JPWO2018101327A1 - 検体中の特定のpsaの含有量に基づく、前立腺癌のグリーソンスコアの推定方法、病理病期分類の推定方法、および補助情報の取得方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明における、前立腺癌の診断または治療のための補助情報は、前立腺癌の診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、機械または医師以外の者が、医師による診断に役立つデータを分類する方法とも表現できる。
検体中のLacdiNAc−PSAの含有量を測定するための方法は、所定の閾値と比較することのできる精度を有する測定値が得られる限り、特に限定されるものではなく、様々な定量方法を用いることができる。
β−GalNAc残基親和性分子としては、β−GalNAc残基に対して親和性を有するレクチン(β−GalNAc残基親和性レクチン)またはβ−GalNAc残基をエピトープとする抗体(抗β−GalNAc抗体)を用いることができる。
レクチンは、特定の糖残基に対する親和性を有する、つまり特定の糖残基を認識してそこに結合するタンパク質であり、様々な生物に由来する多数の種類のレクチン(凝集素と呼ばれることもある)が知られている。レクチンの種類によって親和性を有する糖残基は様々であり、また多くのレクチンは、1種類の糖残基だけでなく複数の種類の糖残基と親和性を有する(ただし、特定の糖残基に対する親和性が強く、他の糖残基に対する親和性は弱い)。一般的に、抗β−GalNAc抗体のように、糖鎖中の特定の糖残基をエピトープとする抗体は作製しにくいのに対し、β−GalNAc残基親和性レクチンは、安価で大量に入手することができ、また安定性にも優れており長期間保存も可能であるため、β−GalNAc残基親和性分子として好ましい。
β−GalNAc残基親和性分子をLacdiNAc−PSAに結合させる工程を含む、LacdiNAc−PSAの定量方法の代表的な実施形態(第1定量方法)としては、β−GalNAc残基親和性分子と共に、これとは別のPSAに特異的に結合する分子をLacdiNAc−PSAに結合させ、これら3分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させることを含む方法が挙げられる。このサンドイッチ型複合体の具体例としては、支持体に担持された(固相化された)PSAタンパク質をエピトープとする抗PSA抗体と、LacdiNAc−PSAと、蛍光標識されたβ−GalNAc親和性レクチンまたは抗GalNAc抗体とからなるサンドイッチ型複合体が挙げられる。
SPFSは、誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に裏面(誘電体部材と接触している側)から、全反射減衰(ATR)が生じる角度で入射光を照射したときに、金属薄膜を透過して表面(測定領域が形成されている側)に生じるエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用し、その増強されたエバネッセント波を励起光として、測定領域に捕捉された測定対象物を標識している蛍光物質から効率的に蛍光を発生させる方法である。その蛍光の強度を測定することによって検体中の測定対象物を定量することができ、各検体についての測定値を、濃度が既知の標準試料を用いて測定したときの蛍光の強度の測定値と対比することにより、検体中の測定対象物の含有量(濃度)に換算することができる。このようにして行われるSPFSは、ELISAのような従来の蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、検体中の測定対象物の濃度が極めて低い場合の定量法として好適である。
続いて、上記のようなSPFSを行うために好適なSPFSシステムの一実施形態を、図2に基づいて説明する。
SPFSシステム1は、SPFS測定部材16、SPFS測定装置10、および制御演算装置40によって構成されている。
測定された検体中のLacdiNAc−PSAの含有量(濃度)から、本発明の各方法における推定または情報取得を行うために必要となる閾値(カットオフ値)は、公知の推定方法または情報取得方法と同様の一般的な手法によって、例えば診断マーカーまたは腫瘍マーカーについての閾値と同様にして、設定することができる。
具体的には、LacdiNAc−PSAの量をU/mLで表した場合に、GSが4+3以上であると推定するためのカットオフ値(閾値)は0.05〜0.31U/mLに設定することが好ましい。なお、GSが4+3以上である前立腺癌の見逃しを防ぐためには、カットオフ値としては0.05〜0.1U/mLに設定することが好ましく、特にリスクの高いGSが4+3以上である前立腺癌を優先的に発見、治療するためのカットオフ値としては0.1U/mLを超えて0.31U/mL以下に設定することが好ましい。
GSが3+4以下であると推定するためのカットオフ値は、0.02〜0.31U/mLに設定することが好ましい。なお、GSが3+4以下である前立腺癌の確率が非常に高く、経過観察と診断するための補助情報を得ることが目的の場合、カットオフ値は0.02〜0.1U/mLに設定することが好ましい。
閾値を変えると感度および特異度も連動して変わるので、両方のバランスがとれるよう調整(最適化)することが望ましい。測定データの母集団であるサンプル数を多くするほど、信頼性の高い閾値を設定することが可能となる。このようにして設定される閾値と、ある検体中のLacdiNAc−PSAの含有量(濃度)の測定値とを比較することによって、グリーソンスコアを推定するための補助情報を得ることができる。例えば、LacdiNAc−PSAの含有量(濃度)の測定値が閾値以上であればその検体を採取した前立腺癌患者はグリーソンスコアが4+3以上である、または閾値未満であれば3+4以下であると、所定の確率(感度および特異度)をもって推定するための補助情報を得ることができる。
具体的には、LacdiNAc−PSAの量をU/mLで表した場合に、pTが3以上であると推定するためのカットオフ値は0.06〜1.24U/mLに設定することが好ましい。なお、pTが3以上である前立腺癌の見逃しを防ぐためには、カットオフ値としては0.06〜0.1U/mLに設定することが好ましく、特にリスクの高いpTが3以上である前立腺癌を優先的に発見、治療するためのカットオフ値としては0.25〜1.24U/mLに設定することが好ましい。
pTが2以下であると推定するためのカットオフ値は、0.03〜0.23U/mLに設定することが好ましい。なお、pTが2以下である前立腺癌の確率が非常に高く、手術適用の有無などを診断するための補助情報を得ることが目的の場合、カットオフ値は0.03〜0.12U/mLが好ましい。一般的に、pTが高いほど、LacdiNAc−PSAの定量値も高い傾向にある。
本発明の各方法を効率的に実施するために、必要な試薬類をまとめてキットを構成することができる。このようなキットは少なくとも、本発明の各方法において行われる、血清等の検体中のLacdiNAc−PSAの濃度を測定するための試薬類および器具類を含む。LacdiNAc−PSAの濃度を測定には、典型的にはSPFSやELISAのようなサンドイッチ型アッセイに基づく定量方法が利用され、必要に応じてレクチンアフィニティーカラムによる分画法も併用される。したがってキットも、典型的にはそれらの方法に適したサンドイッチ型免疫複合体を形成するための試薬類、すなわち、固相化用の抗PSA抗体、およびLacdiNAc−PSAの検出用のβ−GalNAc残基親和性分子(WFA等の所定のレクチンまたは抗β−GalNAc抗体)を主要な構成物とし、必要に応じてレクチンアフィニティーカラムを作製するためのレクチンなども構成物とすることができる。
図2[B]に示す実施形態に準じたSPFS測定装置を自作し、以下の実施例に使用した。照射手段20の光源としては、波長635nmの光を照射することができるレーザーダイオード(LD)を用い、光源と誘電体部材12との間には、減光フィルタ(中性濃度フィルタ)を設けてフォトン量を調整できるようにした。誘電体部材12としては、60度のプリズム(シグマ光機(株))を用いた。この誘電体部材12の上面に、次に述べるようにして作製した、透明平面基板13を含むプラズモン励起センサ16aと流路部材16bとからなる部材(センサーチップ)を固定することによって、測定部材16を構成した。蛍光検出手段32の光検出器としては、光電子倍増管(PMT)を用い、集光レンズとして対物レンズを設けた。
屈折率1.72、厚さ1mmのガラス製の透明平面基板((株)オハラ「S−LAL 10」)をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmであった。
上記のように作製した流路型SPFS測定部材に外部流路およびペリスタポンプを接続し、超純水を10分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を20分間、室温(25℃)、流量500μL/分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。
その後、1重量%牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を30分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
標記の蛍光標識レクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Alexa Fluor(登録商標)647 タンパク質ラベリングキット」(インビトロジェン社)を利用して作製した。WFA(VECTOR Laboratories社「L−1350」)100μg相当と、上記キットに含まれる0.1M重炭酸ナトリウムと、Alexa Fluor 647 reactive dyeとを混合し、室温で1時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったAlexa Fluor 647 reactive dyeを取り除いて、蛍光標識WFAレクチンを得た。その後、吸光度を測定して標記の蛍光標識レクチンの濃度を定量した。
前立腺癌と診断され、前立腺を全摘出された患者92名を対象に、手術前の血清検体中のLacdiNAc−PSAの濃度およびトータルPSAの濃度を定量した。患者背景を表1に示す。LacdiNAc−PSAの濃度の定量は、上記のようにして準備した抗PSAモノクローナル抗体固相化基板を備えた流路型SPFS測定部材および蛍光標識WFAを用いて、SPFSにより行った。手順の詳細は以下の通りである。一方、トータルPSAの濃度は、「ARCHITECTアナライザーi1000SR」システムおよび前立腺特異抗原キット「トータルPSA・アボット」(アボットジャパン株式会社)を用いて、所定の方法により定量した。
かった。
前述したようにして測定された、前立腺癌と診断された患者191名の、生検前の血清検体中のLacdiNAc−PSAの濃度について、生検により採取された組織のGS、それぞれのプライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせとの関連を調べた。結果を図6に示す。生検前の血清検体中のLacdiNAc−PSAの濃度が高いほど、プライマリーパターンおよびセカンダリーパターンの組み合わせによる悪性度も高くなる傾向が示されている。
10 SPFS測定装置
12 誘電体部材
13 透明平面基板
14 金属薄膜
16 SPFS測定部材(流路型)
16a プラズモン励起センサ
16b 流路部材
18 測定部材装填部
20 照射手段
22 入射光
24 反射光
26 受光手段
28 SPR測定部
30 蛍光
32 蛍光検出手段
34 SPFS測定部
36 流路
38 測定領域
40 制御演算装置
60 SAM
62 支持体
64 抗PSA抗体
80 蛍光標識β−GalNAc親和性分子
82 β−GalNAc親和性分子
84 蛍光物質
100 LacdiNAc−PSA
102 PSAタンパク質
104 非還元末端にβ−GalNAc残基を有する糖鎖
104a β−GalNAc
110 非LacdiNAc−PSA
114 非還元末端にβ−GalNAcを有さない糖鎖
Claims (6)
- 前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコア(GS)を推定する方法であって、
検体中の、β−N−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するPSA(Prostate Specific Antigen:前立腺特異抗原)の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもってGSが4+3以上であると推定する、または
その測定値が閾値よりも小さいことをもってGSが3+4以下であると推定する方法。 - 前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、前立腺癌の進行度を表す病理病期分類(pT)を推定する方法であって、
検体中の、β−N−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するPSA(Prostate Specific Antigen:前立腺特異抗原)の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもってpTが3以上であると推定する、または
その測定値が閾値よりも小さいことをもってpTが2以下であると推定する方法。 - 前立腺癌の診断または治療のための補助情報として、それらの必要性の程度を判断するための情報を取得する方法であって、
検体中の、β−N−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するPSA(Prostate Specific Antigen:前立腺特異抗原)の含有量を測定し、
その測定値が閾値以上であることをもって、前立腺癌を診断するための検査を通常よりも精密なものとすべきである、または前立腺癌を治療するために積極的治療介入を行うべきである、と判断するための情報とする方法。 - 前記PSAの定量を、β−N−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記PSAに結合させる工程を含む方法によって行う、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記β−N−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子が、ノダフジレクチン(Wisteria floribunda Lectin:WFA)、ダイズ凝集素(Soybean Agglutinin:SBA)、カラスノエンドウレクチン(Vicia Villosa Lectin:VVL)またはキカラスウリレクチン−II(Trichosanthes japonica agglutinin−II:TJA−II)、あるいは抗β−N−アセチルガラクトサミン抗体である、請求項4に記載の方法。
- 前記PSAの定量を表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)を用いて行う、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
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