CN109765321B - 一种测定银杏叶中活性成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学分析及检测技术领域，尤其涉及一种测定银杏叶中活性成分含量的方法。本发明运用超高效液相色谱‑串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阴离子串联质谱多反应检测(MRM)模式，快速在线优化包括碎裂电压以及碰撞能在内的质谱参数，使之形成高强度的靶向离子对，通过此系列特征性的靶向离子对，从而达到对银杏叶药材中的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的快速定性和定量分析；本发明的检测方法操作简单，具有高灵敏度和精密度、重现性好、稳定性高、回收率好，可实现同时测定银杏叶中所含的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，能准确、全面地控制银杏叶药材的质量。

Description

一种测定银杏叶中活性成分含量的方法

技术领域

本发明涉及化学分析及检测技术领域，尤其涉及一种测定银杏叶中活性成分含量的方法。

背景技术

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘等功效，常用于治疗心脑血管疾病及老年痴呆症。银杏叶化学成分复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类化合物、萜内酯类化合物、醇类化合物、生物碱类化合物、聚异戊二烯类化合物、多糖等具有药理作用的活性成分。

据2015版《中国药典》规定，银杏叶药材的质量控制指标仅有黄酮醇苷和萜内酯两类活性成分，其中对于银杏叶黄酮类化合物质量标准的研究，也仅是先采用20％盐酸水解，然后测定槲皮素、山奈素和异鼠李素3个成分的含量，最后折算成总黄酮醇苷含量的方法，然而，此方法只能笼统得到银杏叶中总黄酮的含量，不能对银杏叶中的每一个黄酮类成分进行检测，不能准确的反应银杏叶中每一个黄酮类成分的相对含量，不利于对银杏叶及其制剂进行更为精准的质量控制。

由于银杏叶萜内酯类物质的化学结构不存在明显的发色团，其在银杏叶中的含量极低，且不易分离纯化，容易被银杏叶中所含的其他具有强紫外吸收的物质所干扰，往往需要进行样品前处理(柱层析、固相吸附或超临界萃取)以去除可能的干扰，再配合蒸发光检测器进行高效液相色谱法定量分析，其中具有强紫外吸收的物质主要是黄酮醇类物质，而黄酮醇类物质恰恰是银杏叶中另一类需要定量检测的活性成分，从而造成难以有效测定银杏萜内酯类活性成分含量的问题。

此外，银杏叶药材中除了黄酮醇苷类和萜内酯类活性成分外，还含有非常丰富的双黄酮类化合物，主要包括7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮及金松双黄酮，由于该类成分不在《中国药典》规定的质量控制指标之内，因而往往被大多数人或企业所忽视。大量研究表明，银杏叶药材中的异银杏双黄酮具有体内外抑制大鼠血栓形成的作用。银杏双黄酮具有抗卵巢腺癌细胞活性，特别是对I型疱疹病毒(HSV-1)具有很强的抑制活性，同时对II型疱疹病毒(HSV-2)以及人类巨细胞也具有抑制活性，抗炎活性效果优于泼尼松龙，此外还具有抗氧化活性等。因此，为了提高和完善银杏叶药材的质量标准，对除黄酮醇苷和萜内酯类成分之外的双黄酮类活性成分进行研究，显得尤为重要。

对于银杏叶及其制剂中活性成分含量的测定方法，现有技术多采用不同的检测方法分别检测银杏萜类内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分，该方法的缺点是需要采用不同的仪器、不同的样品处理条件分别检测，从而导致操作步骤繁杂，工艺简便性不足。因此，实现同时测定银杏叶中银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分含量的测定，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，准确、全面地控制银杏叶药材的质量，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定银杏叶中活性成分含量的方法，该方法能够实现同时测定银杏叶中银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分含量的测定，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，准确、全面地控制银杏叶药材的质量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种测定银杏叶中活性成分含量的方法，包括以下步骤：

提供银杏叶供试品溶液；提供银杏叶标准品溶液；

采用质谱电喷雾阴离子串联质谱多反应检测模式，以银杏叶标准品为模板化合物，在线优化质谱参数，预测得出银杏叶标准品的靶向离子对；

将所述银杏叶标准品溶液和银杏叶供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，根据银杏叶活性成分含量的标准曲线，得到银杏叶供试品溶液中活性成分的含量；

其中，超高效液相色谱分析的检测条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的质量分数为0.1％；梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相A由12％增加至20％；0.5～6min，流动相A由20％增加至45％；6～12min，流动相A由45％增加至55％；12～13min，流动相A由55％增加至80％；13～15min，流动相A由80％降低至12％；

其中，质谱分析的检测条件为：

工作模式：负离子模式；扫描方式：多反应检测模式。

优选的，进行所述超高效液相色谱-质谱分析所用的仪器为超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪。

优选的，所述流动相的体积流量为0.2mL/min。

优选的，进行所述超高效液相色谱分析时的进样量为2μL。

优选的，进行所述超高效液相色谱分析的色谱柱为Agilent Eclipse PlusC18RRHD，所述色谱柱的尺寸为2.1mm×50mm，填料粒径为1.8μm。

优选的，进行所述超高效液相色谱分析时的柱温为30～40℃。

优选的，进行所述质谱分析的喷射电压为3500V。

优选的，进行所述质谱分析的流速为10L/min。

优选的，进行所述质谱分析时，雾化器的压力为25psi。

优选的，进行所述质谱分析的离子源温度为300℃。

本发明提供了一种测定银杏叶中活性成分含量的方法，本发明运用超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阴离子串联质谱多反应检测(MRM)模式，快速在线优化包括碎裂电压以及碰撞能在内的质谱参数，使之形成高强度的靶向离子对，通过此系列特征性的靶向离子对，从而达到对银杏叶药材中的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的快速定性和定量分析；

本发明的检测方法操作简单，具有高灵敏度和精密度、重现性好、稳定性高、回收率好，可实现同时测定银杏叶中所含的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，能准确、全面地控制银杏叶药材的质量。

附图说明

图1为本发明实施例1中超高效液相色谱-质谱多反应检测模式下，银杏叶中银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种测定银杏叶中活性成分含量的方法，包括以下步骤：

提供银杏叶供试品溶液；提供银杏叶标准品溶液；

采用质谱电喷雾阴离子串联质谱多反应检测模式，以银杏叶标准品为模板化合物，在线优化质谱参数，预测得出银杏叶标准品的靶向离子对；

将所述银杏叶标准品溶液和银杏叶供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，根据银杏叶活性成分含量的标准曲线，得到银杏叶供试品溶液中活性成分的含量；

其中，超高效液相色谱分析的检测条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的质量分数为0.1％；梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相A由12％增加至20％；0.5～6min，流动相A由20％增加至45％；6～12min,流动相A由45％增加至55％；12～13min，流动相A由55％增加至80％；13～15min，流动相A由80％降低至12％；

其中，质谱分析的检测条件为：

工作模式：负离子模式；扫描方式：多反应检测模式。

本发明提供银杏叶供试品溶液。本发明优选将银杏叶与乙醇溶液混合，进行提取，得到银杏叶供试品溶液。在本发明中，所述银杏叶与乙醇溶液的用量比优选为1～5g：50～200mL，更优选为2～4g：100～150mL，所述乙醇溶液的体积分数优选为10～70％，更优选为20～50％。本发明优选通过匀质进行所述混合，所述匀质的转速优选为(1～15)×1000rpm/min，时间优选为1～5min。本发明优选在超声条件下进行所述提取，所述超声的时间优选为10～60min，所述提取的次数优选为1～3次。提取完成后，本发明优选将所得提取液定容至50～200mL，经0.22μm滤膜过滤，得到银杏叶供试品溶液。

本发明提供银杏叶标准品溶液。本发明将芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯乙腈溶液、银杏内酯C、7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮及内标化合物异槲皮苷、银杏内酯J和穗花杉双黄酮的标准品溶于1mL色谱甲醇中，得到银杏叶标准品溶液。

本发明采用质谱电喷雾阴离子串联质谱多反应检测模式，以银杏叶标准品为模板化合物，在线优化质谱参数，预测得出银杏叶标准品的靶向离子对。在本发明中，所述质谱参数优选包括碎裂电压和碰撞能。本发明对所述在线优化质谱参数的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法进行在线优化即可。

本发明将所述银杏叶标准品溶液和银杏叶供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析检测，根据银杏叶活性成分含量的标准曲线，得到银杏叶供试品溶液中活性成分的含量；

其中，超高效液相色谱的检测条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的质量分数为0.1％；梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相A由12％增加至20％；0.5～6min，流动相A由20％增加至45％；6～12min,流动相A由45％增加至55％；12～13min，流动相A由55％增加至80％；13～15min，流动相A由80％降低至12％；

其中，质谱分析的检测条件为：

工作模式：负离子模式；扫描方式：多反应检测模式；喷射电压：3500V。

在本发明中，进行所述超高效液相色谱-质谱分析所用的仪器优选为超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪。在本发明中，所述超高效液相色谱仪优选为Agilent 1290；所述串联四级杆质谱联用仪优选为三重串联四极杆质谱仪Agilent 6460。

在本发明中，进行所述超高效液相色谱分析的色谱柱优选为Agilent EclipsePlus C18RRHD，所述色谱柱的尺寸优选为2.1mm×50mm，填料粒径优选为1.8μm。在本发明中，进行所述超高效液相色谱分析时的进样量优选为2μL；进行所述超高效液相色谱分析时的柱温优选为30～40℃，更优选为35℃。在本发明中，所述流动相的体积流量优选为0.2mL/min。

在本发明中，进行所述质谱分析的喷射电压优选为3500V；流速优选为10L/min；雾化器的压力优选为25psi；离子源温度优选为300℃。在进行所述质谱分析时，本发明优选在高纯氮气氛围下进行所述质谱分析。

本发明对于建立所述银杏叶活性成分含量的标准曲线的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中，建立所述银杏叶活性成分含量的标准曲线的方法优选为：将所述银杏叶标准品溶液进行超高效液相色谱-质谱分析，以不同浓度的银杏叶标准品的峰面积为纵坐标，以银杏叶标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析，建立银杏叶活性成分含量的标准曲线。本发明对所述不同浓度的银杏叶标准品的浓度梯度没有特殊的限定，选用本领域技术人员熟知的浓度梯度即可。

下面结合实施例对本发明提供的测定银杏叶中活性成分含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取银杏叶药材1g，加入100mL体积分数为50％的乙醇溶液，进行高速匀质(转速：15×1000rpm/min，时间1min)，超声60min提取1次，定容至100mL，经0.22μm滤膜过滤，得到银杏叶供试品溶液；

称取芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯乙腈溶液、银杏内酯C、7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮及内标化合物异槲皮苷、银杏内酯J、穗花杉双黄酮标准品1mg，溶于1mL色谱甲醇中，得到银杏叶标准品溶液；

采用质谱MRM检测模式，以银杏叶标准品为模板化合物，在线优化质谱参数，提前预测得出银杏叶标准品的靶向离子对，优化所得质谱参数见表1；

配制不同浓度的银杏叶标准品溶液，分别进行超高效液相色谱-质谱检测，每种浓度的银杏叶标准品溶液重复进行检测3次，以银杏叶标准品的峰面积为纵坐标，以银杏叶标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析，建立银杏叶活性成分含量的标准曲线；

分别吸取标准品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，根据银杏叶活性成分含量的标准曲线，分别计算芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯乙腈溶液、银杏内酯C、7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮和金松双黄酮的含量；

其中，色谱检测条件：AgilentEclipse Plus C18RRHD(2.1mm×50mm，1.8μm)，柱温35℃；流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的质量分数为0.1％；梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相A由12％增加至20％；0.5～6min，流动相A由20％增加至45％；6～12min,流动相A由45％增加至55％；12～13min，流动相A由55％增加至80％；13～15min，流动相A由80％降低至12％；体积流量0.2mL/min，进样量2μL。

质谱检测条件：负离子模式下工作，扫描方式为多反应检测模式，喷射电压3500V，离子源温度300℃，雾化器25psi，流速10L/min，在高纯氮气氛围下进行质谱检测。

表1实施例1在线优化得到的质谱参数

表2为本实施例银杏叶中三种活性成分的标准曲线方程，其中，检测信号高度为与基线噪音高度的比值(信噪比)为3:1即为检出限，比值10:1时为定量限。

表2实施例1银杏叶中三种活性成分的标准曲线方程、线性范围、定量

限和检出限

由表2可知，银杏叶中三种活性成分的含量在线性范围内具有良好的相关系数(R²≥0.99)，且该方法具有相对较低的检出限及定量限，充分证明该方法具有较高的灵敏性及准确性。

图1为实施例1在超高效液相色谱-质谱多反应检测模式下，银杏叶中银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的色谱图，其中，1:芦丁；2:异槲皮苷；3:山奈酚-3-O-芸香糖苷；4:异鼠李素-3-O-芸香糖苷；5:银杏内酯J；6:银杏内酯C；7:白果内酯；8:银杏内酯A；9:银杏内酯乙腈溶液；10:穗花杉双黄酮；11:7-去甲基银杏双黄酮；12:银杏双黄酮；13:异银杏双黄酮；14:金松双黄酮。

由图1可知，采用本发明的方法，能够同时测定银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的含量。

按照实施例1的条件，进行方法学验证：

1)精密度实验

按照常规方法，通过日内和日间精密度来衡量方法的精密度。

配制银杏叶待测样品溶液，按照实施例1所述色谱条件和质谱条件进行测定，分别在24h之内连续重复进样6次，连续72h内每天连续重复进样3次，通过其对应的峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)进行计算，结果见表3。

由表3可知，银杏叶待测样品的日内和日间的峰面积和保留时间的相对标准偏差(R.S.D)范围为0.37～4.80％，均小于5％，证明该方法具有良好的精密度。

2)重现性实验

将配制好的芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯乙腈溶液、银杏内酯C、7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮的混合标准溶液分别连续重复进样6次，然后分别对上述6次的峰面积和保留时间的相对标准偏差(R.S.D)进行计算，结果见表3。

结果表明，银杏叶3中活性成分的峰面积和保留时间的相对标准偏差(R.S.D)范围为1.27～4.48％，均不超过5％，证明该方法具有良好重现性。

3)稳定性实验

配制银杏叶待测样品溶液，以每48h为一个周期，每6h进样一次，并对其峰面积和保留时间的相对标准偏差(R.S.D)进行计算，结果见表3。

结果表明，银杏叶待测样品的相对标准偏差(R.S.D)范围为0.42～4.32％，均不超过5％，证明该方法具有良好的稳定性。

4)加样回收率实验

通过在待测样品溶液中加入混合标准品进行回收率实验。

取两种浓度的银杏叶标准品溶液分别加入银杏叶待测样品溶液中，每个浓度3份，在色谱条件下，按下列公式分别计算银杏叶样品平均回收率及相对标准偏差(R.S.D)，结果见表3。

加样回收率＝(C₁-C₂)/M×100％，其中，C₁为测得的目标成分总量，C₂为银杏叶样品中目标成分的量，M为加入的银杏叶标准品量。

结果表明，银杏叶待测样品的加样回收率在99.10％～107.20％之间，证明该方法具有较好的回收率。

表3实施例1银杏叶三种活性成分的精密度、重现性、稳定性及加样回

收率结果

由以上实施例可知，本发明运用超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阴离子串联质谱多反应检测(MRM)模式，快速在线优化包括碎裂电压以及碰撞能在内的质谱参数，使之形成高强度的靶向离子对，通过此系列特征性的靶向离子对，从而达到对银杏叶药材中的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分的快速定性和定量分析；本发明的检测方法操作简单，具有高灵敏度和精密度、重现性好、稳定性高、回收率好，可实现同时测定银杏叶中所含的银杏内酯、黄酮醇苷及双黄酮3类活性成分，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，能准确、全面地控制银杏叶药材的质量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种测定银杏叶中活性成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供银杏叶供试品溶液；提供银杏叶标准品溶液；

将芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、7-去甲基银杏双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮及内标化合物异槲皮苷、银杏内酯J和穗花杉双黄酮的标准品溶于1mL色谱甲醇中，得到银杏叶标准品溶液；

采用质谱电喷雾阴离子串联质谱多反应监测模式，以银杏叶标准品为模板化合物，在线优化质谱参数，预测得出银杏叶标准品的靶向离子对；

将所述银杏叶标准品溶液和银杏叶供试品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱分析，根据银杏叶活性成分含量的标准曲线，得到银杏叶供试品溶液中活性成分的含量；

其中，超高效液相色谱分析的检测条件为：

流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈，流动相B为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的质量分数为0.1％；梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相A由12％增加至20％；0.5～6min，流动相A由20％增加至45％；6～12min，流动相A由45％增加至55％；12～13min，流动相A由55％增加至80％；13～15min，流动相A由80％降低至12％；所述流动相的体积流量为0.2mL/min；

其中，质谱分析的检测条件为：

工作模式：负离子模式；扫描方式：多反应监测模式；

进行所述质谱分析的喷射电压为3500V；

进行所述质谱分析的流速为10L/min；

进行所述质谱分析时，雾化器的压力为25psi；

进行所述质谱分析的离子源温度为300℃；

进行所述超高效液相色谱分析的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，所述色谱柱的尺寸为2.1mm×50mm，填料粒径为1.8μm；

进行所述超高效液相色谱分析时的柱温为35℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述超高效液相色谱-质谱分析所用的仪器为超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述超高效液相色谱分析时的进样量为2μL。

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