CN114965668A - 一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法 - Google Patents

一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，包括以下步骤：将飞行时间质谱靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；将Au纳米颗粒溶液加入溶剂进行稀释，移取Au纳米颗粒稀释后的溶液点涂到靶板靶点内；将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20‑30min，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；制备待测样品溶液：飞行时间质谱仪数据分析。本发明中的金纳米粒子用作飞行时间质谱仪基质对组织活检样品具有低检测限和较高的灵敏度，增强了待测物质在飞行时间质谱仪中的检测信号，同时满足使用者快速简便操作的需求。

Description

一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的 方法
技术领域：
本发明属于质谱分析技术领域，具体涉及一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法。
背景技术：
金纳米颗粒材料物理化学性能稳定且优越，具有极高的可用性与适用性，是当今被最广泛地研究应用的一种人工纳米材料，由于其独特的物理化学性质、良好的生物兼容性以及极微薄的毒性等卓越性能，在人体健康和生物医药的相关研究与近代科学技术发展中，金纳米颗粒正发挥着越来越重要的作用；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪 (简称飞行时间质谱仪或MALDI-TOF MS)利用有机基质吸收激光能量实现待测物的激光解吸电离并分析数据，免标记、高通量且自动化的特点实现了对非挥发性样品的数据分析，与同类质谱相比具有较高的耐盐、耐缓冲剂及非挥发性成分的优点，并且分析的大多数样品分子都被解离为单电荷分子、离子，因此最终的质谱图比较简单利于图谱解析。
组织活检是以人体组织等固态生物组织为检测样本，根据检测物的不同可以分为手术切除的部分器官和组织（如胃、乳腺、淋巴结等切除标本）、切取的小块病变组织（如皮下小结节、内窥镜下钳取的肿块组织等）、刮取的破碎组织（如子宫内膜、骨组织等）以及粗针或细针穿刺抽吸的组织（如肝、肾、甲状腺穿刺组织等），是诊断疾病重要的方式之一，可以明确疾病诊断结果为疾病诊断提供重要线索、帮助医生了解病人体内的病变范围、预估病人病情严重程度与预后效果最终达到辅助医生制定治疗方案验证治疗效果的目的，但是目前发展仍不能满足当前需求，而MALDI-TOF MS联用组织活检则有望弥补这一空白。
目前MALDI-TOF MS结合组织活检的可用基质选择主要包括以CHCA、DHAP、SA为代表的蛋白多肽类，以DHB为代表的多糖类，以及以HPA、THAP为代表的核酸类以及IAA等合成聚合物类，适用于肽段、糖肽与各类大分子化合物的分析，而适用于小分子质量待测物的基质选择则有待考量，其主要制约因素在于有机小分子基质会发生破裂及分子之间的缔合，从而产生严重的基质背景干扰现象，且需要每次检测过程中均滴加基质溶液。因此，本发明立足于附有金纳米颗粒的制备方法与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(飞行时间质谱仪)应用技术联用，着眼于组织活检方向，致力于透彻研究分析适用于不同组织活检样品附着的基质靶板以及详细的制备研究方法，研究一种基于能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子的纳米材料辅助飞行时间质谱仪基质，且可直接制备成附着该纳米材料的靶板，不仅能够检测分析包括低分子质量范围内的代谢组学物质且使用过程中不需额外滴加基质，有效保证基质的均匀性，使分析数据更加稳定。而且能够更加透彻的分析人体组织活检样品的待测信息，为人类健康筛查事业的进一步发展添砖加瓦。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，将质谱靶板与特定的Au纳米颗粒基质相结合，利用合适的基质提高信号的灵敏度和检出限，无需在样品检测过程中额外添加基质，同时可以排除现有基质所产生的质谱峰干扰。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，包括以下步骤：
S1：将飞行时间质谱靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S2：将Au纳米颗粒溶液加入溶剂进行稀释，移取Au纳米颗粒稀释后的溶液点涂到靶板靶点内；
S3：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20-30min，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；
S4：制备待测样品溶液：利用取样设施取样得到的样品原材料进行操作配制，称取组织样品到离心管内，加入提取试剂，研磨或冻干处理，过滤，得到待测样品溶液，将待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；
S5：飞行时间质谱仪数据分析：将加有样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
作为优选，所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式选择自然晾干，也可选择真空抽干、惰性气体吹干干燥方式；
作为优选，所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状为球形、方形、锥形、棒形的一种或几种，粒径尺寸范围为10-100nm。
作为优选，所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25-5mg/ml。
作为优选，所述的步骤S3中优选化学还原法为主，采用柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm。
作为优选，所述的步骤S5中待测物质包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质。
作为优选，所述的步骤S4中待测样品为组织活检样品，包括肝脏组织、甲状腺组织、皮肤组织、肾上腺组织、胰腺组织以及其他组织，其他组织为肺、心脏，并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、研磨法：取待测组织样本至离心管或研磨罐内，加入甲醇或者乙腈提取试剂，加入研磨珠，放入研磨机内研磨，设置仪器参数，过滤后取滤液备用；
b、超声法：取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇或者乙腈提取物溶液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，备用。
作为优选，所述的步骤S7中所测样品提取试剂，包括使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，其他水溶液用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品可被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
与现有技术相比，本发明的有益之处是：
本发明将金纳米粒子作为飞行时间质谱仪基质，并制作成附有金纳米颗粒的一次性使用靶板，使用过程中无需额外添加基质，具有背景干扰小、耐盐性好、解吸（电离）效率高优点，且金纳米粒子具有很强的紫外吸收能力，能够在飞行时间质谱仪检测中快速的转移激光能量使分析物电离。通过金纳米粒子不容易在飞行时间质谱仪的真空下脱落的性质以及能量的快速转移可对待测物进行电离分析，使得本发明中的金纳米粒子用作飞行时间质谱仪基质对组织活检样品具有低检测限和较高的灵敏度，增强了待测物质在飞行时间质谱仪中的检测信号，同时满足使用者快速简便操作的需求。
附图说明：
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为附着Au纳米颗粒的靶板设计图；
图2为使用乙醇超声提取处理肝脏组织样品、15nm金颗粒溶液为基质的飞行时间质谱图，其中横坐标为质荷比、纵坐标为离子流的强度，通过对代谢物相对分子质量的测定以确定代谢物的化学式、结构式，并进行定性或定量分析；根据质谱图特征峰的峰高或峰面积结合计算公式可以推算肝脏组织样品中的待测物含量，具有精准度高、易操作以及抗干扰等优点。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述：
如图1和图2所示的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，包括以下步骤：
S1：将飞行时间质谱靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S2：将Au纳米颗粒溶液加入的溶剂进行稀释，移取Au纳米颗粒稀释后的溶液点涂到靶板靶点内；
S3：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20~30min。便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板，此靶板用于飞行时间质谱系统对组织活检样本的检测，优势在于靶板表面的Au纳米颗粒可直接做基质使用，无需额外滴加基质。
S4：制备待测样品溶液，利用取样设施取样得到的样品原材料进行操作配制，称取组织样品到离心管内，加入提取试剂，研磨或冻干处理，过滤，得到待测样品溶液，将待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；
S5：飞行时间质谱仪数据分析：将加有样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
作为本发明进一步的方案： 所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，材质可选不锈钢金属，而靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式并不局限于自然晾干，优选地也可选择真空抽干、惰性气体吹干干燥方式；
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状多样包括球形、方形、锥形、棒形，尺寸为10~100nm。
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25~5mg/ml，优选1.0μg/ml~5.0mg/ml。
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S3中应用的制备方法多样，但是物理方法光化学、声化学、辖射和热解制备器材要求过高且制得的Au纳米颗粒直径不易控制，实验室实验优选化学还原法为主，如采用经典的柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，这种梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm，其他化学方法制得的粒径同样范围可控，并且利用晶种生长法加入不同表面活性剂可制得不同形状的Au纳米颗粒，不同的制备方法制得的Au纳米颗粒性质各有不同在飞行时间质谱检测方面适宜检测不同的小分子物质；
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S4中待测物包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质；
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S4中所测样品为组织活检样品，包括且不限于肝脏组织、甲状腺组织、皮肤组织、肾上腺组织、胰腺组织以及其他组织（肺、心脏），并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、研磨法：取待测组织样本至离心管或研磨罐内，加入甲醇或者乙腈提取试剂，加入研磨珠，放入研磨机内研磨，设置合适的仪器参数，过滤后取滤液备用；
b、超声法：取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇或者乙腈提取物溶液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，备用。
作为本发明进一步的方案： 所述的步骤S4中待测样品提取试剂，包括且不限于使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，如用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品可被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
实验开始之前首先对器材与试剂进行选择，对操作中所需要的组分进行预先取样，用于后续操作，器材与试剂选择包括选取离心管、移液枪、涡轮振荡器、超纯水、提取液、冰、样品等；之后，检查防护措施，对操作中的安全进行保障，检查防护措施包括检查操作人员是否正确穿着实验服，检查操作人员是否正确佩戴防护手套，检查操作人员是否正确佩戴防护目镜，检查通风橱是否正常工作等。
一切准备就绪后实验正式开始，严格按照以下标准步骤开展本次实验：
实施例1
一、靶板制备
1、将飞行时间质谱使用靶板放入异丙醇内进行超声清洁，取出后自然晾干；
2、取直径为15nm的Au纳米颗粒溶液5mL，加水稀释至20mL，超声混匀，取3μL稀释后的Au纳米颗粒溶液点涂到靶板的靶点内，96个靶点均需点涂；
3、将靶板放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干20min，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
1、移取50μg肝组织(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μg胰腺组织)到洁净离心管内，加入150μL乙醇溶液(此处提取液可为其他容量、种类的溶液，如175μL100%的乙腈和去离子水的混合物)，先预冷至温度为4℃，超声波处理，仪器条件为350W处理20min，-20℃条件下孵育1h，在4℃条件下14000rcf离心15min，取上清液。
2、使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为100～1000Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
实施例2
一、靶板制备
1、将飞行时间质谱使用靶板放入乙醇内进行超声清洁，取出后氮气吹扫至干燥；
2、取直径为25nm的Au纳米颗粒溶液5mL，加水稀释至25mL，超声混匀，取2μL稀释后的Au纳米颗粒溶液点涂到靶板的靶点内，96个靶点均需点涂；
3、将靶板放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干20min，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
1、移取50μg胰腺组织(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μg肾上腺组织)到洁净离心管内，加入150μL甲醇溶液(此处提取液可为其他容量、种类的溶液，如175μL100%的乙腈和去离子水的混合物)，加入少量研磨珠，放入研磨机内研磨，设置匀质速度70HZ/秒研磨，取出后使用0.22μm针式过滤器过滤，取滤液。
2、使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为50～1000Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
实施例3
一、靶板制备
1、将飞行时间质谱使用靶板放入异丙醇内进行超声清洁，取出后氮气吹扫至干燥；
2、取直径为5nm的Au纳米颗粒溶液10mL，超声混匀，取3μL Au纳米颗粒溶液点涂到靶板的靶点内，96个靶点均需点涂；
3、将靶板放入烘箱内，靶点位置朝上，设置温度为80℃，烘干30min，即获得一块附有Au纳米颗粒的靶板。
二、制备待测样品
1、移取50μg甲状腺组织(此处样品可为其他容量、种类的待测物，如25μg胰腺组织)到洁净离心管内，加入150μL乙腈溶液(此处提取液可为其他容量、种类的溶液，如175μL100%的乙腈和去离子水的混合物)，先预冷至温度为4℃，超声波处理，仪器条件为350W处理20min，-20℃条件下孵育1h，在4℃条件下14000rcf离心15min，取上清液，
2、使用1μL移液枪逐次移取1μL的样品溶液，依次滴加到附有Au纳米颗粒的靶板上，做好记录，自然晾干后放入飞行时间质谱仪中进行数据检测分析；
三、飞行时间质谱仪数据分析
参考飞行时间质谱仪器使用说明书，检查飞行时间质谱仪器是否正常工作，随后进靶，将载有靶板点的靶板放置进入飞行时间质谱仪内部，设置分析条件，检测范围设置为50～800Da，选择滴加样品的靶点进行数据采集；选择合适的谱图处理软件，打开分析样品中获得的质谱数据，随后对峰强信号应用平滑算法，对峰强信号应用基线校正算法，对质荷比进行内标法校正；应用合适的统计算法，分别筛选出谱图中的质荷比和峰高关系，并排除谱图中的杂峰；通过数据分析后得到样品溶液内待测物质所需信息。
专业术语解释：
肝组织活检：根据负压吸引的原理，采用快速穿刺方法，从肝内抽取少量的肝组织；
胰腺组织活检：根据负压吸引的原理，采用快速穿刺方法，从胰腺内抽取微量的胰腺组织；
肝组织甲醇提取液：取肝组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇溶液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，保存留用；
胰腺组织甲醇提取液：取胰腺组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇溶液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，保存留用；
飞行时间质谱仪：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪；
靶板：与飞行时间质谱仪适配的、承载待分析样品的金属板；
靶点：靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品；
质荷比：离子的相对质量与离子所带电荷(以电子电荷为单位)的比值，简写为m/z。
需要强调的是：对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (8)

1.一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将飞行时间质谱靶板放到有机试剂内清洗干净，使用氮气吹扫装置吹扫干燥；
S2：将Au纳米颗粒溶液加入溶剂进行稀释，移取Au纳米颗粒稀释后的溶液点涂到靶板靶点内；
S3：将滴加纳米材料的靶板放入烘箱内，设置温度80℃，烘干20-30min，便获得了表面附有Au纳米颗粒的靶板；
S4：制备待测样品溶液：利用取样设施取样得到的样品原材料进行操作配制，称取组织样品到离心管内，加入提取试剂，研磨或冻干处理，过滤，得到待测样品溶液，将待测样品溶液滴加到飞行时间质谱仪的金属靶板靶点上，晾干；
S5：飞行时间质谱仪数据分析：将加有样品溶液的靶板放入飞行时间质谱系统内，通过检测分析得到样品溶液内待测物质的质谱检测图谱，得出待测样品中待测物质的数据分析结果。
2.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述步骤S1、S2中的靶板是指与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)适配的、承载待分析样品的金属板，靶点是指靶板表面位置固定、边界均匀的二维区域，一般为圆形斑点，用于约束待分析样品，干燥方式选择自然晾干，也可选择真空抽干、惰性气体吹干干燥方式。
3.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S3中Au纳米颗粒的核壳结构形状为球形、方形、锥形、棒形的一种或几种，粒径尺寸范围为10-100nm。
4.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S4中制得的Au纳米颗粒基质均相溶液的浓度范围可选0.25-5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S3中优选化学还原法为主，采用柠檬酸纳为还原剂还原四氯金酸获得Au纳米颗粒基质均相溶液，梓檬酸盐还原法制得的Au纳米颗粒直径范围在8～60nm，再通过硫醇稳定两相合成法可将制得的Au纳米颗粒直径范围缩小到1～5nm。
6.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S5中待测物质包括体液中氨基酸小分子待测物以及多肽、蛋白质、核酸、微生物大分子待测物的代谢物、激素和微量元素物质。
7.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S4中待测样品为组织活检样品，包括肝脏组织、甲状腺组织、皮肤组织、肾上腺组织、胰腺组织以及其他组织，其他组织为肺、心脏，并且所测样品可通过以下方法制备得到：
a、研磨法：取待测组织样本至离心管或研磨罐内，加入甲醇或者乙腈提取试剂，加入研磨珠，放入研磨机内研磨，设置仪器参数，过滤后取滤液备用；
b、超声法：取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇或者乙腈提取物溶液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，备用。
8.根据权利要求1所述的一种附着Au纳米颗粒靶板应用在飞行时间质谱组织活检中的方法，其特征在于，所述的步骤S7中所测样品提取试剂，包括使用乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙醚和丙酮中的一种及以上有机试剂的混合溶液及其水溶液，其他水溶液用90%乙醇水溶液提取血清或血浆后的待测样品可被称为血清乙醇提取液、血浆乙醇提取液。
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