囲である。
本教示においてはPDITMを行うために種々様々の質量アナライザー装置が用いられる。適切な質量アナライザー装置は2つの質量セパレータと、2つのセパレータ間の飛行経路に配置されたイオンフラグメンタとを含む。適切な質量セパレータの例としては非制限的に、四極子、RF多重極子、イオントラップ、飛行時間型(TOF)、およびタイムド・イオン・セレクタとTOFとの組合わせなどがある。適切なイオンフラグメンタとして非制限的に、衝突誘起性(collosion insuced)解離(CID、衝突による(collosionally assisted)解離(CAD)とも言う)、光誘起性解離(PID)、表面誘起性解離(SID)、ポストソース分解、またはこれらの組合わせがある。
次の実施例は種々の試料形の使用を説明する。この実施例の教示は網羅的ではなく、これらの実験または本教示の範囲を制限するものではない
本発明の方法を使用して種々の試料形由来の1種類以上のアミン含有化合物を分析する種々の実施形態が説明される。種々の実施形態において、対象のアミン含有化合物の1種類以上が、この実施例の1つ以上の試料形、例えば血漿、ワイン、蛋白、ペプチドおよびアミノ酸を起源とすることができる。一般的に、ある試料中の対象の化合物が、同重体タグで適切に標識化できる1つ以上のアミン基、例えば第一級、および第二級アミンなどを含むように、上記試料を処理することができる。
次の実施例は1種類以上の蛋白またはペプチドを含む1つ以上の試料を調製し、iTRAQ(商標)ブランド試薬を使用し、1種類以上の同重体タグによって標識化する種々の実施形態の実施例を記載する。この実施例の教示は網羅的ではなく、これらの実験または本教示の範囲を制限するものではない。
図4Aを参照し、種々の実施形態において、各々5ないし100μgの蛋白を含む少なくとも1本から4本までの各試料管に、20μLの溶解緩衝液および1μLの変性剤を加え、ボラックスして撹拌し、混合する(工程405)。各試料管に2μLの還元試薬を加え、ボラックスして撹拌、混合し、60℃で1時間インキュベートする(工程410)。各試料管をスピニングし、各試料管に1μLシステインブロッキング試薬を加え、その後ボラックスによって撹拌し、スピニングし、室温で10分間インキュベートする(工程415)。
図4Aを参照し、少なくとも1および2本までの各試料管に、還元され、システインブロックされた標識すべき蛋白5ないし100μgが含まれる種々の実施形態において、トリプシン1バイアルを25μLのMillQ(商標)水またはその同等物で希釈する。その他の実施形態、例えば少なくとも1本、そして4本までの各試料管に、還元され、システインブロックされた標識すべき蛋白5ないし100μgが含まれる実施形態において、トリプシン2バイアルを25μLのMillQ(商標)水またはその同等物で希釈する。希釈されたトリプシンバイアルの各々をボルテックスして混合し、スピニングする(工程420)。
種々の実施形態において、蛋白またはペプチド試料を加水分解によって調製し、分析する。よって種々の実施形態においては、還元工程(例えば工程410)および消化工程(例えば工程420)は用いられない。図4Bにより、種々の実施形態において、蛋白および/またはペプチドを含む試料は酸などで加水分解する(工程427)。本教示で適切に使用できる蛋白およびペプチドを加水分解するために非常に種々様々の方法を当業者は利用できる。強酸加水分解(例えば真空中、100℃で6N塩酸で処理)により加水分解すると遊離アミノ酸が生ずる。幾つかの加水分解条件によって、あるアミド(Asn、Gluなど)はそれらの酸に変換し、あるアミノ酸は分解することは知られている。よって、種々の実施形態において、強酸加水分解以外の加水分解法が使用できる。
図4Aおよび4Bを参照し、種々の実施形態において、少なくとも1バイアルのiTRAQ(商標)ブランド同重体試薬および4バイアルまでの種々のiTRAQ(商標)ブランド同重体試薬を室温に温め、iTRAQ(商標)ブランド同重体試薬の各バイアルに70μLのエタノールを加え、その後ボルテックスして混合し、スピニングする(工程430)。例えば消化した蛋白や加水分解した蛋白などからのアミノ酸の各試料管に対して、iTRAQ(商標)ブランド同重体試薬のバイアル1本を使用する。
図4Aおよび4Bを参照し、種々の実施形態において、各標識アミノ酸の試料管の全内容物を新しい1本の試料管に移し、組合わせ試料を作り、それをボルテックスして混合し、その後スピンする(工程465)。リポータイオンシグナルの測定前に、消化し標識した各蛋白の少なくとも一部を清浄にする(工程470)(例えば妨害試料、緩衝人工物などを、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相(RP)−HPLC、交換分別、カチオン交換、高解析カチオン交換などおよびこれらの組合わせによって除去する)(工程475)。上記清浄にした標識化アミノ酸試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラム(例えばLCカラム、ガスクロマトグラフィー(GC)カラム、またはこれらの組合わせ)に供給する。上記クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部をその後質量分析装置に導き(工程480)、1種類以上のアミン含有化合物のアミン含有化合物−リポータイオン遷移シグナルをPDITM(MRMなど)を用いて測定する。組合わせ試料中の1種類以上の対象アミン含有化合物の濃度(例えば相対的濃度、絶対的濃度またはそれら両方)をその後測定する(工程485)。
図5を参照し、種々の実施形態において1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物の濃度測定が行われる。その際、非制限的に、ペプチド、ポリペプチド、蛋白、アミノ酸、ニトロフラン代謝産物、ポリアミンおよびカテコールアミンなどを含む1種類以上のアミン含有化合物が提供される。種々の実施形態において、同重体標識標準化合物(工程505)(例えば対照試料由来の対象アミン含有化合物、既知濃度の試料由来の対象アミン含有化合物など)を、2種類以上の分析すべき同重体標識アミン含有試験化合物、例えば試験化合物#1(工程510)、試験化合物#2(工程520)および試験化合物#3(工程525)の(と組合わせた)内部標準として使用する。
下記の実施例はiTRAQ(商標)ブランド試薬セット由来の同重体タグを用いて4種類のポリアミンの濃度を多重測定することについて記載する。この実施例の教示は網羅的ではなく、これらの実験または本教示の範囲を制限するものではない。
この実施例のスペクトルは、図6Bから10DまでのスペクトルではAPI2000トリプル四重極LC/MC/MC装置を用い、図11から図13までのスペクトルではHILCカラム.を備えたHILC装置に連結したAPI2000トリプル四重極機器を使用して得たものである。クロマトグラフィーの構造はオートサンプラー、150×2.1mmC18逆相カラムおよびカラム加熱器を備えたバイナリー勾配HILC装置を含む。アミン含有化合物は、それらをメタノールに溶解し、その後標準を標識化するプロトコルを用いてそれらをiTRAQ試薬と反応させるという方法で調製した。標準アミンはフルカ(Fluka)から入手した。
実施例4は組合わせ試料を使用する複数アミン含有化合物の濃度測定を記載する。図6A−10Dは個々のアミン含有化合物(同重体タグセット由来の同重体タグで標識されたもの、未標識のもの両方)の質量スペクトルを示す。この実施例において、同重体タグはiTRAQ(商標)ブランド試薬であった。図11および13は組合わせ試料のクロマトグラムを示す。この実施例の組合わせ試料中の対象アミン含有化合物は1,4ジアミノブタン(プトレッセン)、1,5ジアミノペンタン(カダベリン)、N1−(3−アミノプロピル)−ブタン−1,4−ジアミン(スペルミジン)および1,7ジアミノヘプタンであった。図12A−12Cはそれぞれ1,4−ジアミノブタン(プトレッセン)、1,5ジアミノペンタン(カダベリン)、および1,7ジアミノヘプタンのクロマトグラムを示す。
図14A−Cを参照し、マトリックスであるシアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸を含む95%アセトニトリルのバックグラウンドO−MALDI質量スペクトルが得られた。同じスペクトルの3質量範囲に見られるイオンの大部分は溶媒からの化学的バックグラウンドおよび4−ヒドロキシ桂皮酸由来のマトリックスイオンから生ずるものである。
下記の実施例は加水分解して遊離アミノ酸を生成した1蛋白試料のアミノ酸の濃度の測定を説明するものである。この実施例の教示は網羅的ではなく、これらの実験または本教示の範囲を制限するものではない。
蛋白またはペプチド加水分解物を標準的加水分解法によって調製する。より詳細に述べれば、1μgからなるウシ血清試料を6NのHClで、110℃で17時間加水分解した。加水分解した試料をその後緩衝液、イソプロパノールおよびiTRAQブランド試薬と混合し、室温で反応させる。その後所望濃度に再溶解または直接希釈し、分析する(一般的に各分析にはペプチドまたは蛋白0.2μgが必要である)。加水分解の前および/または実験操作中の試料の回収を追跡するために、標識する前に標準(すなわちノルロイシン、ノルバリン)を上記試料に加える。試料の標識化の詳細はプロトコルフォーマット中の表2にも示される。
本実施例において、20種類のアミノ酸の濃度を測定した。表12は各アミノ酸(2列目に列挙)について得られたデータをまとめたものである。3列目はアミノ酸のLCカラム上の保持時間を列挙し、4列目は濃度未知の試料中のアミノ酸に関連するピーク面積を列挙する。5列目はアミノ酸標準試料に関連するピーク面積である。6列目は標準試料中のアミノ酸濃度である。7列目には本教示を利用して測定した、この実施例のアミノ酸の濃度が記載される。未知試料のアミノ酸の濃度は、未知試料のアミノ酸に関連するピーク面積を、標準試料に関連するピーク面積で割り、この数値に上記既知試料の濃度を掛けることによって得た。
下記の実施例は生物学的試料中の遊離アミノ酸の濃度測定を説明する。この実施例のデータは血漿試料のデータであるが、本実施例の教示はその他の生物学的液、例えば非制限的に尿などに適用できる。この実施例の教示は網羅的ではなく、これらの実験または本教示の範囲を制限するものではない。この実施例において、上記血漿試料中の48の遊離アミノ酸をモニターした。モニターしたアミノ酸を表13に列挙する。
生物学的液(例えば血漿、血清、尿)では、試料の一部をイソプロパノールまたはエタノール4部と混合し、その試料中の蛋白の大部分を沈殿させる。上澄液に緩衝液を加えて、標識反応のために塩基性pHを維持する。その後iTRAQブランド試薬を加え、室温で反応させる。試料をその後乾燥し、分析のために好ましい濃度に再溶解するかまたは直接希釈する(普通は各分析に100nLの生物学的液が必要である)。試料の標識化に関する詳細はプロトコルフォーマットの表15にも記載されている。
本実施例において48種類のアミノ酸をモニターした。表27は、検出された各アミノ酸で得られたデータをまとめたものである。第2列は内部標準のアミノ酸の量を列挙し、第3列は外部標準添加量を示し、第4列は試料中の測定されたアミノ酸濃度を示し、第5列は血漿の対照範囲を示す。
本実施例はiTRAQ標識カテコールアミン(CAT)のクロマトグラム分離について論ずる。CATsは尿、血漿およびCSF(脳脊髄液)試料の臨床的分析において重要であることが多い。腫瘍(神経芽細胞腫、フェアシトクローマなど)およびそれらの病期および部位などを診断するために、血漿および尿の日常的臨床分析が行われる。CATsはしばしば神経伝達物質でもあり、製薬会社などにおいて高血圧薬の開発のためにCSF中でモニターされる。
カテコールアミン、関連化合物および幾つかのアミノ酸の標準混合物を作り、標準的プロトコルを用いてiTRAQ試薬で標識した。C18逆相カラム上で揮発性イオン対試薬を含む水−アセトニトリル勾配を用いて、1mL/minの流速で誘導体を分離した。誘導体化した標準の希釈列を注入し、種々の成分のLOD(検出限界)および検量曲線を決定した。標準を加えた、および加えない生物学的液試料(尿、CSF、血漿)を一般的プロトコルによって調製し、標識し、分析して、上記方法の感度および正確さに与えるマトリックスの効果を確認した。試料はアプライド・ビオシステムズ(Applied Biosystems)/MDS SCIEX API−4000トリプル四重極質量分析計、ESI+、MRMモードで分析した。
結果はカテコールアミン、関連化合物およびアミノ酸、すなわちドーパ(3,4−ジヒドロキシ−DL−フェニルアミン)、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、メタネフリン、ノルメタネフリン、メチルドーパ、3−メトキシチラミン、セラトニン、ヒスタミン、ABA(アミノ酪酸)、チロシン、およびグルタミン酸の標識化および定量が可能であることを証明している。抽出時のLODは0.004picomol/uLである。種々の試料の直線性は0.9000から0.999までの範囲である。正確さおよび精度が示される。カテコールアミン異性体ドーパ(342/117)およびメタネフリン(342/117)並びにエピネフリン(328/117)およびノルエピネフリン(328/117)のベースライン分離が行われた。
図27Aおよび27Bはアミノ酸濃度を測定する本教示の種々の実施形態の動力学的範囲および反応に関するデータを示す。図27Aは約10ないし約990picomol(pmole)のノルバリン濃度に対する反応に関するデータを示す。各実験(データ点)は30pmoleの内部標準を使用し、三重に注入する。増加する量のアミノ酸をLC/MS/MS装置に注入し、それらの反応に対してプロットした。図27Aは、上記反応が約3桁の大きさの濃度にわたって直線性であることを示している。
Claims (22)
- 1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物を分析する方法であって、
標準化合物を用意する工程と;
該標準化合物を同重体タグセット由来の同重体タグで標識する工程と;
1種類以上のアミン含有化合物の各々を、該同重体タグセット由来の異なる同重体タグで標識する工程と;
該同重体標識された標準化合物の少なくとも一部を、該同重体標識された各アミン含有化合物の少なくとも一部と組合わせて、組合わせ試料を作る工程と;
該組合わせ試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに供給する工程と;
該クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部を、親−娘イオン遷移モニタリングにかける工程であって、
該アミン含有化合物について送られる親イオンのm/z範囲が該同重体標識されたアミン含有化合物1種類以上のm/z値を含み、該アミン含有化合物について送られる娘イオンのm/z範囲が該同重体標識されたアミン含有化合物の該同重体タグの少なくとも1つに対応する少なくとも1つのリポータイオンのm/z値を含み;
該標準化合物について送られる親イオンのm/z範囲が該同重体標識された標準化合物のm/z値を含み、該標準化合物について送られる娘イオンのm/z範囲が該同重体標識された標準化合物の該同重体タグに対応するリポータイオンのm/z値を含むものとする工程と;
1つ以上の該送られたリポータイオンのイオンシグナルを測定する工程と;
該対応するリポータイオンの測定されたイオンシグナルと該同重体標識された標準化合物に対応するリポータイオンの測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいて、1種類以上の該同重体標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程と
を含み、該1種類以上のアミン含有化合物が、1種類以上の遊離アミノ酸、カテコールアミンまたはニトロフラン代謝産物を含む、方法。 - 前記試料の1つ以上が生理液を含む、請求項1記載の方法。
- 前記試料の1つ以上が、農産物、動物製品、動物飼料、ヒト消費用の食物およびヒト消費用の飲料の1種類以上を含む、請求項1記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が、2つ以上の試料由来の実質的に同一であるアミン含有化合物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が1種類以上のアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が同じアミノ酸の1種類以上の異性体を含む、請求項5記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が同じアミノ酸の翻訳後修飾を1つ以上含む、請求項5記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が1種類以上のカテコールアミンまたはニトロフラン代謝産物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記カテコールアミンがエピネフリン、ノルエピネフリン、およびL−ドーパの1つ以上を含む、請求項8記載の方法。
- 前記ニトロフラン代謝産物が3−アミノ−2−オキサゾリジノン、5−モルホリノメチル−3−アミノ−オキサゾリジノン、セミカルバジド、および1−アミノヒダントインの1つ以上を含む、請求項8記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングにかける前記工程が、トリプル四極子、四重極/飛行時間型質量分析計、リニアイオントラップ質量分析計、またはタンデム飛行時間型質量分析計の1つ以上を使用することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングにかける前記工程が、前記組み合わせ試料をマトリックス中で混合し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて該親−娘イオン遷移モニタリングのためのイオンを生成することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物がリシン、リシン異性体、および翻訳後修飾リシンの1つ以上を含み、前記マトリックスがシアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を含む、請求項12記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物がアルギニン、アルギニン異性体、および翻訳後修飾アルギニンの1つ以上を含み、前記マトリックスがジヒドロキシ安息香酸(DHB)を含む、請求項12記載の方法。
- 1種類以上の前記同重体標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する前記工程が、1種類以上の前記同重体標識されたアミン含有化合物の絶対濃度を決定することを含む、請求項1記載の方法。
- 1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物を分析する方法であって:
1種類以上のアミン含有化合物の各々を同重体タグセット由来の異なる同重体タグで標識する工程と;
該同重体標識された各アミン含有化合物の少なくとも一部を組合わせて、組合わせ試料を作る工程と;
該組合わせ試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに供給する工程と;
該クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングにかける工程であって、送られる親イオンのm/z範囲が該同重体標識されたアミン含有化合物の1種類以上のm/z値を含み、送られる娘イオンのm/z範囲が、該同重体標識されたアミン含有化合物の前記同重体タグの少なくとも1つに対応する少なくとも1つのリポータイオンのm/z値を含むものとする工程と;
1つ以上の該送られたリポータイオンのイオンシグナルを測定する工程と;
該対応するリポータイオンの測定されたイオンシグナルと標準化合物の濃度曲線との比較に少なくとも基づいて、1種類以上の該同重体標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程と
を含み、該1種類以上のアミン含有化合物が、1種類以上の遊離アミノ酸、カテコールアミンまたはニトロフラン代謝産物を含む、方法。 - 前記標準化合物の前記濃度曲線が
(a)第一濃度を有する標準化合物を用意すること;
(b)同重体タグセット由来の同重体タグで該標準化合物を標識すること;
(c)該同重体標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに供給すること;
(d)該クロマトグラフィーカラムからの溶出液の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングにかけ、送られる親イオンのm/z範囲は該同重体標識された標準化合物のm/z値を含み、送られる娘イオンのm/z範囲は該同重体標識された標準化合物の前記同重体タグに対応するリポータイオンのm/z値を含むものとすること;
(e)該送られたリポータイオンのイオンシグナルを測定すること;
(f)1つ以上の異なる標準化合物濃度について(a)−(e)を繰り返すこと;
(g)2つ以上の標準化合物濃度における該送られたリポータイオンの測定されたイオンシグナルに少なくとも基づいて、該標準化合物の濃度曲線を作成すること
によって作成される、請求項16記載の方法。 - 前記同重体標識されたアミン含有化合物の1種類以上の濃度を決定する工程が、1種類以上の前記同重体標識されたアミン含有化合物の絶対濃度を決定することを含む、請求項16記載の方法。
- 1つ以上の試料中の1種類以上のアミン含有化合物を分析する方法であって:
1種類以上のアミン含有化合物の各々を同重体タグセット由来の異なる同重体タグで標識する工程と;
該同重体標識された各アミン含有化合物の少なくとも一部を組合わせて、組合わせ試料を作る工程と、
該組合わせ試料の少なくとも一部をマトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いて親−娘イオン遷移モニタリングにかける工程であって、送られる親イオンのm/z範囲が該同重体標識されたアミン含有化合物の1種類以上のm/z値を含み、送られる娘イオンのm/z値が該同重体標識されたアミン含有化合物の前記同重体タグの少なくとも1つに対応する少なくとも1つのリポータイオンのm/z値を含むものとする工程と;
1つ以上の該送られたリポータイオンのイオンシグナルを測定する工程と;
該対応するリポータイオンの測定されたイオンシグナルと標準化合物の測定されたイオンシグナルとの比較に少なくとも基づいて、1種類以上の該同重体標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程と
を含み、該1種類以上のアミン含有化合物が、1種類以上の遊離アミノ酸、カテコールアミンまたはニトロフラン代謝産物を含む、方法。 - 前記1種類以上のアミン含有化合物が、リシン、リシン異性体、および翻訳後修飾リシンの1つ以上を含み、前記マトリックスがシアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を含む、請求項19記載の方法。
- 前記1種類以上のアミン含有化合物が、アルギニン、アルギニン異性体、および翻訳後修飾アルギニンの1つ以上を含み、前記マトリックスがジヒドロキシ安息香酸(DHB)を含む、請求項19記載の方法。
- 1種類以上の前記同重体標識されたアミン含有化合物の濃度を決定する工程が、1種類以上の該同重体標識されたアミン含有化合物の絶対濃度を決定することを含む、請求項19記載の方法。
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