KR101956346B1 - 휘발성 유기화합물을 이용한 암 진단용 조성물 - Google Patents

휘발성 유기화합물을 이용한 암 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암을 진단하기 위한 조성물, 이를 포함하는 키트 및, 이를 이용하는 암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 암에서 휘발성 유기화합물인 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 2-펜타데카논 및 펜타데칸의 방출량을 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 비-침습적 방법을 이용하는 바, 신속하고 정확하면서 검사 대상에게 불편함이 없도록 스크리닝 또는 진단할 수 있으며, 폐암 및 대장암 진단에 공통적으로 사용할 수 있다.

Description

휘발성 유기화합물을 이용한 암 진단용 조성물{Compositions for Diagnosing of cancer using Volatile Organic Compounds}
본 발명은 휘발성 유기화합물을 이용한 암 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 4 종류의 휘발성 유기화합물 중 어느 하나 이상을 검출하여 암을 진단 또는 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
혈관신생 장애, 예컨대 암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만 명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고 있으며, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째 주요 사망 원인이다. 특정 암의 경우에는 의학적 치료에 유의한 진보가 있었지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 지난 20년 동안 약 10％만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에 제 시간에 이를 검출하고 치료하는 것은 극도로 어려운 일이다.
상기 암 중 많은 사망자를 내는 대표적인 암의 종류로서, 폐암, 대장암 등을 들 수 있는데, 특히 대장암과 관련하여, 국내 발생률이 현저하게 증가하고 있는 실정이다. 대장암은 초기에는 대부분의 경우 아무런 증상이 없으며, 대장암으로 인해 어떤 증상이 나타나는 경우에는 이미 대장암이 상당히 진행된 경우가 많다. 이는 대장암의 초기에는 암의 크기가 작아서 별다른 증상을 나타내지 않지만, 암이 자라서 커지는 경우 대장 내에서 변이 지나가는 것을 막게 되고, 이와 아울러 자라난 대장암에서 출혈이 일어나고, 대장암 표면에서 분비물이 배설되기 때문이다.
현재 대장암에 사용되고 있는 선별 검사로는 대변잠혈검사, 종양표지자검사, 대장조영술, 대장내시경검사, 전산화 단층촬영, 복부 초음파 검사, 경직장초음파 및 에스결장경 검사가 있으나 상기 검사들은 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 실제 생존율이 1기 땐 90% 이상이나 이미 폐나 간 등 먼 곳까지 퍼진 4기 땐 생존율이 5% 아래로 떨어진다는 사실을 고려한다면, 대장암 환자의 생존률을 높이기 위해서는 좀 더 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 방법을 개발되어야 할 것이다.
폐암은 발병률 2위, 사망률 1위, 사망증가율 1위인 (2002, 2005년 국립암센터 보고서) 암으로서 가장 치명적인 암이다. 폐암은 소세포 폐암(small cell lung cancer)과 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)으로 나누어진다. 그러나 폐암은 대부분의 다른 암과 마찬가지로 독특한 증세나 자각증상이 거의 없다. 따라서 폐암 진단을 받은 환자 중 21%만이 전이되지 않은 상태이고, 50%는 이미 전이되어 수술이 불가능한 상태인 경우가 많아, 폐암 환자의 70%가 1년 내에 사망하며, 87%가 5년 내에 사망하는 등 예후가 좋지 않은 질병 중의 하나이다. 이렇게 나쁜 예후와 높은 치사율을 보이는 것은 폐암을 효과적으로 진단할 수 있는 제제 또는 방법이 부족하기 때문이다
현재까지의 폐암의 검사 수단은 물리적인 접촉이 필요한 것이 대부분이며, 흉부 X선 촬영과 함께 조직 검사, 기관지경 검사, 흉부진찰, 고전압촬영, 객담세포진 검사 등이 행해지고 있다. 그러나 이러한 진단 방법은 경제적으로 부담이 될 뿐만 아니라 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다. 또한 혈장, 전혈 및 생검 조직과 같은 샘플 수집은 침습성이고, 잠재적인 원인의 손상, 감염 및 환자의 불편을 초래한다고 알려져 있다.
게다가, 특정 장비와 기구를 요구하므로 샘플 수집이 쉽지 않기 때문에 숙련되고, 자격이 있는 사람에 의해서만 수행될 수 있어 샘플을 모으기 위하여 많은 비용이 요구된다. 이러한 침습적 샘플링의 단점 때문에, 미래 스크리닝 및 진단에서 비-침습적 샘플을 이용에 대한 요구가 지속적으로 증가하고 있다.
이에 본 발명자들은 암 진단 방법에 있어서 보다 정확하고 신속한 방법에 대하여 연구한 결과, 암 세포에서 특이적으로 많이 방출되는 휘발성 유기화합물을 발견하여 이를 이용한 암을 진단하는 방법을 개발하였다.
따라서 본 발명의 목적은 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 11,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 진단을 위한 정보를 제공하기 위해서, 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
하기 화학식 1로 표시되는 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 하기 화학식 2로 표시되는 옥타데칸(octadecane), 하기 화학식 3으로 표시되는 2-펜타데카논(2-pentadecanone) 또는 하기 화학식 4로 표시되는 펜타데칸(pentadecane)은 휘발성 유기화합물로, 본 발명에서는 이들의 염 또는 유도체를 모두 포함하며, 가스 형태로 존재할 수 있다.
상기 휘발성 유기화합물이란 다른 물질들에 비해 실온에서 높은 휘발성을 가져 휘발이 되는 물질을 의미하며 대체로 비극성 또는 반극성 화합물이다. 특히 생명체로부터 유래하는 휘발성 유기화합물은 생체 유래 휘발성 유기 화합물이라고 하며 이 물질들의 조합에 따라 생명체들의 냄새가 결정된다.
Figure 112018045662949-pat00001
Figure 112018045662949-pat00002
Figure 112018045662949-pat00003
Figure 112018045662949-pat00004
상기 암은 폐암, 대장암, 유방암, 위암, 췌장암, 뇌종양 등의 고형암일 수 있고, 백혈병, 악성림프종, 다발성골수종 등의 혈액암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐암 또는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제는 상기 화합물과 결합 또는 흡착할 수 있는 물질을 의미한다.
상기 화합물과 결합할 수 있는 물질은 화합물, 단백질, 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 화합물을 흡착할 수 있는 물질은 섬유, 기판, 필름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 진단이란 병의 발병 여부 및 진행 정도, 치료 후 예후 등을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물은 환자군으로부터 암의 스크리닝하는 것에도 사용될 수 있다.
상기 스크리닝이란, 암의 가능성이 있는 환자군, 또는 암의 위험요소를 포함하는 환자군으로부터 암의 발병 가능성이 있는 환자를 선택하거나, 발병 가능성이 높은 환자를 선별하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 화합물을 검출할 수 있는 제제는 상기 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물과 결합 또는 흡착할 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
상기 화합물과 결합할 수 있는 물질은 화합물, 단백질, 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 화합물을 흡착할 수 있는 물질은 섬유, 기판, 필름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 암 진단을 위한 정보를 제공하기 위해서, 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게는 (a) 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출하는 단계; 및
(b) 정상 대조군 시료로부터 상기 화합물을 검출하여 상기 (a) 단계의 검출 결과와 비교하는 단계;를 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 암은 폐암, 대장암, 유방암, 위암, 췌장암, 뇌종양 등의 고형암일 수 있고, 백혈병, 악성림프종, 다발성골수종 등의 혈액암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐암 또는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “생물학적 시료”란 상기 화합물의 방출량이 정상 대조군과는 다른 양상을 보이는 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 조직, 호흡, 타액, 소변, 땀, 눈물, 정액, 대변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 조직은 피부를 포함할 수 있다.
본 발명의 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 고상 미량 추출법(solid phase microextraction, SPME)을 이용하여 상기 화합물을 검출하는 것에 특징이 있다.
상기 SPME는 비침습적 방법으로, 추출상(Extracting phase)이 코팅된 고체상태의 흡착형 파이버(fiber)에 기반한 추출 방식이다. 상기 SPME는 유기용매를 사용하지 않고도 목적하는 물질을 선택적으로 추출할 수 있다. 또한 물질을 화학평형에 기반하여 추출하는 방식이기에 비소모적(non-exhaustive)이며, 시료에의 접촉 없이 추출이 가능하며 비침습적(non-invasive)이다. 특히 공기 중(headspace)에 존재하는 휘발성 물질의 분석에 매우 적합하며, 다른 휘발성 물질 추출 방법에 비해 재현성이 높은 편이다.
상기 화합물은 생물학적 시료로부터 다이비닐벤젠/카복센/폴리디메틸실록산(divinylbenzene/carboxen/ polydemethysiloxane, DVB/CAR/PDMS)으로 코팅된 고상미량추출용 파이버(Solid Phase Microextraction, SPME fiber)를 이용하여 검출될 수 있다.
상기 다이비닐벤젠/카복센/폴리디메틸실록산(divinylbenzene/carboxen/ polydemethysiloxane, DVB/CAR/PDMS)로 코팅된 고상미량추출용 파이버는 휘발성 물질의 추출에 가장 적합한 친화도를 가지므로 암 진단 또는 스크리닝을 위한 본 발명의 조성물을 잘 흡착할 수 있어, 암 진단 또는 스크리닝의 정확도 및 정밀도를 더 높일 수 있다.
상기 고상미량추출용 파이버로 분석물질을 흡착하는 방법은 상기 파이버를 생물학적 시료에 일정 시간 동안 노출시켜, 분석물질을 흡착시키고, 이를 센서가 포함된 장치에 노출하여 상기 가스가 센서 및 가공 장치를 통하여 이용 가능한 상태로 전환되는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 파이버를 생물학적 시료에 노출시키는 시간은 3시간 내지 12시간일 수 있으며, 6시간 이상 수행되는 것이 바람직하다.
상기 추출된 휘발성 유기화합물은 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 가스의 함량 및 비율을 분석할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 바람직하게는 가스 크로마토그래피-질량분광분석(Gas Chromatography-Mass Spectrophotometry, GC-MS)과 가스 센서 어레이(Gas sensor array)를 이용할 수 있다.
상기 분석결과의 비교는 그 방법에 한정이 되지 않으며, 일예로 데이터베이스 내의 정상개체군과 암 환자군의 상기 휘발성 유기화합물의 분포 또는 분산, 함량 및 비율을 비교하는 방법을 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 270℃로 설정한 가스 크로마토그래피의 주입부에 파이버를 삽입한 후, 1시간 동안 탈착 과정을 거쳐, 파이버의 컨디셔닝(conditioning)을 먼저 진행한 후, 휘발성 유기화합물을 추출한다. 추출된 휘발성 유기화합물의 정량값은 기체 크로마토그래피와 질량분석기가 접목된 기기를 사용하여 획득하고, 각각의 피크 넓이를 이용하여 검출된 양을 결정한 후, 정상 대조군에서 검출된 휘발성 유기화합물의 정량값과 비교한다.
또한 본 발명은, 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 흡착하는 다이비닐벤젠/카복센/폴리디메틸실록산(divinylbenzene/carboxen/ polydemethysiloxane, DVB/CAR/PDMS)으로 코팅된 고상미량추출용 파이버(Solid Phase Microextraction, SPME fiber); 나노구조의 금속 산화 센서(nanostructure metal oxide sensor); 챔버 (chamber); 데이터 저장 시스템(data acquisition system); 및 프로세서(processor);를 포함하는 암의 진단, 모니터 또는 예측용 시스템을 제공할 수 있다.
상기 암의 진단, 모니터 또는 예측용 시스템은 생물학적 시료로부터 ,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone), 펜타데칸(pentadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 측정 및 분석하여 개체의 암 발병 여부, 병의 치료 경과 모니터 또는 병의 발병 가능성 예측 등을 할 수 있는 시스템을 의미한다. 상기 시스템은 암 진단 또는 스크리닝, 모니터 또는 예측용 센서 시스템이라고도 할 수 있다.
상기 시스템을 통해 측정된 생물학적 시료의 휘발성 유기화합물 방출량을 정상 대조군과 비교하였을 때 방출량이 증가한 경우, 암으로 진단하거나 암의 발병 가능성이 높다고 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 폐암 및 대장암에서 공통적으로 많이 방출되는 휘발성 유기화합물을 고상미량추출법을 이용하여 확인한 것으로, 상기 휘발성 유기화합물인 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 2-펜타데카논 및 펜타데칸은 정상 세포 대비 폐암 및 대장암에서 높은 방출량을 보였으므로 이를 암 진단 또는 스크리닝에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 비침습적으로(non-invasive) 시료와의 접촉 없이 추출하여 공기 중(headspace)에 존재하는 휘발성 물질을 분석하는 것으로써, 암 또는 암과 관련된 징후에서 방출되는 휘발성 유기화합물을 기반으로 하기에 비소모적(non-exhaustive)이며, 신속하고 정확하면서 검사 대상에게 불편함이 없도록 진단할 수 있는 효과가 있으며, 뿐만 아니라 폐암 및 대장암 각각 뿐 아니라 동시에 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 암세포가 방출하는 휘발성 물질을 검출하기 위한 고상미량추출법(solid phase microextraction, SPME)을 도식화한 이미지이다.
도 2는 휘발성물질의 추출에 가장 널리 사용되는 5가지 파이버(fiber)가 각 머무름 시간(retention time)별로 검출하는 휘발성물질의 추출량을 확인한 결과이다.
도 3은 5 종류의 파이버가 추출해내는 휘발성물질의 개수를 나타내는 결과이다.
도 4는 폐암 및 대장암에서 방출되는 휘발성 유기화합물을 검출한 결과이다.
도 5는 폐암 및 대장암에서 방출되는 다수의 휘발성 유기화합물 중 지표물질들을 확인한 결과이다.
도 6은 폐암 세포와 폐 정상세포의 휘발성 유기화합물 방출량을 비교한 결과이다.
도 7은 대장암 세포와 대장 정상세포의 휘발성 유기화합물 방출량을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
세포 배양
폐암 세포(A549), 대장암 세포(DLD-1), 정상 폐 세포(LL 24) 또는 정상 인간 대장 섬유아세포(CCD-18Co) (한국세포주은행)는 동일한 영양분의 공급을 위해 동일한 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배지로는 암세포의 증식에 적합한 배지(ATCC-modified RPMI1640)를 이용하였으며, 상기 배지에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic(penicillin, streptomycin, amphotericin B 이 혼합), 100배 농축)를 첨가하여 세포를 배양하였다. 더불어 휘발성 물질의 유출 손실을 방지하기 위하여 배양 플라스크에서 배양하였다. 각 세포는 37℃, 5% CO2의 배양기(incubator)에서 세포의 밀집도(cell confluence)가 80% 이상이 될 때까지 배양하였다. 적합한 밀집도를 달성하였을 때 새로운 배지로 교체하였으며 이때 최소 30 ml 이상의 배지를 추가함으로써 배지 상부(headspace) 대기의 부피를 줄여 추출의 재현성을 증가시켰다.
고상미량추출법을 이용한 휘발성 유기화합물 추출
상기에서 배양한 암 세포 또는 정상 세포 유래 휘발성 유기화합물을 검출하기 위하여, Sigma-aldrich사의 SPME 파이버(fiber) 중에서 휘발성 물질의 추출에 가장 적합한 친화도를 가진 다이비닐벤젠/카복센/폴리디메틸실록산(divinylbenzene/carboxen/ polydemethysiloxane, DVB/CAR/PDMS) (바늘 두께 23 gauge, 길이 1cm) 파이버를 사용하여 도 1과 같이, 고상미량추출법을 수행하였다.
배양 플라스크에 파이버를 삽입하기 전에 먼저, 가스 크로마토그래피(gas chromatography)의 주입부를 270 ℃로 설정하여 파이버를 삽입하고 1시간동안 탈착(desorption) 과정을 수행하여 파이버의 컨디셔닝(conditioning)을 진행하였다. 이 과정이 끝난 직후 외부 물질의 흡착을 방지하기 위하여 바로 셉텀(septum)으로 파이버를 밀봉하였다. 준비된 파이버는 배양 플라스크와 함께 무균 상태의 클린 벤치(clean bench)에 놓아두었다. 더불어 검출 중 플라스크 내 대기의 유출을 최소화하기 위하여 두 겹의 은박지로 플라스크 뚜껑을 감싸고 그 위에 셉텀을 파라필름(parafilm)으로 고정시켰다. 그리고 그 셉텀을 관통하도록 파이버를 삽입하고, 바늘 속에 들어있는 실제 추출부를 플라스크 내 대기에 노출시켰다. 그리고 배양 플라스크를 37℃, 5% CO2의 배양기에 넣고 6시간 이상 휘발성 유기화합물을 검출하였다. 완료된 파이버는 다시 추출부를 셉텀으로 밀봉하여 보관하였다.
휘발성 유기화합물의 정량
기체 크로마토그래피를 질량분석기(mass spectrometry)에 접목한 기기를 사용하여 상기에서 추출한 휘발성 유기화합물들의 정량값을 획득하였다. Agilent사의 DB-5ms 컬럼을 장착하여 휘발성 유기화합물들을 다른 물질들과 분리하였으며, 다양한 휘발성 유기화합물들을 동시에 분리 및 분석해야함을 고려하여 분리를 위한 오븐과 질량분석기의 조건을 하기 표 1과 같이 설정하였다.
데이터를 획득한 뒤 검출된 휘발성 유기화합물들의 피크 넓이를 이용하여 검출된 양을 결정하였고, 이를 기반으로 암세포와 정상세포간의 차이를 판별하였다.
장착된 컬럼 DB-5ms (30m × 0.25 mm, 0.25 μm 두께)
캐리어 가스(Carrier gas) 헬륨 (1 mL/min)
주입 온도(Injection temperature) 270℃
컬럼 온도 프로그램(Column temperature program) 70℃ -> 4℃/min 증가 -> 150℃ (hold 1 min) -> 5℃/min 증가 -> 280℃ hold 3 min)
이온화(Ionization) 전자 충격(Electron impact) (70 eV)
질량 검출 범위(Mass detection range) 40 - 500 m/z
<실시예 1> 파이버 적합성 평가
고상미량추출법에 있어서 적합한 파이버를 선정하기 위하여, 가장 널리 사용되는 5 가지 파이버(fiber)의 각 머무름 시간 별로 검출한 휘발성 유기화합물의 추출량을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. (단, PA -> Polyacrylate fiber, CP -> Carboxen/PDMS fiber, PD -> PDMS/DVB fiber, DCP -> DVB/CAR/PDMS fiber) 이에 따르면 대부분의 머무름 시간에서 DVB/CAR/PDMS가 검출량이 가장 높은 것을 알 수 있었다. 더불어 각각의 파이버가 검출한 휘발성 유기화합물의 개수를 확인하여 도 3에 나타내었다. DVB/CAR/PDMS가 가장 많은 개수를 검출하였기에 보편적으로 사용되는 5가지 파이버 중 DVB/CAR/PDMS가 지표물질을 검출하는 데 가장 우수한 성능을 가지고 있음을 확인하였다.
<실시예 2> 암 유래 휘발성 유기화합물 확인
폐암 및 대장암에서 방출되는 휘발성 유기화합물을 상기 <실시예 1>에서 확인된 DVB/CAR/PDMS 파이버를 이용하여 추출 및 분석을 진행하였으며 그 결과를 도 4에서 나타내었다. 도면에 있는 크로마토그램을 보면 지표물질들을 제외한 다수의 휘발성물질이 파이버에 흡착되어 가스크로마토그래피-질량분석기에서 검출되었음을 확인할 수 있다. 다수의 휘발성 물질들 중 지표물질들을 EIC(extracted ion chromatogram) 및 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 통해 확인하여 도 5에 나타내었다(각 물질의 대표적인 질량 스펙트럼을 선택하여 EIC(빨간색)로 나타냄). 그 결과, 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene)은 11.6분, 옥타데칸(octadecane)은 19.1분, 2-펜타데카논(2-pentadecanone)은 22.6분, 펜타데칸(pentadecane)은 12.5분에서 각각 검출되는 것을 확인하였다. 더불어 검정색으로 보이는 베이스 피크 크로마토그램(base peak chromatogram)에 보이는 다른 물질들 사이에서 각각의 물질들이 명확히 분리되었음을 확인할 수 있었으며 이는 한 샘플에서 모두 공통적으로 검출되었기에 진단시 공통적으로 활용이 가능함을 확인하였다.
<실시예 3> 폐암 세포와 정상세포의 휘발성 유기화합물 방출량 비교
상기 <실시예 2>에서 확인한 바를 기반으로, 폐암 세포와 정상 폐 세포의 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane), 2-펜타데카논(2-pentadecanone) 및 펜타데칸(pentadecane) 방출량을 비교하였다.
그 결과 도 6과 같이, 폐암 세포에서 4 종류의 휘발성 유기화합물 모두 최소 2배 최대 20배 정도 증가한, 320 내지 557%의 방출 증가를 보였다. 또한 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 펜타데칸은 **p<0.01를 보였으며, 2-펜타데카논은 *p<0.05의 유의성 있는 통계학적 차이를 보였다. 특히, 2-펜타데카논의 경우 정상 세포에 비해서 암 세포에서 현저한 방출량을 보였다.
<실시예 4> 대장암 세포와 정상세포의 휘발성 유기화합물 방출량 비교
더불어 상기 <실시예 2>에서 확인한 바를 기반으로, 대장암 세포와 정상 대장 세포의 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 2-펜타데카논 및 펜타데칸 방출량을 비교하여 도 7에 나타내었다.
상기 도 6과 마찬가지로, 대장암 세포에서 244 내지 2259% 의 방출 증가를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 더불어 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 펜타데칸은 **p<0.01를 보였으며, 2-펜타데카논은 *p<0.05의 유의성 있는 통계학적 차이를 보였다. 따라서 휘발성 유기화합물인 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 펜타데칸, 2-펜타데카논은 폐암 및 대장암을 스크리닝 또는 진단할 수 있는 공통적인 지표임을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 폐암 및 대장암에서 공통적으로 많이 방출되는 휘발성 유기화합물을 고상미량추출법을 이용하여 확인한 것으로, 상기 휘발성 유기화합물인 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠, 옥타데칸, 2-펜타데카논 및 펜타데칸은 정상 세포 대비 폐암 및 대장암에서 높은 방출량을 보이므로 이를 폐암 또는 대장암의 진단 또는 스크리닝에 사용할 수 있다.

Claims (12)

1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 포함하는 대장암 진단용 조성물.
1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
삭제
제2항에 있어서,
상기 제제는 상기 화합물과 결합 또는 흡착할 수 있는 물질이며, 상기 화합물과 결합할 수 있는 물질은 화합물, 단백질, 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 화합물을 흡착할 수 있는 물질은 섬유, 기판, 필름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트.
제5항에 있어서,
상기 제제는 상기 화합물과 결합 또는 흡착할 수 있는 물질이며, 상기 화합물과 결합할 수 있는 물질은 화합물, 단백질, 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 화합물을 흡착할 수 있는 물질은 섬유, 기판, 필름 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
대장암 진단을 위한 정보를 제공하기 위해서, 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출하는 방법.
제7항에 있어서,
(a) 생물학적 시료로부터 1,3-디터티아릴 뷰틸 벤젠(1,3-ditertiary butyl benzene), 옥타데칸(octadecane) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 화합물을 검출하는 단계; 및
(b) 정상 대조군 시료로부터 상기 화합물을 검출하여 상기 (a) 단계의 검출 결과와 비교하는 단계;를 포함하는 방법.
삭제
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 호흡, 타액, 소변, 땀, 눈물, 정액, 대변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 화합물은 고상 미량 추출법(solid phase microextraction)으로 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 화합물은 생물학적 시료로부터 다이비닐벤젠/카복센/폴리디메틸실록산(divinylbenzene/carboxen/ polydemethysiloxane, DVB/CAR/PDMS)으로 코팅된 고상미량추출용 파이버(Solid Phase Microextraction, SPME fiber)를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
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