CN109073562A - 用于检测醛的方法、系统和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于检测和定量各种样品类型中含羰基部分的方法、系统和试剂。从样品中捕获含羰基部分到检测含羰基部分所经过的时间少于约2小时。本公开提供了便于标记和检测含羰基部分的化合物。
Description
相关申请的交叉引用
本专利合作条约专利申请要求2016年2月18日提交的,发明名称为“呼吸分析系统”的美国临时申请号62/296,947的优先权,其全部内容通过引用并入本申请。
技术领域
本公开内容涉及羰基检测和定量领域,尤其涉及生物样品中含羰基部分的检测和定量。
背景技术
氧化应激指示了活性氧物质的产生与机体对反应性化合物解毒能力之间的不平衡。通常将氧化应激定义为氧化与还原(抗氧化)过程之间的病理生理性失衡(或者氧化剂>抗氧化剂)。当失衡超出细胞修复机制时,氧化损伤发生累积。活性氧物质水平升高与心血管、肺、自身免疫、神经、炎症、结缔组织疾病和癌症多种疾病的发病机制有关。氧化应激导致组织损伤,据报道其与糖尿病、听力丧失、血管疾病、神经疾病、肾脏疾病等有关。推荐在膳食中使用抗氧化剂以对抗和预防多种疾病,并且其有益于身体健康和生活幸福。
测定个体或患者群体中的氧化应激水平可能是有需要的,但是对鉴定和测定与氧化应激相关分子的尝试通常与侵入性技术相关,包括抽血、采集尿样和组织样品。此外,与氧化应激相关的活性氧分子具有极高的反应性,并且在体内和体外具有很短的半衰期,这使得直接测定非常困难和不准确。在这一点上,尚无可用的对氧化应激状态方便的和容易的测定方法。
由于缺乏用于鉴定具有氧化应激的个体或患者群体的有效方法和装置,因此需要推进该行业以改善人类健康。
发明内容
本申请提供了用于检测样品中存在的至少一种含羰基部分的方法。所述方法包括下述步骤:将所述样品暴露于基质以捕获所述含羰基部分;从所述基质上洗脱所述含羰基部分;将所述含羰基部分与反应性标记试剂混合;将标记的含羰基部分上样至柱上;使用有机溶剂从所述柱上洗脱所述标记的含羰基部分;以及检测所述标记的含羰基部分。在一些方面中,所述检测方法在少于约2小时内完成。在一些实施方式中,所述方法还包括测定所述至少一种含羰基部分的浓度。
本申请提供了用于检测样品中存在的至少一种醛的方法。所述方法包括下述步骤:将所述样品暴露于基质以捕获所述醛;从所述基质上洗脱所述醛;将所述醛与反应性标记试剂混合;将标记的醛上样至柱上;使用有机溶剂从所述柱上洗脱所述标记的醛;以及检测所述标记的醛。在一些方面中,所述检测方法在少于约2小时内完成。在一些实施方式中,所述方法还包括测定所述至少一种醛的浓度。
本申请提供了检测气体样品中含羰基部分的方法。所述方法包括:从样品中分离所述含羰基部分;将所述含羰基部分与反应性标记试剂混合,其中所述含羰基部分与所述反应性标记试剂结合;使标记的含羰基部分通过柱;激发脱离所述柱的所述标记的含羰基部分;以及通过测定由与所述含羰基部分结合的所述反应性标记试剂发射或吸收的荧光以检测所述含羰基部分。在一些方面中,所述洗脱步骤基于碳链长度分辨所述含羰基部分。在一些方面中,从所述样品中分离所述含羰基部分到检测所述含羰基部分所经过的时间少于约2小时。
本申请提供了包含荧光团、接头和反应性基团的化合物。在一些实施方式中,所述荧光团选自下组:ao-5-TAMRA、ao-6-TAMRA及其混合物。在一些实施方式中,所述接头选自下组:己酸、氨基己酸、尸胺(cadavarine)、聚乙二醇和聚甘醇。在一些实施方式中,所述反应性基团选自下组:肼部分、碳酰肼部分、羟胺部分、半咔唑部分、氨氧基部分和酰肼部分。
本申请提供了用于检测样品中存在的至少一种含羰基部分的系统。所述系统包括:捕获所述含羰基部分的基质;用于从所述基质上洗脱所述含羰基部分的试剂;用于将所述含羰基部分与反应性标记试剂结合的试剂;用于分辨标记的含羰基部分的柱;用于将所述标记的含羰基部分从所述柱上洗脱的溶剂;以及用于产生荧光激发、吸收和/或发射以检测所述标记的含羰基部分的光和检测器。在一些方面中,所述系统在少于约2小时内完成一个循环。在一些实施方式中,所述系统还包括用于测定所述至少一种含羰基部分的浓度的标准品。
附图说明
图1显示了一种系统,其中用选择性反应性荧光团对靶分子进行标记并将其分离以使得能够鉴定链长度相差1个碳的各个醛。
图2显示了包含染料、接头和反应性基团的示例性反应性标记试剂。
图3提供了根据本申请提供的方法修饰的ao-5-TAMRA和ao-6-TAMRA的结构,以产生包含接头和附着至荧光团的反应性基团的反应性标记试剂。
图4提供了包含ao-6-TAMRA的反应性标记试剂的合成示意图。
图5显示了在反应性标记试剂中使用接头(例如,PEG)的益处。
图6显示了在不存在催化剂以及室温条件下,作为pH函数的反应速率。
图7显示了使用催化剂、5-MAA或3,5-DABA对反应速率的影响。
图8显示了具有反应性和非反应性内标物的系列稀释的ao-6-TAMRA-标记的醛混合物的荧光色谱图。
图9提供了显示能够按组分离醛的SPE分离分析。图9进一步显示了使用不同有机溶剂或不同浓度的溶剂能够分离密切相关的分子。
图10比较了在两个不同长度30mm和50mm的10μm半制备保护柱上分离醛的两个色谱图。
图11比较了两个色谱图,上图基于含有参比C3-C10醛的样品,下图基于呼吸样品。上图:含有由荧光团和C3-C10醛形成的产物的样品作为参比。下图:与标准品比较以验证产物分配的呼吸样品。标记:6.8μM 6-ao-TAMRA,3mM 5-MAA,70mM柠檬酸盐,pH 4.2,40%MeOH。收集使用10L TEDLAR袋,捕获使用300mg CUCIL二氧化硅,洗脱使用1.26mL,40%MeOH。在室温下孵育15min。分离:4.6mm X 50mm,10μm C18phenomenex,45-100%MeOH。检测:Agilent 1100Fl检测器G1321。
图12显示了使用具有不同设计的装置获得的两个色谱图。装置检测器1:90度几何形状,532nm激发,20mw激光,流动池:1mm ID Tefzel塑料管,2mm掩模(狭缝),采集25.4mm柱面透镜,LP滤光片semrock 561nm,光纤600μm核心,USB-2000CCD检测器(海洋光学)带通560-610nm,信号积分时间100msec,矩形窗5,扫描20,50飞摩尔C6。装置检测器2:90度几何形状,532激发,20mw激光,池500μm毛细管(Polymicro TSP500794),15mm聚焦透镜,分光镜,16mm采集透镜,LP滤光片omega550nm,USB-2000CCD检测器(海洋光学)带通560-610nm,信号积分时间100msec,矩形窗5,扫描20。1飞摩尔每种标记有ao-6-TAMRA的C4-C10醛。
图13显示了标记试剂的反应性。
图14显示了使用包含ao-5,6-TAMRA异构体混合物的反应性标记试剂标记的醛的色谱图。
图15比较了使用包含ao-5-TAMRA或ao-6-TAMRA的反应性标记试剂标记的醛的两个色谱图。
图16显示了作为温度和时间函数的标记效率。
图17显示了催化剂对反应速率的影响。无催化剂且分析物浓度较低时,标记反应缓慢。在存在催化剂时,反应速率可提高10倍。反应条件为反应性标记试剂(包含
ao-5,6-TAMRA):己醛为1:1.2,5-MMA的摩尔比为1、100和1000;6.5mM柠檬酸盐,pH4.16,室温。
图18提供了使用相等浓度的醛系列稀释液的检测限(LOD)曲线。向系列稀释的每个样品中加入恒定浓度的反应性(C12醛)和非反应性(C16酰胺)内标物。将反应物孵育15分钟,然后淬灭。通过HPLC在标准条件下分析混合物,4x20mm,5μm,C18柱。
图19提供了将呼吸样品与标准样品进行比较的色谱图,其中反应性标记试剂包含ao-6-TAMRA。使用峰高,C3-C10总和的估计值为约80pmole/L或2.2ppb。估计C4-C10的总和为48pmole/L或1.2ppb。标记:6.8μM 6-ao-TAMRA,3mM 5-MAA,70mM柠檬酸盐,pH 4.2 40%MeOH,收集使用10L TEDLAR袋,捕获使用300mg CUCIL二氧化硅,洗脱使用1.26mL 40%MeOH。在室温下孵育15min。分离:4.6mm X 50mm,10μm C18phenomenex,45-100%MeOH。检测:装置检测器1(见图12)。
图20显示了作为包含ao-6-TAMRA的反应性标记试剂浓度函数的标记反应。反应性标记试剂的浓度在0.5μM至20μM范围内变化。在约10μM时观察到最大信号。
除了图12和19以外,所有色谱图的数据均使用配备有二极管阵列和荧光检测的Agilent(Hewitt-Packard)Model 1100HPLC系统采集。对于TAMRA,激发波长为550nm(带宽20nm,即540-560nm)和发射波长为580nm(带宽20nm,即570-590nm)。典型的分离方法,流动相甲醇,10mM TEAA pH 7水溶液。线性梯度45%至100%甲醇,流速1ml/min。
具体实施方式
本申请提供的描述、实验和附图是说明性的,并不被解释为限制性的。描述了许多具体细节以实现对本公开的透彻理解。然而,在某些情况中,未描述熟知或常规细节以避免模糊该描述。本公开内容中对一个或另一个实施方式的指代可以是,但不一定是,对相同实施方式的指代;并且,此类指代意指实施方式中的至少一个。
本说明书中对“一个实施方式”或“实施方式”的指代意指与实施方式结合描述的特定特性、结构或特征包括在本公开的至少一个实施方式中。在说明书的各处中出现的短语“在一个实施方式中”不一定是指同一实施方式,也不一定是与其他实施方式互斥的单独或替代的实施方式。而且,描述了可以由一些实施方式而不是由其他实施方式呈现的各种特征。类似地,描述了各种要求,这些要求可能是一些实施方式的要求而不是其他实施方式的要求。
在本公开的上下文中以及在各术语使用的具体上下文中,在本说明书中使用的术语一般具有其在本领域中的通常含义。在下文或本说明书的其他地方讨论了用于描述本公开内容的某些术语,以便为从业人员提供关于本公开内容描述的额外指导。为方便起见,可以突出显示某些术语,例如使用斜体和/或引号标记。使用突出显示对术语的范围和含义不具有影响;在相同上下文中无论术语是否被突出显示,其范围和含义是相同的。应当意识到的是,可以以不止一种方式描述同样的事情。
因此,替代语言和同义词可用于本申请讨论的任何一个或多个术语。无论在本申请中是否对术语进行详细阐述或讨论,均不会赋予该术语任何特殊的重要性。本申请提供了某些术语的同义词。叙述一个或多个同义词不排除使用其他同义词。在包括任何本申请讨论的术语示例的本说明书中的任何地方对实施例的使用仅是说明性的,并且不旨在进一步限制本公开或任何示例性术语的范围和含义。同样地,本公开内容不限于本说明书中给出的各种实施方式。
并非旨在进一步限制本公开内容的范围,下面给出根据本公开内容的实施方式的方法、系统、试剂和化合物的实例。值得注意的是,为了方便读者,可以在实例中使用标题或副标题,这绝不应限制本公开内容的范围。除非另有定义,否则本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。在发生冲突的情况下,将以本文件(包括定义)为准。
本申请提供了用于检测、定量和测定包括醛、酮和羧酸的含羰基部分(“CCM”)的方法、系统、试剂和化合物。CCM是具有至少一个羰基的化合物。羰基是二价基团>C=O,其存在于多种化合物中。该基团由与氧原子双键连接的碳原子组成。羰基官能团最常见于三大类有机化合物中:醛、酮和羧酸。可以预期的是,本申请所公开的方法、试剂和系统可用于分辨、检测和定量CCM混合物。
本申请提供的方法、试剂、化合物和系统用于检测各种样品中醛的存在情况和/或浓度。示例性的醛包括但不限于1-己醛、丙二醛、4-羟基壬醛、乙醛、1-丙醛、2-甲基丙醛、2,2-二甲基丙醛、1-丁醛和1-戊醛。示例性的醛包括C1醛、C2醛、C3醛、C4醛、C5醛、C6醛、C7醛、C8醛、C9醛、C10醛、C11醛、C12醛和C13醛。示例性的醛包括脂肪醛、二醛和芳香醛。可以预期的是,本申请所公开的方法、试剂和系统可用于分辨、检测和定量醛的混合物。在一些实施方式中,样品包含具有不同碳链长度的两种或多种醛,以及洗脱所述标记的醛的步骤基于碳链长度分辨每种醛。
本申请提供的方法、试剂、化合物和系统在多种应用中具有广泛的用途,其中指示CCM(如醛、酮或羧酸)的存在情况和/或估计其浓度是有用的。
如在本申请中所使用的,术语“醛”旨在指可以化学表征为含有一个或多个醛官能团的任何化合物。在一些实施方式中,将进行合格/失败类型指示,以表明存在某些最低浓度的特定的醛或醛的基团。在一些实施方式中,对浓度进行估计。设计不同实施方式以特别地针对特定的醛、目标醛的基团或样品中所有的醛。
说明性地,本申请提供的方法和系统可以具体地测定生物样品(呼吸物、尿液、血液、唾液、其他)或环境样品(水、空气等)中丙二醛(具有两个醛官能团的不饱和分子)的存在情况和/或浓度。检测生物样品中的醛可用于指示生物中的氧化应激情况。在一些实施方式中,本申请提供的方法、试剂、化合物和系统用于测定含有一个或多个醛基的其他各种化合物,包括饱和的和/或不饱和的分子,将其作为各种疾病和病症的生物标记物。在人体呼吸物中的醛浓度可以作为用于筛选肺癌存在情况的生物标记物。
其他实施方式包括可用于食品和农业相关检测的应用。油的氧化对油性食品的质量有重要影响。这种氧化产生醛,包括不饱和的醛2-庚烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2-十一烯醛和2,4-癸二烯醛,和/或这些化合物的反式分子。类似地,鱼和海鲜中的甲醛和乙醛水平能够提示其质量。食物中存在的脂质与氧和其他物质反应产生醛,并且脂质氧化水平(以及因此产生的醛浓度)能够提示食品质量。其他应用包括环境及其他应用,其中在气体或液体中存在的醛能够提示气体或液体的质量或其污染情况。
可以对醛进行检测和/或定量以提供受试者(例如,患者)一般健康情况方面的信息。在一些实施方式中,该信息可以提示患者的氧化应激水平。在一些实施方式中,可以对醛进行测定或分析以辅助对患者的医学诊断。例如,可以对呼吸物(或尿液、血液、血浆或培养的活检细胞顶空)中的醛进行取样以确定患者的总体健康情况和/或患者是否患有某些医学病症。醛取样可以提示患者是否患有癌症,例如,食管癌和/或胃腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、头癌、颈癌、膀胱癌或胰腺癌,可以提示患者是否患有肺部疾病(包括哮喘、急性呼吸窘迫综合征、肺结核、COPD/肺气肿、囊性纤维化等)、神经退行性疾病、心血管疾病,或处于急性心血管事件、感染性疾病(包括结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、烟曲霉等)、胃肠道感染(包括空肠弯曲杆菌、艰难梭菌、幽门螺旋杆菌等)、尿路感染、鼻窦炎以及其他病症的风险中。醛取样还可以提示特定疾病或病症的严重程度或分期。
本申请提供了用于检测和定量包括醛、酮和羧酸在内的CCM的试剂、化合物、系统和方法。说明性地,对于氧化应激和氧化生物过程相关的脂质过氧化反应的副产物烷基醛的检测和定量能够告知护理人员或执业医师受试者的氧化应激状态。本公开内容令人感兴趣的特征包括对所需靶点(例如,CCM,如醛)进行选择性反应性的“涂色”,并对标记的靶点进行特异性分离和检测(见图1)。
根据一个实施方式,提供了一种方法和系统,包括将样品暴露于基质以捕获醛;从所述基质上洗脱所述醛;将所述醛与反应性标记试剂混合;对所需的标记的醛进行分离、检测和可选地定量。该过程足够迅速以提供现场测定和结果报告。例如,在一些实施方式中,从捕获所述醛到检测所述醛的过程能够在少于约2小时、或少于约1.5小时、或少于约75分钟、或少于约1小时内完成。
样品来源
如在本申请中所使用的,“生物样品”以其最广泛的含义被指代,并且包括固体、气体和液体或从自然界获得的任何生物样品,包括个体、体液、细胞系、组织培养物或任何其他来源。如所指出的,生物样品包括体液或气体,如呼吸物、血液、精液、淋巴液、血清、血浆、尿液、滑液、脊髓液、痰、脓、汗,以及来自环境的气体或液体样品,如植物提取物、池塘水等。固体样品可以包括动物或植物体部分,包括但不限于毛发、指甲、叶子等。用于本申请提供的一个实施方式的生物样品是人类呼吸物。
尽管可以将本申请提供的方法、试剂、化合物和系统用于各种样品类型,但是在医学用途的背景下,呼吸物分析代表替代血清生化检测的有前景的无创检测。具有相对较低分子量的挥发性有机化合物(VOC)的概况反映了由病理生理过程和代谢改变导致的显著且立即的变化。呼吸物中VOC的外观和数量的变化反映了代谢和疾病状态的改变。本申请提供了通过呼出气体对疾病进行检测和区分的方法和系统。
说明性的方法和系统
本申请提供了一种用于定量氧化应激状态的无创系统。通常将氧化应激定义为氧化与还原(抗氧化)过程之间的病理生理性失衡(或者氧化剂>抗氧化剂)。当这种失衡超出细胞修复机制时,氧化损伤发生累积。活性氧物质水平升高与心血管、肺、自身免疫、神经、炎症、结缔组织疾病和癌症多种疾病的发病机制有关。然而,在呼吸物和其他生物样品中的脂质氧化副产物的含量极低,其超出了常规装置和方法的检测限。此外,这些相同的副产物随着时间的推移在样品中不稳定,并且由于在分析之前或分析过程中的降解,使得对此类分子进行鉴定或定量的尝试是不成功的。
本申请提供了用于测定氧化应激的方法、试剂和系统。在一些实施方式中,所述方法和系统检测和/或定量脂质氧化副产物,例如,烷基醛和酮。在一些实施方式中,测定呼出气体样品中的这些副产物。所述方法包括选择性反应性地“涂色”所需靶点的化学类别,并对“涂色”或标记靶点的“所需”亚类进行特异性分离和检测。
在一些实施方式中,提供了用于鉴定和/或检测样品中的醛的方法,所述方法包括提供用于捕获生物样品的装置,其中所述装置包括用于捕获醛的基质,包括用于标记醛的反应性标记试剂,包括用于分离醛类的柱子,包括用于诱发荧光的光,以及包括用于测定荧光发射、激发或吸收的检测器。
在一些实施方式中,所述装置接收来自受试者的含有醛的呼吸样品,将样品沉积在基质上,对样品进行洗脱过程以捕获醛,将醛与反应性标记试剂混合和孵育,分离和测定所述标记的醛,以及呈现测定结果。
在一些实施方式中,提供了用于鉴定和/或测定CCM(如醛、酮或羧酸)的方法。在一些实施方式中,所述反应性标记试剂附着在样品中存在的醛上,除去样品中的其余组分以及未结合的反应性标记试剂。在一些实施方式中,可以使用反相基质或堆叠基质以分离标记的醛用于测定。
在一些方面中,所述方法可以包括从基质上的生物样品中捕获醛,从所述基质上洗脱所述醛,以及标记所述醛。在一些方面中,所述方法可以包括从基质上的生物样品中捕获醛,标记所捕获的醛,以及洗脱所标记的醛。在一些方面中,将所述基质与所述反应性标记试剂结合。
在一些实施方式中,所述装置包括荧光检测组件,其包括发射器、检测器、光室、荧光室和井、从发射器延伸通过光室并穿过井的光路,以及从井延伸通过荧光室并到达检测器的荧光光路。
在一些实施方式中,检测荧光的方法包括激发含有荧光标记的含羰基部分的溶液。所述光通过所述溶液并激发荧光标记的部分以产生荧光,以及检测荧光吸收或发射。
在一些实施方式中,检测和定量呼吸物中含羰基部分的方法包括(a)获得生物样品,(b)从基质上的样品中捕获含羰基部分,(c)标记含羰基部分以提供标记溶液,(d)将预定波长范围内的光引导通过标记溶液,从而产生荧光,以及(e)检测所述荧光。
在一些实施方式中,标记步骤(c)包括将(i)CCM与(ii)缓冲剂混合,然后加入(iii)催化剂,以及最后加入(iv)反应性标记试剂。在一些实施方式中,(ii)缓冲剂可以存在于洗脱溶液中,使得(ii)缓冲剂与(i)含羰基部分一起存在于溶液中。在一些实施方式中,在加入催化剂以前,将内标物加入溶液中。最后加入催化剂和反应性标记试剂能够有助于防止预孵育和丧失反应性。
因此,本申请提供了包含从样品中捕获的CCM(如醛)、缓冲剂和催化剂的组合物。在一些实施方式中,所述组合物还包含反应性标记试剂。在一些实施方式中,所述组合物还包含至少一种非反应性内标物。在一些实施方式中,所述组合物还包含至少一种反应性内标物。在一些实施方式中,所述组合物基本上由从样品中捕获的CCM(如醛)、缓冲剂、催化剂、反应性标记试剂和任选地至少一种内标物组成。
可以理解的是,可以使用该系统对任何生物样品进行分析。可以根据需要捕获和分析CCM或醛以外的呼吸成分。美国专利公开号2003/0208133和2011/0003395的全部内容通过引用并入本申请。
靶向捕获
本申请提供的系统和方法是适用于检测CCM的“实时”测定形式,并且通过引入初级捕获(在基质上)和释放(从负载的基质上洗脱)过程能够用于检测溶液中的CCM,和/或检测气相中痕量的CCM。在该过程的一个步骤中,将来自人类呼吸物中的气相CCM(例如,醛)捕获到基质上。
预计可以用于本申请的捕获基质理想地由固体但不一定是刚性材料形成。所述固体基质可由各种材料的任意一种形成,如薄膜、纸张、非织造网、针织物、机织物、泡沫、玻璃等。例如,用于形成固体基质的材料可以包括但不限于天然的、合成的或经合成修饰的天然存在的材料,如多糖(例如,纤维素材料(如纸张)和纤维素衍生物(如醋酸纤维素和硝酸纤维素));聚醚砜;聚乙烯;尼龙;聚偏二氟乙烯(PVDF);聚酯;聚丙烯;二氧化硅;无机材料,如钝化氧化铝、硅藻土、MgSO4、或在多孔基质中均匀分散的其他无机细碎材料,聚合物(如氯乙烯、氯乙烯丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物);布,天然存在的(例如,棉)和合成的(例如,尼龙或人造丝);多孔凝胶,如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶;聚合物膜,如聚丙烯酰胺等等。在一些方面中,所述基质是任选地在筛板之间隔开的二氧化硅固相基质。选择基质的尺寸,使得由该基质捕获可测定量的CCM。该尺寸可以改变,但一般而言其为约2mL,或约1mL,或约0.25mL。
基质通常由具有50-60埃孔的颗粒床构成,所述颗粒床具有50-270目(300-50μm)和75-300mg的质量,或者60-120目(250-125μm)和100-200mg的质量,或者50-120目(210-125μm)和125-300mg的质量,或者200-325目(80-44μm)和75-500mg的质量。
基质捕获的CCM的量可以改变,但是通常对于由200mg 50-270目(300-500μm)颗粒构成的床直径为12.5mm的基质而言,在通常情况下,其将等于吹入像呼气测醉器一样的管子后人的呼吸量。在一些方面中,其将为75至0.1ppb(400至4皮摩尔)或20ppb至0.01ppb(80至0.4皮摩尔)。
在通常情况下,来自捕获基质的捕获醛的洗脱溶液包含缓冲剂和/或有机溶剂。所述有机溶剂可以包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和/或乙腈,以及可以以约34%至50%,或者约35%、约38%、约40%、约45%等的量存在。缓冲剂的浓度范围可以是从10mM至100mM。在一些实施方式中,使用表面活性剂代替溶剂。
可以任选地包含盐,并且可以是不会对荧光溶液产生负面影响并控制洗脱溶液中盐析效应的任何盐。本申请涉及的盐可以包括NaCl、LiCl、KCl、硫酸盐和磷酸盐以及其混合物。盐的浓度范围可以是从5mM至100mM。
使用缓冲剂使洗脱溶液维持弱酸性,并且在pH 2和6之间,或者约2.5、或者约4、或者约4.2。所述缓冲剂可以是HCl、硼酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、醋酸/醋酸盐和柠檬酸盐/磷酸盐。
用于实施本申请提供的方法的温度范围可以是从15至35℃,例如,从25至30℃。
标记和分离过程和系统
在该过程中,使用对羰基具有选择性的反应性荧光“涂料”对靶点,醛和酮,进行标记。
标记有两个目的:1)将“透明”的烷基醛靶点转化为能够通过吸收或荧光发射检测进行观察和定量的物质和2)使得所需靶点能够并增强选择性分离。
标记和分离基质提供了本申请提供的实施方式中有用的反应性、信号和分离性质的组合,并且提供了分辨和鉴定链长相差一个碳的单个醛的能力。
在一些实施方式中,可以使用通常在SPE柱中发现的低分辨率60-200μm的颗粒将标记的醛类分离成“大量”类。在这个实施方式中,可以大量分离和检测相似链长的醛组(即,C1-C3、C5-C10),以实现对选定醛组的快速分析。
可以使用正相、反相和HILIC分离方法将标记的醛大量分离或作为单一种类分离。在本申请所述的反相方法中,通过疏水性吸引将标记的靶点分离到分离基质(基底)上,C2-C18。标记靶点的疏水性越强越容易保留,并且使用有机物含量更高的洗脱溶液洗脱。游离的未反应的标记具有更高的极性,使用适当选择的初始条件能够首先被洗脱;游离的标记和更小的醛能够自由通过分离基质。对于HILIC分离,吸引机制被逆转,疏水性越强的标记靶点越早洗脱,而疏水性越差、越小的醛和游离的染料保留时间越长。在一些实施方式中,对标记试剂、靶点、分离基质和分离条件(溶剂、pH、缓冲剂(离子对试剂))进行仔细的选择和匹配可能是有用的。
本申请提供了用于检测样品中存在的至少一种含羰基部分的系统。所述系统包括:捕获所述含羰基部分的基质;用于从所述基质上洗脱所述含羰基部分的试剂;用于将所述含羰基部分与反应性标记试剂结合的试剂;用于分辨标记的含羰基部分的柱;用于将所述标记的含羰基部分从所述柱上洗脱的溶剂;以及用于产生荧光激发、吸收和/或发射以检测所述标记的含羰基部分的光和检测器。在一些方面中,所述系统在少于约2小时内完成一个循环。在一些实施方式中,所述系统还包括用于测定所述至少一种含羰基部分的浓度的标准品。
反应性标记试剂
构建示例性的反应性标记试剂以提供选择性和快速标记以及单碳分离(图2)。一种包含ao-6-TAMRA和尸胺(cadavarine)的示例性反应性标记试剂提供了对羰基(醛的反应性>>酮)的快速和选择性的偶联(图2、3和4)。所得到的肟键比用肼和酰肼化学反应形成的互补腙键更稳定,所述腙键需要还原成具有增加的稳定性的仲胺连接键。由于重新平衡,因而腙受到干扰。
反应性标记试剂包括三个方面,其针对给定的应用不同而发生变化。母体荧光团(例如,TAMRA)限定了检测模式和主要分离机制。接头调节分离机制和量子产率。例如,用极性更强的水溶性聚乙烯(PEG)接头替代二胺烷基接头导致在反相疏水性分离中的保留更少。由于与烷基二胺接头相比PEG接头对分离基质的亲和性较低导致谱带变宽,因此PEG接头限制了能够上样的体积(图5)。最后一个要素,反应性基团调节特异性、速率和标记稳定性。
通常,反应性标记试剂能够选择性地和有效地(快速地)标记靶羰基,能够提供与未反应试剂的大量和单独分离,以及能够为光谱检测提供足够的检测特性。
可以改变反应性标记试剂的上述三个结构方面以便在改变溶剂、反应时间和温度、以及柱长时提供标记选项。
荧光团能够影响靶羰基的检测和分离。
接头能够影响分离机制和量子产率。
反应性基团能够影响特异性、反应速率和标记稳定性。
因此,在一些实施方式中,所述反应性标记试剂包含荧光团、接头和反应性基团。
在一些实施方式中,所述荧光团是四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明X(ROX)、罗丹明6G(R6G)或罗丹明110(R110)。在一些实施方式中,所述荧光团是氨氧基5(6)TAMRA,或氨氧基5TAMRA,或氨氧基6TAMRA。在一些实施方式中,所述荧光团是荧光肼或氨氧基化合物。
在一些实施方式中,所述标记反应对羰基官能团具有选择性:醛和酮,对醛的反应性远大于酮(醛>>酮)。反应形成稳定的肟键。肼和酰肼反应性基团也提供对羰基的选择性标记。
荧光团、TAMRA异构体、接头和反应性基团的性质能够调节反应性标记试剂的反应性以及分离性质。然而,可以对该反应和分离过程的其他方面进行调节以达到所需的反应速率和效率,包括,例如,缓冲剂(pH)、催化剂、荧光团浓度或有机溶剂。参见图13。
反应性标记试剂可以包含根据本申请提供的描述修饰的ao-TAMRA异构体的混合物:例如ao-5-TAMRA和ao-6-TAMRA。使用这两种异构体的示例性反应性标记试剂参见图3。可以根据所使用的合成和纯化方法来改变该混合物中异构体的比例。使用混合的异构体配方产生复杂的色谱图:每种醛两个条带,每个异构体一个条带。尽管对溶剂系统或柱特征的改进能够减少异构体分离而能够对醛进行分辨,但是由于异构体重叠使得对各醛之间的分辨可能更加困难。见图14。使用单一异构体配方产生的色谱图不如混合异构体配方的复杂。含有ao-6-TAMRA异构体的反应性标记试剂在该方法中保留较少,与含有ao-5-TAMRA异构体的反应性标记试剂相比(多于15分钟),需要更短的运行时间(少于15分钟)和能够更好地分辨长链醛。见图15。
含有氨氧基-5(6)-TAMRA的反应性标记试剂能够在温和条件下与醛或酮反应形成稳定的肟化合物。见图2和13。
可以改变反应性标记试剂的浓度以达到所需的荧光。在一项实验中,所述反应性标记试剂的浓度在从0.5μM至20μM范围内变化,并且在约10μM时观察到最大信号。见图20。
接头和反应性基团
如前所述,接头能够影响分离机制和量子产率。例如,用极性更强的水溶性聚乙二醇(PEG)接头替代二胺烷基接头能够导致反相疏水性分离中保留更少。说明性地,含有ao-PEG-5-TAMRA的反应性标记试剂在反相色谱上的保留少于包含具有疏水性接头的ao-TAMRA的相应反应性标记试剂:分别为6min对11min(初始40%甲醇)。
尽管使用5%至100%的甲醇梯度能够实现充分分离,但是由于与烷基二胺接头相比PEG接头对分离基质的亲和性较低导致谱带变宽,PEG接头限制了在反相柱上能够上样的体积。当进样体积由10μL增至100μL时,能够观察到明显的谱带扩散。见图5。
进样量中包含ao-6-TAMRA的反应性标记试剂可以是10至900μM,并且其仍然能够提供适宜的分离和最小至无谱带变宽。见图5。
示例性的接头包括取代的烷基-二胺(C2-C10)、取代的氨基-羧酸(C2-C10)和取代的聚乙二醇(N=1-10)。在一些实施方式中,所述接头选自下组:己酸、氨基己酸、尸胺(cadavarine)、聚乙二醇和聚甘醇。
反应性基团提供特异性、反应速率和标记稳定性。例如,氨氧基反应性基团提供与羰基官能团快速形成的稳定的肟键。在环境室温下该反应在60分钟内呈现出>90%的转化率,相比之下,酰肼偶联可能需要数小时至过夜以完成类似的转化。在升高的温度下,初始速率可能加快(在40℃下为2X)。该反应显示出在pH 5和pH 2.4之间具有增加的反应速率的pH曲线。见图6。在pH 4.2时的速率约为pH 7时速率的10X。
在一些实施方式中,所述反应性基团可以选自下组:肼部分、碳酰肼部分、羟胺部分、半咔唑部分、氨氧基部分和酰肼部分。
化合物
本申请提供了包含荧光团、接头和反应性基团的化合物。在一些实施方式中,所述荧光团是TAMRA、是氨氧基-5-TAMRA、是氨氧基-6-TAMRA、或者是氨氧基-5-TAMRA和氨氧基-6-TAMRA的混合物。在一些实施方式中,所述接头选自下组:己酸、氨基己酸、尸胺(cadavarine)、聚乙二醇和聚甘醇。在一些实施方式中,所述反应性基团选自下组:肼部分、碳酰肼部分、羟胺部分、半咔唑部分、氨氧基部分和酰肼部分。
在一些实施方式中,所述化合物选自下组:
及其混合物。
催化剂和其他反应条件
可以通过加入芳香胺化合物如3,5二胺苯甲酸(3,5DABA)和5-甲氧基邻氨基苯甲酸(2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸)(5-MAA)进一步增加反应速率。见图7。与不使用催化剂相比,反应速率增加大于10倍。3,5-DABA在所需pH下具有有限的溶解度,且在所使用的条件下被迅速氧化,但是其可以在适当的情况下使用。使用催化剂、5-MAA以及酸性pH(30至70mM柠檬酸盐,pH 4.2),使得醛与含有ao-6-TAMRA的反应性标记试剂快速偶联。见图7。在这些条件下,在环境温度下15min内能够标记低至1皮摩尔的醛。见图17。在本申请中涉及其他的催化剂,包括Crisalli和Kool所描述的那些,其均通过引用并入本申请:Crisalli和Kool,Organic Letters 2013,15(7):1646-1649;Crisalli和Kool,Journal of OrganicChemistry 2013,78:1184-1189;Kool等,Journal of American Chemical Society 2013,135:17663-17666。
在一些实施方式中,通过存在的催化剂(如5-甲氧基邻氨基苯甲酸(5-MAA)、3,5二胺苯甲酸(3,5-DABA)或类似催化剂)、温度和pH可以加速捕获和标记。在一些实施方式中,pH为2至5,或者小于约5。
图7提供了两种不同催化剂对标准溶液法反应速率影响的实例。可以看出,在无催化剂且分析物浓度较低的情况下,标记反应非常慢。使用催化剂,反应速率能够快得多,例如,快约10倍。该反应提供比例约为1:1.2的5,6ao-TAMRA:己醛,将其作为5-MAA(5-甲氧基邻氨基苯甲酸或2-氨基-5-甲氧基-苯甲酸)或3,5DABA(3,5-二胺苯甲酸)的函数,己醛:催化剂的摩尔比为约1:900-1000和染料:催化剂为约1:1200。条件:6.2μM5,6-ao-TAMRA,7.5μM己醛。未加入缓冲剂,因为催化剂能够缓冲pH。见图7。
图17提供了催化剂5-MAA影响的另一个实例,其中包含5,6ao-TAMRA的反应性标记试剂与作为5-MAA函数的己醛以1:1.2的比例存在,其摩尔比为0、100和1000。包含5,6-ao-TAMRA的反应性标记试剂的浓度为6.2μM和己醛的浓度为7.5μM。6.5mM柠檬酸盐缓冲液的pH为4.16,实验在室温下进行。见图17。
在进一步的实例中,考察了温度对反应速率的影响。如图16中所示,温度的升高主要增加了初始反应速率。实验条件为比例为1:1的反应性标记试剂与己醛(例如,7μM ao-TAMRA和7μM己醛)、30%乙醇、75mM柠檬酸盐(pH 4.2)。见图16。
标准品(见图8)
在一些实施方式中,在测定中包括标准品。标准品能够确保一致性以及能够确保给定的测定有效并提供准确的数据。在一些实施方式中,包括至少一种反应性标准品。在一些实施方式中,包括至少一种非反应性标准品。
内标物不应干扰靶分子的色谱检测。
反应性标准品能够提供用于校正反应性漂移信号的机制,反应性漂移可能由多种因素引起,包括:试剂降解(荧光团、催化剂、缓冲剂)、分配变化和环境变化(温度)。可以选择和筛选长链脂肪醛用于反应性标准品。
非反应性标准品能够提供由仪器漂移或变化导致的信号归一化、总体反应性测定和保留时间定位。在一些实施方式中,非反应性标准品在所使用的条件下是稳定的,即不与试剂(即,标记试剂、靶点、催化剂)进行反应性或被动交换。非反应性标准品在测定条件下必须是光谱和化学稳定的。这在选择和构建非反应性标准品时需要特别考虑。对于非反应性标准品而言,可以制备酰胺官能化的6-TAMRA。示例性的化合物包括6-TAMRA-C14、6-TAMRA-C16和6-TAMRA-C18。
在一些实施方式中,反应性或非反应性标准化合物不干扰靶化合物(例如,C4-C10醛)。在一些实施方式中,所述反应性或非反应性化合物彼此之间能够很好地分辨。在一些实施方式中,所述标准反应性标准化合物对于测定具有适宜的反应性。在一些实施方式中,所述非反应性连接对于反应条件是稳定的。
使用标准品能够确定给定方法的检测限(LOD)。在图18中,使用相等浓度醛混合物的系列稀释液构建LOD曲线。向系列稀释的各样品中加入恒定浓度的反应性(C12醛)和非反应性(C16酰胺)内标物。
将反应物孵育15min,然后使用1M碳酸氢钠(pH 10)淬灭。通过使用标准条件的HPLC分析混合物,所述标准条件包括4X20mm反相C18柱(5μm)。在该实例中,LOD<0.13皮摩尔。
对过程的描述
本申请公开的方法和策略如图1中所示。本申请提供了对靶点的标记具有选择性和特异反应性,以及对所需的标记靶点进行特异性快速分离和检测的方法和系统。使用羰基选择性反应性荧光“涂料”对靶分子(例如,醛和酮)进行标记(见图1)。所述标记具有一个或多个下述功能:将光学“透明”的烷基醛靶点转化为能够通过吸收或荧光检测进行观察和定量的物质;和使得所需靶点能够并增强选择性分离。反应性标记和分离基质能够提供反应性、信号和分离性质的正确组合。在一些实施方式中,所述方法提供了分辨和鉴定链长相差1个碳的单个醛的能力。
醛沉积在二氧化硅上,并且能够使用含30mM柠檬酸盐缓冲剂(pH 4.2)的甲醇洗脱。可以任选地加入双内标物,也可以加入反应性醛模拟物、催化剂和反应性标记试剂。将混合物孵育足够的时间以使标记反应进行。可以使用碱溶液(例如,碳酸氢钠等)淬灭所述反应。
然后将溶液进样至C18反相分离柱,该柱已使用有机物含量低至中等的溶剂/缓冲剂混合物(如45%MeOH/TEA pH7)进行了预平衡。进样后,样品经过有机溶剂含量增加的梯度。所述梯度可以是线性的、分步的或其组合(分步+线性)。典型的梯度过程可以是初始使用45%MeOH/TEA pH 7预平衡;随后保持2-4min;随后在10min内从45%/MeOH pH7线性增加至100%MeOH;随后迅速返回至初始条件(45%MeOH/TEA pH7)。在这一过程中,基于靶点/标记的组合疏水性从柱上洗脱标记的醛(标记的靶点)。对于使用ao-6-TAMRA标记的那些,洗脱顺序是从链较短的醛至链较长的醛(C3、C4、C5…..C10)。此处的描述是说明性的,但是本申请中涉及其他溶剂和其他溶剂梯度。使用含有TAMRA衍生物的洗脱溶液作为说明性实例,洗脱标记的CCM并通过测定附着在CCM上的TAMRA衍生物吸收或发射的荧光对其进行检测。见图11。
通过监测每种洗脱物质的信号对醛的含量进行定量。所述信号是初始醛浓度的函数。通过与洗脱梯度同步的连续流动检测,监测作为进样后时间的函数的信号。信号强度和面积反映了每种标记物质(标记的醛)的群体。通过参照标准曲线定量样品中的每种物质,所述标准曲线通过进样已知量的合成的标记的醛标准品产生。还可以使用不连续流动检测对醛进行定量,其中对标记的物质进行分步洗脱并使用标准荧光计或类似装置测定每组的荧光信号。所描述的定量过程是“终点”测定方案的实例。在该方案中,允许对测定孵育一段时间,然后再进行分析。转化或信号增加是初始羰基(靶点)浓度的函数。有两种通用的测定形式或检测模式。通常将其描述为终点和动力学。在终点测定中,将系统孵育一段时间并读取信号。此时的信号反映了系统中分析物的量。对于阳性测定,分析物的浓度越高,信号增加越多。在动力学测定中,监测变化速率一段时间。变化速率与分析物的量相关。在一些方面中,采用本申请提供的方法进行终点测定。
在又一个实施方式中,使用双溶液法。在将CCM负载于基质上之后,将CCM洗脱至第一洗脱溶液或“洗涤”溶液中,该溶液通常含有30%乙醇、50mM柠檬酸盐和30%乙醇(pH2.5)。将试剂加入洗涤溶液,从而得到着色的CCM。然后,使该溶液通过另一基质(例如,二氧化硅筛板堆叠)以捕获着色的CCM。然后,使用第二洗脱溶液或“洗涤”溶液从其上捕获了着色CCM的基质上洗脱着色的CCM,该溶液含有大于50%乙腈和90%乙醇。在这个实施方式中,将靶CCM分成不同类别。类别的数量取决于所使用的不同洗涤的次数。在SPE类型的模式中,使用一次、两次或三次洗涤以分离短链(C1-C3)、中链(C4-C7)和长链(C8-C10)标记的醛。可以使用如上所述的连续或不连续流动方法基于荧光信号对这些组别进行定量。第二个实施方式的一个益处是其提供了对总醛和靶向组别醛的快速测定。这能够有助于快速筛选过程。
在一些方面中,所述系统和方法使得用户能够辨别和鉴定链长相差一个碳的单个醛。说明性地,在该系统中,使用第一洗脱溶液洗脱呼吸样品中的成分以形成含羰基部分的溶液。然后将含羰基部分的溶液与反应性标记试剂混合以形成在其中含有着色的含羰基部分的溶液。随后将着色的含羰基部分捕获在分离滤器组件或第二滤器组件上。然后梯度洗脱着色的含羰基部分以分辨和检测链长相差一个碳的含羰基部分。
可以使用反相(RP)、正相(NP)、离子交换(IC)和/或亲水性(HILIC)色谱将所需的着色的含羰基部分与未反应的标记和干扰物质分离。可以单独分离或作为物质的组分离所需物质以进行分析和定量。例如,采用两步洗脱过程(例如,40%MeOH,然后90%MeOH洗脱),利用中等尺寸的C18基质(标称40-60μm颗粒),能够将C4-C10线性烷基羰基化合物与未反应的标记和更小的线性烷基羰基(C1-C3)化合物分离。在这个实例中,将所需物质作为物质的总和分组分析。可以使用线性、分步或分段(分步之后是线性)梯度,采用珠尺寸较小的C18基质(10μm)对每种烷基醛进行分离和分析。例如,在本申请提供的实施方式中,使用含有10μm C18颗粒的柱以及在中等压力下(≈700psi)使用45%至90%MeOH分段梯度,通过反相分离对每种标记的羰基部分进行分离和分析(见图19)。
检测
通过将预设波长范围内的光导向溶液从而产生荧光,对着色的羰基物质进行检测、分析和定量。在预设波长范围内,对荧光进行检测、分析和定量。例如,当使用氨氧基-5(6)-TAMRA时,λEx/λEm(在MeOH中)是540/565nm;当使用氨氧基-5(6)-ROX时,λEx/λEm(MeOH)是568/595nm。
当溶液从分离基质中洗脱并通过检测器窗口时,可以在静态模式(批量定量)或流动模式(单独分析)下作为时间的函数进行分析,或者通过混合流动和停止模式进行分析。
在一些实施方式中,所述检测CCM的步骤包括测定由荧光团激发产生的荧光发射。在一些实施方式中,所述检测CCM的步骤包括测定由荧光团激发产生的荧光吸收。在一些方面中,所述检测CCM的步骤包括将预定波长范围内的光导向标记的CCM,从而产生荧光,并且检测荧光。在一些方面中,通过计算相对于标准曲线的荧光吸收或发射确定CCM的浓度,其中所述荧光信号与CCM的浓度成正比。
该系统也非常适于使用“终止”溶液。通过加入碳酸氢钠或氢氧化钠将pH升高至大于9以淬灭反应,从而提供批量处理样品以进行延迟分析的能力。
如上所述,可以使用手动SPE模式过程或通过采用半制备柱或分析短柱快速色谱分析将反应性标记与相应的标记的醛分离。在图9所示的SPE模式中,将标记的醛靶点上样至标准条件的SPE柱。进行两次洗涤。初始洗涤将未反应的标记,C1、C2和C3标记的醛作为一个组分洗脱。进行高有机物含量的最终洗涤将更长链的醛洗脱。其包括C5-C10。在该实施例中,残留量<4%。可以对C5-C10进行光学(吸收或荧光)定量以提供样品中醛的总和。可以通过改变洗涤液的配方来调节分组。
更令人吃惊的属性是,能够使用半制备色谱介质10-15μm颗粒状的C18快速分离和定量信号碳链长度不同的痕量水平的醛。使用含有10μm材料的4.6X 30mm和4.6X 50mm柱,在适度压力下,在少于15分钟内示例性地阐明了单碳分辨和检测。见图10。
该方法提供了对痕量水平的烷基醛的快速检测和定量。在进行15分钟的孵育和分离后,可以对亚皮摩尔的醛进行定量,总耗时约35分钟。使用反应性和非反应性内标对来校正反应效率,可以观察到<0.13皮摩尔的LOD。见图18。
在光学上,根据检测器的灵敏度能够检测低至1至10飞摩尔的标记的醛。见图8。通过延长孵育时间和增加柱长以提供额外的分辨率能够检测极低痕量水平的醛。
含有ao-6-TAMRA的反应性标记试剂联合缓冲剂和催化剂能够检测和定量呼吸样品中的醛(见图12和13)。在所提供的实施例中,采用了荧光发射检测。通过LCMS分析对醛的标记和鉴定进行确认(数据未显示)。作为一个必然结果,标记方案适于双Fl/LCMS检测或单F1和质谱检测模式。
此外,本申请提供的方法和系统适于针对目标痕量醛靶点的生物和环境样品。本公开内容不限于基于溶液或气体(空气)的采样,而是可以适于用于实时应用或护理点(point of care)应用的其他样品,并在采样后2小时内提供数据。
除非上下文另有明确要求,在整个说明书和权利要求书中,词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应以包含性的意义来解释,而不是排他性或穷举性的意义;即“包括,但不限于”的意义。在上下文允许的情况下,使用单数或复数的上述具体实施方式中的词语也可以分别包括复数或单数。在两个或更多个项目的列表的指代中的词语“或”涵盖该词语的所有以下解释:列表中的任意一个项目,列表中的所有项目和列表中项目的任意组合。
本公开内容的实施方式的上述详细描述并非旨在为穷举性的或将教导限于上文公开的精确形式。尽管上文出于说明的目的描述了本公开的具体实施方式和实施例,但是如相关领域的技术人员认识到的,在本公开范围内可以进行各种等同修改。此外,本申请指出的任何具体数字均仅是实例:替代实施方式可以采用不同的值、测量值或范围。应当理解的是,本申请给出的任何尺寸仅仅是示例性的,并且没有任何尺寸或描述限制本公开内容。
本申请提供的公开内容的教导能够应用于其他系统,不一定是上文所述的系统。可以组合上文所述的各个实施方式的要素和动作以提供其他的实施方式。
上文指出的任何专利和专利申请以及其他参考文献,包括可能在随附的提交文件中列出的任何文献,均通过引用整体并入本申请。如有必要,可以对本公开内容的各个方面进行修改,以采用上述各个参考文献的系统、功能和概念来提供本公开内容的其他的实施方式。
根据上述描述可以对本公开内容进行这些和其他改变。尽管上述描述了本公开内容的某些实施方式,并且描述了预期的最佳模式,但是无论上述内容在文字上如何详细,都可以以很多方式实施该教导。系统的细节可以在其实施细节方面有很大变化,但是其仍包含在本申请公开的主题中。如上文所示,当描述本公开内容的某些特性或方面时使用的特定术语不应被认为,暗示该术语在本申请中被重新定义以限于与该术语相关的本公开内容的任何具体特征、特性或方面。一般而言,在下述权利要求中使用的术语不应被解释为将本公开内容限制在说明书中公开的具体实施方式,除非上述具体实施方式部分明确地定义了这些术语。因此,本公开内容的实际范围不仅涵盖所公开的实施方式,而且涵盖根据权利要求实践或实施本公开内容的所有等同方式。
因此,尽管已经示出并描述了示例性的实施方式,但是应当理解的是,本申请使用的所有术语是描述性的而不是限制性的,并且本领域的普通技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下可以进行很多改变、修改和替换。
Claims (35)
1.一种用于检测样品中存在的至少一种醛的方法,所述方法包括下述步骤:
将所述样品暴露于基质以捕获所述醛;
从所述基质上洗脱所述醛;
将所述醛与反应性标记试剂混合;
将标记的醛上样至柱上;
使用有机溶剂从所述柱上洗脱所述标记的醛;以及
检测所述标记的醛;
其中所述检测方法在少于约2小时内完成。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括测定所述至少一种醛的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种醛选自下组:C1醛、C2醛、C3醛、C4醛、C5醛、C6醛、C7醛、C8醛、C9醛、C10醛及其混合物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种醛是脂肪族、二醛或芳香醛,或者其混合物。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品包含两种或多种不同碳链长度的醛,并且其中所述检测所述标记的醛的步骤分辨每种醛。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是生物样品。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是环境样品。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品选自下组:呼吸样品、尿液样品、血液样品、血浆样品和培养物顶空样品。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是呼吸样品。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述基底选自下组:二氧化硅、多糖、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、聚乙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚酯、聚丙烯、二氧化硅、钝化氧化铝、硅藻土、MgSO4、多孔基质、氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、布、棉、尼龙、人造丝、多孔凝胶、硅胶、琼脂糖、葡聚糖、明胶、聚合物膜和聚丙烯酰胺。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述捕获所述醛的步骤包括将至少一种醛收集在滤器组件上。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述反应性标记试剂包含荧光团、接头和反应性基团。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述荧光团选自下组:四甲基罗丹明(TAMRA)、氨氧基5(6)TAMRA、氨氧基5TAMRA、氨氧基6TAMRA、罗丹明X(ROX)、罗丹明6G(R6G)、罗丹明110(R110)和香豆素。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述接头选自下组:取代的烷基-二胺(C2-C10)、取代的氨基-羧酸(C2-C10)和取代的聚乙二醇(N=1-10)。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述接头选自下组:己酸、氨基己酸、尸胺(cadavarine)、聚乙二醇和聚甘醇。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述反应性基团选自下组:肼部分、碳酰肼部分、羟胺部分、半咔唑部分、氨氧基部分和酰肼部分。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述反应性标记试剂选自下组:
及其混合物。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述检测所述醛的步骤包括测定由所述荧光团激发产生的荧光发射。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述检测所述醛的步骤包括测定由所述荧光团激发产生的荧光吸收。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述检测所述醛的步骤包括将预定波长范围内的光导向所述标记的醛,从而产生荧光,并检测所述荧光。
21.根据权利要求2所述的方法,其中通过计算相对于标准曲线的所述荧光吸收或发射来确定所述醛的浓度,其中所述荧光信号与所述醛的浓度成正比。
22.根据权利要求1所述的方法,其中所述柱是反相柱。
23.根据权利要求1所述的方法,其中所述有机溶剂选自下组:甲醇、异丙醇、乙腈和乙醇。
24.一种用于检测样品中存在的至少一种含羰基部分的方法,所述方法包括下述步骤:
将所述样品暴露于基质以捕获所述含羰基部分,
从所述基质上洗脱所述含羰基部分,
将所述含羰基部分与反应性标记试剂混合,
将标记的含羰基部分上样至柱上,
使用有机溶剂从所述柱上洗脱所述标记的含羰基部分,以及
检测所述标记的含羰基部分,
其中所述检测方法在少于约2小时内完成。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述含羰基部分选自下组:醛、酮、羧酸及其混合物。
26.一种检测气体样品中含羰基部分的方法,所述方法包括:
从样品中分离所述含羰基部分;
将所述含羰基部分与反应性标记试剂混合,其中所述含羰基部分与所述反应性标记试剂结合;
使标记的含羰基部分通过柱;
激发脱离所述柱的所述标记的含羰基部分;以及
通过测定由与所述含羰基部分结合的所述反应性标记试剂发射或吸收的荧光以检测所述含羰基部分,
其中所述检测步骤基于碳链长度分辨所述含羰基部分,以及
其中从所述样品中分离所述含羰基部分到检测所述含羰基部分所经过的时间少于约2小时。
27.一种包含荧光团、接头和反应性基团的化合物。
28.根据权利要求27所述的化合物,其中所述荧光团选自下组:ao-5-TAMRA、ao-6-TAMRA及其混合物。
29.根据权利要求27所述的化合物,其中所述接头选自下组:己酸、氨基己酸、尸胺(cadavarine)、聚乙二醇和聚甘醇。
30.根据权利要求27所述的化合物,其中所述反应性基团选自下组:肼部分、碳酰肼部分、羟胺部分、半咔唑部分、氨氧基部分和酰肼部分。
31.根据权利要求27所述的化合物,包含:
32.根据权利要求27所述的化合物,包含:
33.一种用于检测样品中存在的至少一种含羰基部分的系统,所述系统包括:
捕获所述含羰基部分的基质;
用于从所述基质上洗脱所述含羰基部分的一种或多种试剂;
用于将所述含羰基部分与反应性标记试剂结合的一种或多种试剂;
用于分辨标记的含羰基部分的柱;
用于将所述标记的含羰基部分从所述柱上洗脱的一种或多种溶剂;以及
用于产生荧光激发、吸收和/或发射以检测所述标记的含羰基部分的光和检测器。
34.根据权利要求33所述的系统,其中所述系统在少于约2小时内完成一个循环。
35.根据权利要求33所述的系统,还包括用于测定所述至少一种含羰基部分的浓度的一种或多种标准品。
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