JP2015518152A

JP2015518152A - 前立腺がんの検出用バイオマーカーの定量

Info

Publication number: JP2015518152A
Application number: JP2015508974A
Authority: JP
Inventors: ディーントロイヤー
Original assignee: イースタンバージニアメディカルスクール
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-06-25
Also published as: WO2013162773A1; EP2841948A1; US20150160224A1; WO2013162773A9; CA2871736A1

Abstract

本発明は、被験体ががん、具体的には前立腺がんを有しているかどうかを特定するのに有用なバイオマーカーを提供する。具体的には、前立腺がんを伴う個体、前立腺がんを発症するリスクにある個体を診断するため、及び／又は前立腺がんを伴う被験体の予後を決定するため、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンが使用され得る。また、本発明は、かかるバイオマーカーを定量する多重化アッセイに関する。【選択図】図２３

Description

関連出願
本出願は、２０１２年４月２７日付で出願された米国仮出願番号第６１／６３９，７６８号、２０１３年２月１３日付で出願された米国仮出願番号第６１／７６４，２８８号及び２０１３年３月４日付で出願された米国仮出願番号第６１／７７２，２２６号の米国特許法第１１９条（ｅ）による利益を主張し、それらの全体が参照により組み込まれる。

発明の分野
本発明は、前立腺がんの治療、診断、及び予防のための新規なバイオマーカーに関する。また、本発明は、かかる前立腺がんバイオマーカーの同定、特性評価、及び使用の方法に関する。また、本発明は、バイオマーカーを定量する多重化アッセイに関する。

前立腺がんは、米国において最も一般的な悪性腫瘍の１つである（１）。前立腺がんは、臨床的には異質性であり、非常に多様性のある自然経過を伴う（２）。早期発見のための血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のモニタリングの発見及び普及利用は、前立腺がんを診断及び治療する方法を大きく変えた。しかしながら、ＰＳＡは前立腺がんのスクリーニング手段としての特異性を欠き、実際にはがんを完全に除外するＰＳＡの下限値は存在しない（３）。そのため、前立腺がんにおける臨床上の判断は、生検結果に著しい負荷を課している。超音波内視鏡下穿刺生検は診断の基準ではあるものの、陰性結果ががんの存在を排除するものではない。サンプリングと解析変数の両方が偽陰性結果の原因となる。実施上、偽陰性結果は生検を繰り返す必要を生じ、診断及び治療を遅延するか、又はがんでない男性に無用に生検を繰り返させて、それに伴う不安及びリスクに曝す可能性がある（４、５）。前立腺がんの異質性もまた重大な問題であり、発生率は高いものの、前立腺がんによる死亡率は、肺、膵臓及び大腸等の他の主要ながんに起因する死亡率と比べて比較的低い。前立腺がんに広く採用されてきたグリソン分類は、転帰の予測因子である（６）。しかしながら、この分類の主な制限、及び積極的なスクリーニング手法の結果は、新たに診断される前立腺がん症例の大半がグリソンスコア６又は７の腫瘍であることである。これらの中度の分化型腫瘍は、無痛性であるか又は浸潤性のいずれかの可能性がある（７）。

上述のように、前立腺がんの予後の決定は、グリソン分類によって指導されている。この分類では、前立腺組織の生検が採取され、ホルマリンで固定され、パラフィン包埋され、その後切片が作製されて観察用に染色される。病理学者は、その後、組織の特定の試料に対して組織の外観に基づいてグレード又はパターンを与える。グレードは１〜５の範囲であり、数値が高くなるほどより浸潤性のがんを示す。病理学者は、最も共通する腫瘍パターンに対してグレードを与え、その後、２番目に共通する腫瘍パターンに対してグレードを与える。これらのグレードは、全体的なグリソンスコアを提供するために追加される。グリソンスコアは２〜１０の範囲であり、１０は予後が最も悪い。

グリソンスコアは、前立腺がん病期分類の唯一の構成要素である。前立腺がん病期分類の最も一般的な方法は、対がん米国合同委員会により公布され、「ＴＮＭ」分類として知られている。２種類の進行度分類、すなわち臨床病期及び病理学的病期が存在する。臨床病期は、外科的前立腺切除術等の処置の前に決定され、５つの主要素を含む：
・原発腫瘍の大きさ（Ｔ分類）
・がんが周囲のリンパ節に広がっているかどうか（Ｎ分類）
・遠隔転移の存否（Ｍ分類）
・診断時のＰＳＡレベル
・前立腺生検（又は手術）に基づくグリソンスコア
Ｔは原発腫瘍の大きさを表し、Ｎは周囲のリンパ節ががんに侵されているかどうかを表し、Ｍはがんの転移又は広がりを表す。

外科的前立腺切除に続いて、前立腺は、病理学的病期の割り当てのため注意深く検査される。前立腺がんに関する「Ｔ」スケールは以下の通りである：
Ｔ１：腫瘍は存在するが、臨床的にも画像化によっても検出できない
Ｔ１ａ：（他の理由で）切除した前立腺組織の５％未満に偶然、腫瘍が発見された。
Ｔ１ｂ：切除した前立腺組織の５％超に偶然、腫瘍が発見された。
Ｔ１ｃ：血清ＰＳＡの上昇により行われた穿刺生検で腫瘍が発見された。
Ｔ２：腫瘍は検査で触れ（触診され）得るが、前立腺の外に広がっていない。
Ｔ２ａ：腫瘍が２つ前立腺葉のうちの１つの２分の１以下に留まっている。
Ｔ２ｂ：腫瘍が片葉の２分の１を超えているが、両葉には及んでいない。
Ｔ２ｃ：腫瘍が両葉に及んでいるが、前立腺被膜内に留まっている。
Ｔ３：腫瘍が前立腺被膜を通して広がっている（広がりが途中である場合には、まだＴ２である）
Ｔ３ａ：腫瘍が被膜を通して片側又は両側に広がっている。
Ｔ３ｂ：腫瘍が片方又は両方の精嚢まで浸潤している。
Ｔ４：腫瘍が他の隣接構造まで浸潤している。
Ｎ及びＭと共にこのランク付けは、がんに対する根治治療を行うべきか、注意深い経過観察を選択すべきかを決定するため、グリソンスコアによる組織学的評価と組み合わされる。

浸潤性の前立腺がんのリスクを評価するため、ｄ’Ａｍｉｃｏ分類を含む様々なノモグラムが利用可能である（８）。これは以下のリスクスコアを割り当てる：低リスク：ＰＳＡ１０以下、グリソンスコア６以下、及び臨床病期Ｔ１〜２ａ；中程度のリスク：ＰＳＡ１０〜２０、グリソンスコア７、又は臨床病期Ｔ２ｂ；高リスク：ＰＳＡ２０超、グリソンスコア８以上、又は臨床病期Ｔ２ｃ〜３ａ。根治治療は、放射線療法、又は前立腺切除を必要とする。また、治療法は、平均余命、治療の副作用の可能性、及び生活の質の均衡を保つため異なる場合がある。患者が根治療法の延期を受け入れる場合、注意深い経過観察（定期的な通院及びＰＳＡ計測）又は積極的サーベイランス（定期的な通院及び計画的な生検の繰り返しと組み合わせたＰＳＡの計測）が使用される。

前立腺がんに関する診断及び予後の意思決定を行うための現在の方法は、観察者間変動を生じ、特に小さい腫瘍の場合に制限を有する。小さい腫瘍の場合は、定量的情報が患者及び内科医にとって役立つであろう。従って、前立腺がんの検出及び治療を補助するため、診断及び予後の意思決定の両方において臨床医及び病理学者の役に立つ新たな定量的方法が必要とされている。

前立腺がんを伴う男性の大半は、前立腺がんそのものよりも彼らが有する疾患により死亡し（６７）、スクリーニングが無痛性腫瘍の検出を増加したという有力な根拠が存在する（６８）。残念ながら、我々には浸潤性前立腺がんと無痛性前立腺がんを区別する臨床手段がなく（６９）、１４００名を超える男性がスクリーニングを必要とし、５０名近くの男性が前立腺がんによる死亡を予防するために治療を必要としていると推定される（７０）。同様の顕微鏡的特徴を伴う前立腺がんは、顕微鏡のみでは認められない個々の患者の遺伝学的及び生物学的な変数を反映する変化しやすい臨床転帰を有する（７１）。残念ながら、分子組織バイオマーカーの検出に必要とされる抽出方法によって、組織構造は破壊されることが多い。従って、同一の組織に対して組織学と競合する、バイオマーカーの発見及び検証のための新たな方法が必要とされている。疑わしい前立腺がんを診断するための標準治療である小穿刺生検が利用される場合には、特に必要とされる。

病理学的検査は、相変わらず腫瘍の診断、分類、及び病期分類の代表的基準である。分子試験の実施が組織を崩壊させる抽出方法を必要とすることが多いのに対し、病理学的検査は、無傷組織を必要とする。メタボロミクスは、生物学的試料に存在する小分子（２ｋＤ以下）（例えば、代謝産物）が抽出され、検出され、計測される、生体試料解析のより新しい分野である。その方法は、がんの診断及び進行のモニタリング、薬物の作用メカニズム、薬物毒性、工業用のバイオプロセシング等の多様な生物学的プロセスに関する生化学的基礎及びメカニズムの研究に採用されてきた。

生物学的試料の代謝産物を解析するため、代謝産物は試料から完全に抽出されなければならない。生物学的抽出の既存の方法は、他の解析（例えば、組織学）にもはや使用できないほど、試料を破壊することを含む。組織試料の固定は、通常、ホルマリン（水中ホルムアルデヒド）を用いて行われ、その後、組織学的加工及び切片作製が行われ、これが病理学者による顕微鏡学的検査用のスライドを作製する通常のワークフローである。この方法の欠点は、ホルムアルデヒドが代謝産物の効果的な抽出溶媒ではないということである。従って、一般的に知られている生物学的抽出方法のもと、組織学的解析を行い、メタボロミクスを実施するため、各解析に１つずつ、２つの組織試料が必要とされる。現況技術では、メタボロミクスのためだけに２度目の生検が使用され、組織学的には検査されない。そのため、メタボロミクスに使用される生検が疾患組織を含有するかどうか、確定的にはわからない。

様々な組織試料に対するメタボロミクス及び後の組織学を行うための方法及び試薬が、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７０９３号（国際公開２０１１／１４６６８３）に詳細に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。その方法の好ましい実施形態は、後に標準的な組織学的方法（細胞診解析を含む）を使用して解析され得るように、抽出される生化学が解析され得、抽出される組織がその細胞構造を維持するよう、単一の生物学的試料（例えば、組織生検）と溶媒（例えば、エタノール又はメタノール）とを接触させることを含む。この方法を使用して、多数の組織が抽出され、それらの生物学的化学物質が解析され、その後の組織学が行われた。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｕｓｔｅｒｅｔａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｙｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｆｉｘａｔｉｏｎ，ｍＰＲＥＦ：ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｂｉｏｍａｒｋｅｒａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｙｏｎｅｘａｃｔｌｙｔｈｅｓａｍｅｔｉｓｓｕｅ．”ＢＭＣＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ２０１１，１１：１４を参照されたい。

抽出及び固定による分子保存（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｂｙｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｆｉｘａｔｉｏｎ）（「ｍＰＲＥＦ」）の用語は、有機溶媒を含有する溶液中に組織を浸漬することにより小分子を抽出し、その後、組織学的方法を使用して組織の全く同じ部分を加工する一方、組織又は細胞の標本中の細胞構造を保存するプロセスを指す。ｍＰＲＥＦは、小分子代謝産物を含む生化学物質の定量、及び同じ組織試料の組織学的検査の両方を可能とする。ｍＰＲＥＦは、全く同じ組織において代謝産物の定量及び組織学を可能にする。これは、少量の腫瘍含有生検組織に関する新たな分子試験方法と標準的な組織学の競合を軽減する。ｍＰＲＥＦ処理された組織は、パラフィン包埋組織を使用する全ての既存の方法に使用され得る。ｍＰＲＥＦにおいて、含水アルコールは組織から選択的に小分子を抽出し、原位置にタンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡ等の巨大分子を残す。無傷組織においてタンパク質（免疫組織化学、ＩＨＣ）ならびにＲＮＡ及びＤＮＡ（蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ）を検出する既存の強力なｉｎ−ｓｉｔｕ法は、ｍＰＲＥＦ加工組織において引き続き使用され得る。

バイオマーカーは有機生体分子であり、試料におけるバイオマーカーの存在は、被験体（例えば、がん患者対正常患者、又はがん患者の予後）の表現型の状態を決定するために使用される。バイオマーカーを生物学的に関連性とするには、別の表現型状態（例えば、疾患を有しない）と比べて或る１つの表現型状態（例えば、疾患を有する）の被験体から採取された試料に差別的に存在しなければならない。バイオマーカーは、単独で又は組み合わせて、被験体が属する或る１つの表現型状態又は別の表現型状態の相対リスクの計測を提供する。従って、バイオマーカーは、疾患（診断）、予後（すなわち、疾患の状態）、薬物の治療効果（セラノスティックス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ））、薬物毒性、ならびに免疫反応の予測及び同定のためのマーカーとして有用である。

かかる試料を標準的な組織学的方法を使用してさらに解析することを可能とする方式で生物学的試料から単離される診断のためのがん代謝産物を定量する多重化アッセイが依然として必要とされている。同定され特性評価される代謝産物は、その後、がんバイオマーカーとして使用され得る。

特段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似の又は等価な方法及び材料が本開示の実施又は試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる説明であり、限定を意図するものではない。

或る１つの実施形態では、本発明は、（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；ならびに（ｃ）前記検出と前立腺がんの状態、又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんをスクリーニングする方法を提供する。

さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；ならびに（ｃ）前記検出と前立腺がんの状態、又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんをスクリーニングする方法を提供する。

さらなる実施形態では、前記少なくとも１つのバイオマーカーの検出は、質量分析によって行われる。

またさらなる実施形態では、前記生物学的試料は生体液及び組織からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、前記生体液は全血、血清、血漿、又は尿である。

さらなる実施形態では、前記組織は前立腺組織試料である。

さらなる実施形態では、前記生物学的試料は前記少なくとも１つのバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒と接触される。

さらなる実施形態では、前記溶媒はメタノール又はエタノールである。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体に由来する１又は複数の被験試料を得る工程；（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される工程；（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに（ｄ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量と前立腺がんの診断とを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんを診断する方法を提供する。

さらなる別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体から１又は複数の被験試料を得る工程；（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される工程；（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに（ｄ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量と前立腺がんの診断とを関連付ける工程であって、前記関連付けが、前記少なくとも１つのバイオマーカーの対照量と比較した、前記１又は複数の被験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの量を考慮に入れる工程、によって被験体において前立腺がんを診断する方法を提供する。

さらなる実施形態では、前記関連付けは、少なくとも１つのバイオマーカーの対照量と比較した、前記１又は複数の被験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの量を考慮に入れる。

さらなる実施形態では、被験試料は、尿、全血、血清、血漿、及び前立腺組織からなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記生物学的試料と、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒とを接触させる工程；（ｃ）前記少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーの量を定量する工程；（ｄ）前記被験体に抗前立腺がん薬又は治療法を提供する工程；（ｅ）工程（ａ）及び（ｂ）を使用して少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに（ｆ）２つの計測と、前立腺がんが退縮している又は進行しているという診断と関連付ける工程、によって被験体に対する前立腺がん薬又は治療法の効果をモニタリングする方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記試料中の少なくとも２以上のバイオマーカーを定量する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；（ｃ）前記定量と前立腺がんの状態又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんをスクリーニングする多重化アッセイを提供する。

さらなる実施形態では、前記少なくとも２以上のバイオマーカーの定量は、質量分析と並行して液体クロマトグラフィーによって行われる。

さらなる実施形態では、前記生物学的試料は生体液及び組織からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、前記バイオマーカーである、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンは同一のアッセイにおいて定量される。

さらなる実施形態では、前記バイオマーカーであるベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンは同一のアッセイにおいて定量される。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被検体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記生物学的試料と、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される２以上の前立腺がんバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒とを接触させる工程；（ｃ）前記生物学的試料中に存在する２以上のバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに（ｄ）前記２以上のバイオマーカーの量と前立腺がんの存在又は不在とを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんを検出する多重化方法を提供する。

さらなる実施形態では、前記定量は前立腺がんの異なる病期を区別する。

さらなる実施形態では、前記定量は被験体における前立腺がんの診断又は予後の一部である。

さらなる実施形態では、前記抽出された生物学的試料に対して追加の組織学的解析を行う工程。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体から１又は複数の被験試料を得る工程；（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程、（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；（ｄ）前記１又は複数の被験試料のグリソンスコアを決定する工程；（ｅ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量及びグリソンスコアと、Ｔ２対Ｔ３前立腺がんの相対リスクとを関連付ける工程、によって被験体において前立腺がんを診断する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）被験体から生物学的試料を収集するためのバイアル；（ｂ）前記生物学的試料からバイオマーカーを抽出するための溶媒、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される；（ｃ）前記バイオマーカーの抽出を行うための指示書；（ｄ）１又は複数の前記バイオマーカーを定量するための指示書；（ｆ）前記１又は複数のバイオマーカーの定量と前立腺がん又は正常の診断とを関連付けるための指示書、を用いて被験体において前立腺がんを診断するためのキットを提供する。

以下の図面は、説明のみであって限定を意図しない目的で提供される。

ウラシルの定量線である。Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩の定量線である。キサンチンの定量線である。アラニンの定量線である。プロリンの定量線である。ベタインの定量線である。システインの定量線である。リンゴ酸塩の定量線である。標的バイオマーカー化合物の定量結果が提供される。本発明のバイオマーカーの計測値が濃度標準曲線上にある濃度範囲を示す。これらは、灰色で陰影が付けられる。本発明の方法で解析された２９例の前立腺試料（１５例が腫瘍及び１４例が非腫瘍）に由来する実際の値を示す。本発明のバイオマーカーの計測値が濃度標準曲線上にある濃度範囲を示す。これらは、灰色で陰影が付けられる。ウラシルの定量線である。Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩の定量線である。キサンチンの定量線である。アラニンの定量線である。プロリンの定量線である。ベタインの定量線である。システインの定量線である。リンゴ酸塩の定量線である。Ｎ−アセチルグルコサミンの定量線である。本発明により記載される抽出及びメタボロミクス、ならびに後の組織試料の組織学を行う過程を表すグラフィックフローチャートである。腫瘍組織と比較した非腫瘍組織におけるバイオマーカーであるウラシル、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、キサンチン、ベタイン、リンゴ酸塩、及びＮ−アセチルグルコサミンの濃度の相違を示すグラフである。腫瘍組織と比較した非腫瘍組織におけるバイオマーカーであるアラニン及びシステインの濃度の相違を示すグラフである。

本発明は、前立腺がんのバイオマーカーに関する。また、本発明は、前立腺がんの診断を行うため又は予後を判定するため１又は複数のバイオマーカーの存在を検出する方法に関する。患者試料におけるこれらのマーカーの計測は、単独で又は組み合わせて、診断医が前立腺がんの診断、前立腺がん発症のリスク、及び／又は前立腺がんを伴う被験体の予後と関連付けることができる情報を提供する。或る実施形態では、前記バイオマーカーは、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンである。これらの９つのバイオマーカーの全てが、単一の多重アッセイにおいて同時に計測及び定量され得、臨床医又は病理学者に非常に役立つ情報を提供し得る。前記アッセイは、所望に応じてより少数のバイオマーカーを定量するため変更され得る。

本発明の或る１つの形態では、代謝産物のサブセットが前立腺組織の１８ゲージコア穿刺生検において定量され得ることを示すため、ｍＰＲＥＦが使用された。これらの代謝産物は、臨床上、有用なバイオマーカーとして使用され得る。別の実施形態では、これらのバイオマーカーの定量は、前立腺がんの診断又は予後において使用され得る。本発明の方法は、独立して又は現在受け入れられている（又は後に開発される）前立腺がんを診断する及び／又は前立腺がんを伴う患者の予後を決定する方法と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の方法は、組織学の方法と組み合わされてもよい。

本発明の１つの態様は、タンデム質量分析システムに連結された超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用する、がん穿刺生検抽出物に由来する選択候補診断代謝産物を定量するためのアッセイである。或る１つの形態では、前記がんは前立腺がんである。抽出及び固定による分子保存（「ｍＰＲＥＦ」）を使用して調製された外科的前立腺切除標本から採取された前立腺穿刺生検による代謝産物のサブセットは、前立腺がん診断バイオマーカー候補として同定された（６６）。どの代謝産物が最も有用であるかを決定するため、定量に必要とされる解析技術（例えば、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ等）、すなわち、前記代謝産物ががんに関するバイオマーカーであったことを確認するために使用され得る証明研究の種類；及び代謝産物が診断解析に使用され得る可能性のある能力に基づいてそれらをランク付けした。この解析に基づき、９つの代謝産物が前立腺がんに関して可能性のあるバイオマーカーとして同定された。本発明の１つの態様では、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳがアッセイプラットフォームとして使用され得る。しかしながら、任意のＬＣ／ＭＳ配置が使用され得る。

本発明のアッセイが開発され、２９例のヒト前立腺生検抽出物において以下のバイオマーカー、すなわちベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンを定量するために使用された。これらは、それぞれ、アラニン及びアスパラギン酸塩の代謝；システイン、メチオニン、ＳＡＭ、及びタウリン代謝；グリシン、セリン、及びスレオニン代謝；尿素サイクル、アルギニン及びプロリン代謝；アミノ糖、解糖、ペントース代謝、クレブス回路、プリン（ヒポキサンチン／イノシン含有）及びピリミジン代謝の経路を表す８つの生化学的グループを含む。

これらのバイオマーカーは、がん、例えば前立腺がんの予後及び診断を補助するための多重化アッセイにおいて使用され得る。本発明の１つの態様は、１８ゲージコア穿刺生検に対して定量的な方式で単一のＬＣ−ＭＳの実行で９つ全ての同定された代謝産物のアッセイを可能とする。これは、臨床の場での迅速な適用を可能とする。その後、前記組織はパラフィンに包み込まれ、さらなる加工及び組織学に供され得る。この手法の概要を説明するフローチャートが図２２に示される。

本発明の１つの利点は、前記バイオマーカーが、前立腺切除標本から入手される前立腺組織試料に対するのではなく、むしろ前立腺生検の際に定量され得ることである。前立腺切除は、患者及び内科医が既に根治療法を経るという決断をし、前立腺全摘出術を選択した場合に生じる。前立腺切除標本に由来する予後の情報は価値のないものではないが、前立腺生検に含まれる予後の情報にはより大きな価値がある。根治療法前の決断時点はより重要であり、これは患者が生検の後に前立腺がんと診断された時である。従って、この時点で有用な予後マーカーは、生検組織に適用されなければならない。本発明のアッセイは、前立腺生検からバイオマーカーを定量することを可能とし、従って、根治療法の前に情報を提供することができる。現在、患者にとって利用可能な治療選択肢として、注意深い経過観察及び積極的サーベイランスが挙げられる。積極的サーベイランスプロトコルは、根治療法を経るという決断が実質的にグリソンの等級付けによって影響を受けることから問題がある。上述のように、これは観察者間変動を生じるため制限がある。従って、定量的情報は、患者及び内科医にとって役立つものであろう。

また、前立腺切除標本から入手される前立腺組織試料に対するのではなく、むしろ前立腺生検の際のバイオマーカーの定量は、代謝産物に対する虚血時間の効果を減少できることから有利であり得る。ヒト前立腺組織に関する代謝産物データは、前立腺切除標本から得られた凍結保存組織を利用していた。これらは、標本の輸送及び加工に関わる任意の時間の前に少なくとも４０分〜６０分の温虚血（手術中）時間に供されてもよい。

本発明の別の利点は、ｉｎｖｉｖｏで実施される場合、前立腺全体のサンプリングを可能とすることである。バイオマーカーは、組織学的腫瘍が存在しているかどうかに関わらず各コアにおいて定量され得、腫瘍を含む複数のコアがサンプリングされ得る。前立腺を幅広くサンプリングする能力は、前立腺がんが異質性であり得ることから非常に重要な可能性がある。

本発明のさらなる利益は、既存の診断／予後の方法よりも、より少量の組織に対して前記解析が行われ得ることである。具体的には、本方法は、約５ｍｇの組織を摘除するに過ぎない単一の１８ゲージ穿刺生検で行われ得る。組織生検のための以前の方法は、大きな組織の摘除（１グラム以上）又は小容量の複数の生検（例えば、約５ｍｇの組織を採取する１８ゲージコア生検）を必要とした。これら２つの生検方法の問題は、それらが相当な量の組織の摘除を必要とし、被験体により大きな不快症状及び外傷をもたらすことである。

本発明の方法では、組織試料に対してバイオマーカーの固定が行われ得、その同じ組織試料が、その後、さらなる組織学的評価に送られ得る。これは、ホルマリンが代謝産物に対する好適な抽出溶媒ではないことから、組織試料がホルマリン中に固定されていた従来の抽出方法に対する改善である。ホルマリンは、代謝産物の抽出において効果的ではなく、反応性であるため代謝産物の化学を変更する可能性がある。従って、２つの別々の試料（異なる組織で構成される）は、従来の方法を使用して採取されなければならない。本発明の方法では、後に標準的な組織学的方法（細胞診解析を含む）を使用して解析され得るように、前記抽出された代謝産物が解析され得、前記抽出された組織がその細胞構造を維持するよう、単一の生物学的試料（例えば、組織生検）が溶媒（例えば、エタノール又はメタノール）と接触される。前記代謝産物は、その後定量されてもよく、バイオマーカーが同定されてもよい。

本発明のさらなる態様は、上記解析を多重化アッセイとすることである。多重化アッセイは、特定の試料において複数のバイオマーカーを同時に計測するアッセイである。バイオマーカーは、最小の調製により患者試料から直接的に計測され得る。バイオマーカーが疾患状態に関連することから、これは臨床の場における患者の健康のリアルタイムの評価を可能とする。例えば、本発明の或る１つの形態では、前立腺がん生検の試料が、様々ながん患者から抽出された。代謝産物が抽出され、一連のバイオマーカーが発見された（ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びアラニン）。これらのバイオマーカーは、その患者の疾患状態の多重化解析に使用され得る。

本発明の別の利点は、バイオマーカーを解析するハイスループット法を提供することである。代替的には、無傷組織を使用して、無傷組織においてバイオマーカーを計測するため、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が使用される。ＩＨＣ及びＦＩＳＨは技術的に困難であり、一般的に１つずつ行われ、顕微鏡的な判断を必要とし、観察者間変動を導く。ＩＨＣは、目視の検出及び判断をさらに必要とする。

本発明の別の利点は、前記結果が定量的であることである。本明細書に記載される代謝産物の計測は、代謝産物の絶対モル量で表され得る。これは、定量が困難であることで有名なＩＨＣの結果と大きな違いである。

前立腺がんのバイオマーカーとしてのベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン、またそれらの方法及び使用が開示される。これらのバイオマーカーは、がん、具体的には前立腺がんを伴う患者において過剰発現される。従って、これらのバイオマーカーは、がんを伴う患者を診断するのに利用され得るか、又はがんを発症するリスクにある患者を診断するのに使用され得る。或る実施形態では、本発明は、被験体から得られた１又は複数の被験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの差次的発現を検出することを含み、前記バイオマーカーが、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンである、被験体において前立腺がんを診断する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体から得られた１又は複数の被験試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの差次的発現を検出することを含み、前記バイオマーカーが、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンである、前立腺がんを伴う被験体の予後を決定する方法を提供する。

本発明の或る１つの形態では、被験体においてがん、具体的には前立腺がん、又はがんを発症するリスクを診断する方法が提供される。本方法は、（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；（ｂ）前記生物学的試料と、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンを含むがんバイオマーカーを抽出することが可能な抽出溶媒とを接触させる工程；（ｃ）前記バイオマーカーの量を測定する工程；ならびに（ｄ）前記バイオマーカーの量と前立腺がんの診断とを関連付ける工程、を含む。

正常な生物学的試料におけるがんバイオマーカー（すなわち、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン）の量は、本明細書に記載される様々な方法で評価され得る。或る１つの形態では、バイオマーカーの正常量又は対照量は、がんを伴わない１又は複数の個体から得られた１又は複数の試料におけるベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンの量を評価することによって決定され得る。

本発明の方法を使用して、前立腺がんを有すると疑われる被験体に由来する生物学的試料において、及び正常被験体又は健康な被験体に由来する１又は複数の比較可能な生物学的試料（すなわち、対照試料）において、前立腺がんバイオマーカー（すなわち、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン）のレベルが測定される。正常被験体又は健康な被験体に由来する比較可能な生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカーレベルよりも高い、前立腺がんを有すると疑われる被験体に由来する生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカー（すなわち、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン）のレベルは、その前立腺がんを有すると疑われる被験体が前立腺がんを有するか、又は前立腺がんを有している可能性があることを示す。

また、本発明のバイオマーカーは、定量され、疾患の様々な病期と関連付けられ得る。例えば、前記バイオマーカーは、被験体が前立腺がんのｐＴ２病期又はｐＴ３病期の疾患を有するかどうかを特定するために使用され得る。現在、前立腺切除が行われる以外にｐＴ２疾患とｐＴ３疾患を明確に区別する方法は存在しない。本発明の方法を使用し、前立腺がんを有すると疑われる被験体に由来する生物学的試料において、及び異なる病期（すなわち、ｐＴ２又はｐＴ３）の疾患を伴う被験体に由来する１又は複数の比較可能な生物学的試料において、前立腺がんバイオマーカー（すなわち、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン）のレベルが測定され得る。疾患のｐＴ２病期又はｐＴ３病期を伴う被験体に由来する比較可能な生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカーレベルと比較可能な、前立腺がんを有すると疑われる被験体に由来する生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカー（すなわち、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミン）のレベルが、前立腺がんのどの病期が試験される被験体にあるのかについての指示となる。

本発明の他の態様では、ｍＰＲＥＦ技術と併せたバイオマーカーの定量は、前立腺がんに関するもの以外のバイオマーカーに関して行われ得る。本発明の定量方法は、任意の組織生検及び任意の病状に対して適用可能であり、単一の器官部位に限定されない。本発明の方法の他の可能性のある適用として、炎症性皮膚疾患、糖尿病、拒絶反応の解析用同種移植片、筋肉及び神経の生検、ならびに微細針吸引及び塗抹標本等の細胞診標本が挙げられる。

本発明に従い、少なくとも１つのバイオマーカーが検出され得る。幾つかの又は全ての同定されたバイオマーカーを含む、１又は複数のバイオマーカーが検出され、その後解析され得ることが理解され、本明細書に記載される。

また、通常の組織学の方法が本発明の方法と併せて使用され得ることが理解される。これは、腫瘍容積を推定するためにスライドを画像化することによってなされる。前記方法は、ワークフローを最適化するため、自動化特徴認識と手動（病理学者が補助する）特徴認識及び割り当てを組み合わせてもよい。本発明の１つの態様は、１）標本の全面積、２）良性上皮の表面積、３）腫瘍上皮の表面積、及び４）間質の表面積含む表面積を合理的に見積もることができるハイスループットシステムをもたらすことである。その後、この情報は、効率的に代謝産物データと組織学とを関連付けるためコンピューター支援ソフトウェアと共に使用され得る。

また、本発明の方法は、視覚的に人間工学的な様式で標準的な教科書に基づく病理学的生検報告により正規化された代謝産物の値を表示するグラフィカルユーザーインターフェイス（「ＧＵＩ」）と併せて使用され得る。具体的には、本発明は、臨床医（泌尿器科医；がん専門医）エンドユーザーに容易に見て明らかな「フロントシート」に各陽性コアとの相対リスクを表示する病理学的報告を表示するために使用され得る。定量を伴うより詳細な表示は「バックシート」にある。実験室において受け取られた各標本（各コア）は、２行又は３行のテキスト、診断、グリソンスコア及びグレード、腫瘍に侵された生検の割合の推定、及び腫瘍に侵されたコアの数を伝達する病理学的レポートの作成を必要とする。正規化された代謝産物データは、従来の病理学的レポートと組み合わされ得る。代謝産物データは迅速に読み取られ、容易に判断されてＴ３対Ｔ２疾患の相対リスク等として表され得る。最近の研究は、デジタル画像加工の多くの方法が前立腺画像化に使用され得ることを示した（６３、６４、６５）。これらは、前立腺組織の自動分類及び正確な等級付けのため病理学的前立腺画像の加工用コンピューター支援ツール及びソフトウェアを含む。

ｍＰＲＥＦ技術が本明細書に記載されるが、本発明のバイオマーカーは、被験体に由来する任意の生物学的試料から検出されてもよい。生物学的試料は、全血又は血清等の生体液であってもよい。また、生物学的試料は、前立腺組織等の組織由来であってもよい。本発明の一般的な方法を実施するのに有用な組織標本の他の例として、前立腺、中枢神経系、骨、乳房組織、腎組織（ｒｅｎａｌｔｉｓｓｕｅ）、子宮内膜、頭頸部、胆嚢、耳下腺組織、脳、脳下垂体、腎組織（ｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅ）、筋、食道、胃、小腸、大腸、尿道、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心臓、肺、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、及び胸腺から採取された試料が挙げられる。

また、本発明のバイオマーカーは、全血、血清、血漿、尿、涙、粘液腹水、口腔液、唾液、精液、精漿、粘液、便、痰、脳脊髄液、骨髄、リンパ液、及び胎児液等の生体液から検出されてもよい。生体液試料は、細胞、タンパク質、又は細胞の膜抽出物を含んでもよい。

「被験体」は生体又は死体を含む。被験体の例として、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。前記被検体はヒトであることが最も好ましい。

本発明のバイオマーカーは、尿又は血清等の生体液から単離され精製され得る。それらは、それらの質量、それらの結合特性、ならびにベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンとしてのそれらの同一性に基づいて、当該技術分で既知の任意の方法により単離され得る。例えば、バイオマーカーを含む生物学的試料は、クロマトグラフィーによる分画に供され、さらなる分離に供され得る。

「精製された」は実質的に純粋であることを意味し、他のタンパク質、脂質、糖、又は天然に関連する他の物質を実質的に含まないバイオマーカーを指す。

前立腺がんを伴う被験体に投与された抗前立腺がん薬又は施された治療法の効果をモニタリングする。
本発明の別の実施形態では、前立腺がんと診断された被験体に投与された抗前立腺がん薬又は施された治療法の効果のモニタリングの一環として被験体の前立腺がんの状態が決定される。前立腺がんを伴う被験体に投与された抗前立腺がん薬又は施された治療法の効果は、前立腺がん過程の増悪又は改善を含んでもよい。

本発明の方法を使用して、様々な時に抗前立腺がん薬又は治療法が与えられた被験体に由来する生物学的試料において、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、又はＮ−アセチルグルコサミンのレベルが測定される。２度目（ｔ２；例えば、抗前立腺がん薬又は治療法が与えられた後）に採取された同じ被験体に由来する比較可能な生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカーレベルよりも高い、１度目（ｔ１；例えば、抗前立腺がん薬又は治療法を与える前）に被験体に由来する生物学的試料において検出される前立腺がんバイオマーカーレベルは、被験体においてがんが退縮していることを示す。同様に、１度目の前立腺がんバイオマーカーレベルと比べてより高い２度目の前立腺がんバイオマーカーレベルは、被験体においてがんが進行していることを示す。

別の実施形態では、本方法は、少なくとも２つの異なる時間点、例えば第１時点及び第２時点で被験体において１又は複数の前立腺がんバイオマーカーを計測すること、そのうち１つはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、又はＮ−アセチルグルコサミンであってもよく、ならびに、もしあれば量の変化を比較することを含む。がんの進行又は退縮に対する抗前立腺がん薬又は治療法の効果は、これらの比較に基づいて決定される。そのため、本方法は、治療法の奏効を測定するのに有用である。治療が効果的であれば、前立腺がんバイオマーカーは正常に傾き、一方、治療が効果的でない場合には前立腺がんバイオマーカーは疾患兆候へと傾く。

別の実施形態では、前記方法は、少なくとも２つの異なる時間点、例えば、第１時点及び第２時点で被験体において前立腺がんバイオマーカーの１又は複数の転移を計測すること、そのうちの１つは、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンであってもよく、ならびに、もしあれば量の変化を比較することを含む。これは、疾患の状態、疾患の進行、及び治療に対する奏効の可能性を評価するために行われる。

前立腺がんの診断及び予後評価用キット
本発明の方法は、単独で又は組み合わせて、キットの形態で提供されてもよい。キットは、適切な対照試薬及び／又は検出試薬をさらに具備してもよい。或る実施形態では、前記キットは組織試料の解析又は生検のための道具及び試薬を備えてもよい。前記キットは、試料収集要素及び収集要素に生検又は組織試料を入れるための道具を備えてもよい。収集要素は、抽出溶媒、インキュベーション後に組織を取り出す道具、及び組織学的解析用の収集容器に収集された組織試料を入れる道具を備えてもよい。例えば、前記キットは、試料収集要素、抽出溶媒、組織取り出し要素、取り出した組織の収集容器、試料ラベル、試料バーコード、及び指示プロトコルを備えてもよい。前記指示プロトコルは、印刷形態若しくは冊子、又は電子媒体上、例えばコンピューターディスク若しくは他のコンピューター可読媒体で提供され得る。

以下の実施例は、説明のみであって限定を意図しない目的で提示される。

可能性のある前立腺がんバイオマーカーを定量する方法が以下に提供される。

材料及び方法
ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、及びアラニンを含む参照標準及び安定同位体標識標準は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入された。ベタイン−トリメチル−ｄ５ヒドロクロリド、キサンチン１，３−Ｎ１５、システインＣ１３、リンゴ酸塩−２，３，３−ｄ３、及びＬ−プロリン２，５，５−ｄ３を含む安定同位体標識化学物質は、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．（マサチューセッツ州アンドーバー）から得られ、ウラシル−ｄ４、Ｎ−アセチル−アスパラギン酸塩２，３，３−ｄ３、及びアラニン−Ｃ１３はＣ／Ｄ／ＮＩＳＯＴＯＰＥＳＩＮＣ（カナダ、ケベック州）から得られた。メタノール（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）、アセトニトリル（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）、及びギ酸（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）を含む化学物質は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニュージャージー州フェアローン）から購入された。酢酸アンモニウム及び酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。ギ酸ナトリウム溶液（９０：１０の２−イソプロパノール：水中０．０５ＭＮａＯＨ＋０．５％ギ酸、マサチューセッツ州ミルフォードＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）が機器の調整及び較正に使用された。ＬＣ−ＭＳＰａｋフィルターを具備したＭｉｌｌ−ＱＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）により超純水が産生された。

Ｉ定量実験
一次治療として前立腺切除を選択した患者の外科的前立腺切除標本から合計２９例の抽出試料が得られた。生検は、ｅｘｖｉｖｏで得られ、試料調製及び解析まで４℃で保存された。アッセイの検証及び濃度の推定のために被験試料の各アリコートを混合することにより、貯蔵された品質対照試料が調製された。

試料の調製
各試料１ｍＬは５ｍＬのガラスバイアルに移され、室温にて穏やかな窒素のもと（Ｇｌａｓ−ＣｏｌＮｉｔｒｏｇｅｎＥｖａｐｏｒａｔｏｒＳｙｓｔｅｍ、インディアナ州テレホート）で乾燥された。残渣は１００μＬのアセトニトリル及び１００μＬの水を用いて再構成された。その混合物は２０分間１４，５００ｒｐｍで遠心分離された（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ジョージア州アトランタのＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）。得られた上清の１５０μＬのアリコートは２ｍＬのガラスサンプルバイアルに移され、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）上で解析された。

定量線
参照標準及び安定同位体標識標準の両方は、以下に示される適切な溶媒に溶解された。定量線の範囲は各化合物について異なり、実際の試料に存在する各代謝産物の濃度は変化することから、定量範囲を推定するため貯蔵試料が使用された。各化合物／代謝産物について所定の濃度が得られた。検量／線形方程式及び対応する回帰係数（Ｒ２）は、ＱｕａｎＬｙｎｘＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＭａｎａｇｅｒ（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）を使用して算出され、定量限界は本研究における検量線の最低濃度として規定された。バイオマーカーであるシステイン、リンゴ酸塩、ウラシル、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、キサンチン、アラニン、ベタイン、及びプロリンに関するこれらの実験において作成された検量線は、図１〜８に示される。図９は、この一連の実験における様々な組織試料からの実際のバイオマーカーの全ての計測を含む。図１０は、組織中の特定のバイオマーカーの計測値がそのバイオマーカーの検量線の範囲内であったことから、本発明のバイオマーカーが定量可能であることを示す。図面において、灰色の欄は、組織試料中のバイオマーカーの量が含まれた検量線上の範囲を示す。図面の数値は、検量線の実際の値である。

これらの実験の間、Ｉ）Ａ：アセトニトリル（０．２％ギ酸、ｐＨ＝３）、及びＢ：水（０．２％ギ酸、ｐＨ＝３）；ＩＩ）Ａ：アセトニトリル及びＢ：水；ＩＩＩ）Ａ：アセトニトリル（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．５）、及びＢ：水（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝６）；ＩＶ）Ａ：アセトニトリル（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝３．８）、及びＢ：水（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝４）；Ｖ）Ａ：アセトニトリル（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝３）、及びＢ：水（５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝３）を含む幾つかの移動相が比較された。クロマトグラフィーの実施及び全体的な感度に基づいて、移動相Ｉが最終的に選択された。溶離勾配は、著しく解析時間を増加せずに可能な限り多くの標的化合物を分離する目的で最適化された。

クロマトグラフィーの性能を妨げることなく抽出効率を最大化するため、種々の再構成溶媒が比較された。Ｉ）アセトニトリル／メタノール＝７５：２５（ｖ／ｖ）；ＩＩ）アセトニトリル／水＝８０：２０（ｖ／ｖ）；ＩＩＩ）アセトニトリル／水＝６５：３５（ｖ／ｖ）；ＩＶ）アセトニトリル／水＝５０：５０（ｖ／ｖ）；Ｖ）水を含む計５種類の代表的な溶媒が使用された。最適な希釈溶媒及び再構成溶媒は、ピーク形状及び回収率の点からアセトニトリル／水＝５０：５０（ｖ／ｖ）であった。１００μＬのアセトニトリルの後１００μＬの水を用いる二段階再構成によって最大で一貫性のある回収率が達成された。

ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ−ＱｕａｔｔｒｏＰｒｅｍｉｅｒＸＥＭＳ、マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）が使用された。前記システムは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ポジティブモードで操作された。最適な機器の設定が表１ａ〜表１ｂに簡単に記載される。（おそらくは表のまま残されるが、番号を付け直さなければならない）グラジエント溶媒Ｂ＝水中０．２％ギ酸及びグラジエント溶媒Ａ＝アセトニトリル中０．２％ギ酸。

以下の表１ａ及び表１ｂは、この一連の実験に関する機器の設定を示す：

ＭＲＭモードでＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用することにより、以下の代謝産物が濃度範囲内であった：ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、及びアラニン。被験試料中のＮ−アセチルアスパラギン酸塩の濃度はＬＯＱぎりぎりであったが、定量方法のさらなる改良により曲線の線形範囲内となることから（図１０を参照されたい）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩はなおも実行可能なバイオマーカーである。

最初の一連の実験（上記）は、どの代謝産物が定量され得て前立腺がんの実行可能なバイオマーカーとなり得るかを特定するために使用された。次の一連の実験（下記）は、前立腺がんのバイオマーカーとしてこれらの代謝産物を確認した。

ＩＩ前立腺がんバイオマーカーの同定
外科的前立腺切除標本からｅｘｖｉｖｏで得られた単一のコア穿刺生検は、早急に８０％含水アルコール中に置かれ、１２時間〜２４時間後にホルマリンに移された。アルコールは保持され、乾燥され、９５μＬのアセトニトリル及び９５μＬの水を用いて残渣が再構成された。全く同じ組織に対して組織学が行われた。

標準及び溶媒
ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、Ｎ−アセチルグルコサミン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニンを含む参照標準及び安定同位体標識標準は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から購入された。グルコサミンＣ１３ヒドロクロリド、ベタイン−トリメチル−ｄ５ヒドロクロリド、キサンチン１，３−Ｎ１５、システインＣ１３、リンゴ酸塩−２，３，３−ｄ３、及びＬ−プロリン２，５，５−ｄ３を含む安定同位体標識化学物質は、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．（マサチューセッツ州アンドーバー）から得られ、ウラシル−ｄ４、Ｎ−アセチル−アスパラギン酸塩２，３，３−ｄ３、及びアラニン−Ｃ１３はＣ／Ｄ／ＮＩＳＯＴＯＰＥＳＩＮＣ（カナダ、ケベック州）から得られた。メタノール（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）、アセトニトリル（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）、及びギ酸（ＯｐｔｉｍａＬＣ−ＭＳ）を含む化学物質は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニュージャージー州フェアローン）から購入された。酢酸アンモニウム及び酢酸（Ｇｌａｃｉａｌ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。ギ酸ナトリウム溶液（９０：１０の２−プロパノール：水中０．０５ＭＮａＯＨ＋０．５％ギ酸、マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）が機器の調整及び較正に使用された。ＬＣ−ＭＳＰａｋフィルターを具備したＭｉｌｌ−ＱＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓｙｓｔｅｍ（マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）により超純水が産生された。

試料の供給源
前立腺穿刺生検から抽出された合計３０例の研究試料が提供され、試料の調製及び解析前に４℃にて保存された。試料（ＣＡ５６６１＿１）は、注入中の機器の故障（過剰気圧）のため解析されなかった。解析された実際の試料数は２９例であった。バイオマーカーを定量するために使用された１２名の患者に由来する組織試料は以下の通りであった：１５例の腫瘍試料（試料１例がｐＴ３ａ及び試料１４例がｐＴ２）及び１４例の対をなす隣接する非腫瘍試料。

試料の調製
各試料１．９ｍＬは５ｍＬのガラスバイアルに移され、室温にて穏やかな窒素流のもと（Ｇｌａｓ−ＣｏｌＮｉｔｒｏｇｅｎＥｖａｐｏｒａｔｏｒＳｙｓｔｅｍ、インディアナ州テレホート）で乾燥された。残渣は９５μＬのアセトニトリル及び９５μＬの水を用いて再構成された。その混合物は２０分間１４，５００ｒｐｍで遠心分離された（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ジョージア州アトランタのＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）。得られた上清の１５０μＬのアリコートは２ｍＬのガラスサンプルバイアルに移され、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）上で解析された。

定量線
参照標準及び安定同位体標識標準の両方が、それらの溶解性に基づいて適切な溶媒（メタノール又は水）に溶解された。安定同位体標識標準は、それらの対応する検体の内部標準として使用され、そのようにして、試料調製、注入、クロマトグラフィー、マトリクス効果等の間の可能性のある変化を相殺するために使用された。定量線溶液は、参照標準のストック溶液の各アリコートを混合し、その後メタノール及び水の混合物（５０：５０、ｖ／ｖ）を用いる一連の希釈により調製された。各化合物についての所定の濃度が得られた。検量等式及び対応する回帰係数（Ｒ２）は、ＱｕａｎＬｙｎｘＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＭａｎａｇｅｒ（マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．）を使用して算出され、定量限界は検量線における最低濃度として規定された。これらの曲線は、図１３〜２１に示される。

腫瘍／非腫瘍を含むｍＰＲＥＦ試料は、上述の開発されたアッセイ方法及び得られた濃度範囲を使用して解析された。これらの代謝産物は、単一のＬＣ／ＭＳの実行で解析された。
以下の表２ａ及び表２ｂは、この一連の実験についての機器の設定を示す：

図１３〜２１は、これらの実験で解析された各バイオマーカーについての検量線である。図１１は、この一連の実験における本発明のバイオマーカーの定量データを含む。図１２は、各バイオマーカー（灰色バンドにより表される）について定量範囲はバイオマーカーの検量線の線形部分に含まれることを示す。従って、これらのバイオマーカーの各々は、前立腺組織の１８ゲージコア生検において定量され得る。

ＩＩＩ腫瘍表面積に対するバイオマーカーの正規化
本発明のバイオマーカーが生検中に存在する腫瘍の量に一致することを測定するため、所与の生検における腫瘍、非腫瘍、腺及び間質の量の形態学的測定が使用された。各生検コアについて、全生検表面積に対してデータが正規化された。生検表面積は、高解像度フラットベッドスキャナ上でスライドガラスをスキャンすることによって得られた。ダーク画素はプログラム「ＩｍａｇｅＪ」を使用して表面積に変換された。得られた表面積は、その後、データをμＭ／ｃｍ２へと変換するために使用された。腫瘍を含まない試料及び腫瘍を含む試料に関するμＭ／ｃｍ２の値が下表３に提供される。

上記表３では、腫瘍なしμＭは生データであり、μＭ／Ｃｍ２は生検コアの表面積に対して正規化されたデータであり、ＬｏＳｔｄ／ＨｉＳｔｄは標準曲線の下端及び上端である。「腫瘍補正」データの算出は以下に記載される。

また、データは、腫瘍のパーセント表面積に基づいて正規化された。パーセント腫瘍は、病理学者によって生検の顕微鏡的検査により評価された。各バイオマーカーに関する生データは、十進形式で割合を表すことによって、また１に等しくなる適当な係数を乗じることにより１００％腫瘍当量に変換された（例えば、１０％＝０．１；０．１×１０＝１）。これは、表３において「腫瘍補正」と呼ばれる。その後、正常組織におけるバイオマーカーの量と腫瘍組織における量の相違を示すため、腫瘍なしの値は腫瘍補正値と比較された。図２３は、正常組織（黒色）対腫瘍組織（灰色）におけるウラシル、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、キサンチン、ベタイン、リンゴ酸塩、及びＮ−アセチルグルコサミンバイオマーカーの比較を示す。図２４は、正常組織（黒色）対腫瘍（灰色）におけるシステイン及びアラニンのレベルの比較を示す。これらのデータは、本発明のバイオマーカーは、特定の前立腺生検におけるがん組織の量を定量的に測定するために使用され得る。従って、これらのバイオマーカーは、前立腺がんを検出するため、前立腺がんの予後を決定するため、前記疾患の治療をモニターするため、及び前立腺がんの可能性のある新たな治療をスクリーニングするために使用され得る。

本発明は、図面及び上記の記載において説明され、記載されているが、これらは説明であって、特性を限定するものではなく、好ましい実施形態のみが示され、記載されていること、また、本発明の精神に含まれる全ての変更及び改良の保護が望まれると理解される。さらに、本明細書に引用された全ての参照文献及び特許は、当該分野の技術レベルを示し、それらの全体が参照により組み込まれる。
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Claims

被験体において前立腺がんをスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；ならびに
（ｃ）前記検出と前立腺がんの状態、又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、
を含む方法。
被験体において前立腺がんをスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；
（ｂ）前記試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；ならびに
（ｃ）前記検出と前立腺がんの状態、又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、
を含む方法。
前記少なくとも１つのバイオマーカーの検出が質量分析によって行われる、請求項１に記載の方法。
前記生物学的試料が生体液及び組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記生体液が全血、血清、血漿、又は尿である、請求項４に記載の方法。
前記組織が前立腺組織試料である、請求項４に記載の方法。
前記生物学的試料が、前記少なくとも１つのバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒と接触される、請求項１に記載の方法。
前記溶媒がメタノール又はエタノールである、請求項７に記載の方法。
被験体において前立腺がんを診断する方法であって、
（ａ）被験体から１又は複数の被験試料を得る工程；
（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに
（ｄ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量と前立腺がんの診断とを関連付ける工程、
を含む方法。
被験体において前立腺がんを診断する方法であって、
（ａ）被験体から１又は複数の被験試料を得る工程；
（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される工程；
（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに
（ｄ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量と前立腺がんの診断とを関連付ける工程であって、前記関連付けが、前記少なくとも１つのバイオマーカーの対照量と比較した、前記１又は複数の被験試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を考慮に入れる工程、
を含む、方法。
前記関連付けが、前記少なくとも１つのバイオマーカーの対照量と比較した、前記１又は複数の被験試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を考慮に入れる、請求項１０に記載の方法。
前記被験試料が、尿、全血、血清、血漿、及び前立腺組織からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
被験体における前立腺がん薬又は治療法の効果をモニタリングする方法であって、
（ａ）前記被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；
（ｂ）前記生物学的試料と、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒とを接触させる工程；
（ｃ）前記少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーの量を定量する工程；
（ｄ）前記被験体に抗前立腺がん薬又は治療法を提供する工程；
（ｅ）工程（ａ）及び（ｂ）を使用して前記少なくとも１つの前立腺がんバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに
（ｆ）前記２つの計測と、前立腺がんが退行している又は進行しているという診断とを関連付ける工程、
を含む方法。
被験体において前立腺がんをスクリーニングする多重化アッセイであって、
（ａ）被験体に由来する生物学的試料を提供する工程；
（ｂ）前記試料中の少なくとも２以上のバイオマーカーを定量する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程；
（ｃ）前記定量と前立腺がんの状態又は前立腺がんがないこととを関連付ける工程、
を含む多重化アッセイ。
前記少なくとも２以上のバイオマーカーの定量が質量分析と並行して液体クロマトグラフィーによって行われる、請求項１４に記載の方法。
前記生物学的試料が生体液及び組織からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
前記生体液が全血、血清、血漿、又は尿である、請求項１６に記載の方法。
前記組織が前立腺組織試料である、請求項１６に記載の方法。
前記バイオマーカーである、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンが同一のアッセイにおいて定量される、請求項１４に記載の方法。
前記バイオマーカーであるベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンが同一のアッセイにおいて定量される、請求項１４に記載の方法。
被験体において前立腺がんを検出する多重化方法であって、
（ａ）前記被検体に由来する生物学的試料を提供する工程；
（ｂ）前記生物学的試料と、ベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される２以上の前立腺がんバイオマーカーを抽出することが可能な溶媒とを接触させる工程；
（ｃ）前記生物学的試料中に存在する前記２以上のバイオマーカーの量を定量する工程；ならびに
（ｄ）前記２以上のバイオマーカーの量と前立腺がんの存在又は不存在とを関連付ける工程、
を含む多重化方法。
前記定量が前立腺がんの異なる病期を区別する、請求項２１に記載の方法。
前記定量が前記被験体における前立腺がんの診断又は予後の一部である、請求項２１に記載の方法。
前記溶媒がメタノール又はエタノールである、請求項２１に記載の方法。
前記抽出された生物学的試料において追加の組織学的解析を行う工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
被験体において前立腺がんを診断する方法であって、
（ａ）被験体から１又は複数の被験試料を得る工程；
（ｂ）前記１又は複数の被験試料において少なくとも１つのバイオマーカーを検出する工程であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される工程、
（ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの量を定量する工程；
（ｄ）前記１又は複数の被験試料のグリソンスコアを決定する工程；
（ｅ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの定量及びグリソンスコアと、Ｔ２対Ｔ３前立腺がんの相対リスクとを関連付ける工程、
を含む方法。
被験体において前立腺がんを診断するためのキットであって、
（ａ）前記被験体から生物学的試料を収集するためのバイアル；
（ｂ）前記生物学的試料からバイオマーカーを抽出するための溶媒であって、前記バイオマーカーはベタイン、リンゴ酸塩、プロリン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸塩、ウラシル、キサンチン、システイン、アラニン、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される、溶媒；
（ｃ）前記バイオマーカーの抽出を行うための指示書；
（ｄ）１又は複数の前記バイオマーカーを定量するための指示書；
（ｆ）前記１又は複数のバイオマーカーの定量と前立腺がん又は正常の診断とを関連付けるための指示書、
を含むキット。