CN111983070A - 一种乙醇代谢能力测定试剂盒及其方法 - Google Patents

一种乙醇代谢能力测定试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乙醇代谢能力测定试剂盒及其方法，属于呼气检测技术领域。它解决了现有检测乙醇代谢能力的试剂盒属于侵入式检测，对患者造成不适等问题，一种乙醇代谢能力测定试剂盒，包括乙醇水溶液，收集装置，选择性吸附装置，洗脱剂，定容液；所述的选择性吸附装置包括填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有用有机溶液配制成的含有2，4‑二硝基苯肼的涂渍液。本发明具有检测灵敏度高等优点。

Description

一种乙醇代谢能力测定试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于呼气检测技术领域，特别涉及一种乙醇代谢能力测定试剂盒及其方法。
背景技术
呼气检测是有别于常规体液检测的一种检测方式。利用特定采集方式采集受试目标的呼出气，经过一定前处理方式获得适用于不同仪器的检测样本，再对样本进行分析，可获得受试者呼出气成分信息。
乙醇在人体肝脏内，首先通过乙醇脱氢酶，将乙醇转化为乙醛，随后再通过乙醛脱氢酶，转化为乙酸。不同人体内两种酶的数量和活性不同，导致对乙醇的代谢能力的差异，该差异会导致某类人群在饮酒后体内乙醛的大量积累，分解缓慢，造成身体受损。
现有也有多种多样的检测乙醇代谢能力的试剂盒，但是大多是利用基因检测可分析体内两种酶的数量，但也仅是检测与编码两种酶相关联的基因情况。且很多检测乙醇代谢能力的试剂盒属于侵入式检测，对患者造成不适。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种乙醇代谢能力测定试剂盒；本发明的第二个目的是提供一种检测乙醇代谢能力的方法。
本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种乙醇代谢能力测定试剂盒，包括乙醇水溶液，收集装置，选择性吸附装置，洗脱剂，定容液；所述的选择性吸附装置包括填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有用有机溶液配制成的含有衍生试剂的涂渍液。
优选地，所述的衍生试剂为2，4-二硝基苯肼。
优选地，所述的涂渍液中2，4-二硝基苯肼的质量含量≥0.01％，所述的涂渍液呈酸性。涂渍液中36％-38％浓盐酸的体积含量为0.1％。
优选地，所述的涂渍液中2，4-二硝基苯肼的质量含量为0.1％。
优选地，所述的乙醇水溶液中乙醇总量大于0.1mL。
优选地，所述的洗脱剂、定容液和有机溶液均为乙腈。
优选地，还包括标准品，所述的标准品为浓度不同的乙醛-DNPH标准溶液。
优选地，所述的标准品中，以乙醛计，乙醛分别为10ug/L、50ug/L、200ug/L、1000ug/L、2000ug/L。
优选地，所述的收集装置为经过预处理的气袋，处理步骤为在60-80℃的温度下，往气袋内通入氮气或者氦气，使气体在气袋内停留至少30分钟，抽出再通入新的氮气或者氦气，反复至少4次。
本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：一种检测乙醇代谢能力的方法，其特征在于，包括如下步骤；
S01：摄入乙醇水溶液，吹气并用收集装置收集；
S02：收集装置连接选择性吸附装置，人体呼出气以恒定的流速流经选择性吸附装置；所述的选择性吸附装置为填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有用有机溶液配制成的含有2，4-二硝基苯肼的涂渍液；
S03：用洗脱剂洗脱选择性吸附装置，得到待测液，然后用检测仪器对待测液进行检测。
本发明的工作原理：本发明通过乙醇水溶液，即乙醇的摄入，再采集人体呼出气，该呼出气中含有身体代谢乙醇产生的乙醛。通过分析呼出气中乙醛的浓度变化曲线，来反映不同的人的乙醇分解能力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的检测试剂盒和检测方法灵敏高，最低可定量194ng/L(以乙醛计，3L呼出气)气体中的乙醛。稳定性好，RSD％控制在5％以内。精密度高，不同时间测试定量结果相对标准偏差都控制在15％以内。
2.本发明的试剂盒针对人体呼出气中乙醛含量的检测，属于非侵入式检测，不需体液，对人体伤害小。
3.本发明试剂盒针对不同时间段人体呼出气中乙醛含量的定量检测，得到受试者的乙醛变化曲线，从而可以准确判断不同人的乙醇代谢情况。
4.本发明的反应选择性高，选择性吸附装置只能选择性吸收醛类物质，对其他类物质吸附性低，降低了呼出气中其他基质对乙醛可能的影响，提高了方法可靠性。
5.本发明的气袋经过处理，降低了材料对检测准确度的影响，提高了可靠性。
6.本发明的选择性吸附装置包括填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有涂渍液，涂渍液为含有2，4-二硝基苯肼的有机溶液，2，4-二硝基苯肼能够吸附在固定相上，且乙醛能与涂渍在固定相上的2，4-二硝基苯肼发生化学反应且具有持续性，生成的产物能够从固定相上洗脱下来。
7.气袋在收集人体呼出气后，气袋的温度在40-50℃之间，即对人体呼出气进行加热恒温处理，有利于提高样本的稳定性，从而使后续的检测结果更准确。
附图说明
图1是本发明两种乙醛变化曲线图；
图2是本发明强乙醛代谢能力特征曲线图；
图3是本发明弱乙醛代谢能力特征曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
(1)选择性吸附装置的制备
即吸附采样管的制备，将2，4-二硝基苯肼(DNPH)用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为0.01％-0.1％的涂渍液，涂渍液中含有体积分数为0.1％的36％-38％浓盐酸；再将固定相填料200mg填充到空白吸附柱上；最后将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上，涂渍方法采用直接涂渍法进行。涂渍前先用乙腈润洗空白吸附柱，负压固相萃取系统除去润洗的乙腈试剂，然后将配好的涂渍液直接涂渍在吸附柱上，涂渍饱和后采用负压固相萃取系统除去多余的涂渍液，制成能够进行选择性吸附呼出气醛酮类物质的选择性吸附柱，用氮气吹干吸附柱并在4℃下密封保存待用。固定相可以选用硅胶填料、C18填料和弗洛里硅藻土填料中的一种或任意组合。
(2)气袋的预处理
先对气袋进行预处理，气袋可以是泰德拉气袋或者nalophen或者PFV或者其他材质的气袋。
将气袋放入恒温控制箱中，温度设定在60℃，再往气袋内充入氮气，氮气在气袋内停留3-30分钟，再抽出氮气，重新通入氮气，反复4次后，进行气袋的清洁验证。
改变温度、清洗次数、通入的气体，其他步骤同上。
气袋的清洁验证：气袋清洗完成后，充入3L的氮气，加热50℃恒温条件下，用吸附采样管吸收，将袋子的气体全部吸收完成，吸附采样管用溶剂洗脱并定容至2ml过滤测试背景，背景测试满足要求后(采样袋背景中测定的标记物定量结果醛类物质以乙醛计，换算后结果以乙醛计≤10ug)，袋子才能使用。
实验证明：当温度在60-80℃，往气袋内通入氮气或者氦气，在气袋内停留30分钟及以上，抽出再通入，反复4-8次，其背景测试均能满足要求。
试剂盒的组成
试剂盒内包括的物品见表1，内容物应按照上述方法通过验证。试剂盒在4-8℃下保存。
表1试剂盒内容物
Figure BDA0002629578740000051
液相色谱-串联质谱联用仪对待测溶液的检测
选用乙醛-DNPH标准溶液作为本发明的标准溶液，按照外标法对呼出气中的乙醛进行定量。用液相色谱-串联质谱联用仪对标准溶液进行检测，以标准溶液中的浓度含量为横坐标，对应的测定出来的峰面积为纵坐标作图绘制线性回归工作曲线。标准曲线浓度如表2所示。所有配置的标记物都是购买的以乙醛计的液体标准溶液。
表2标准曲线浓度
Figure BDA0002629578740000052
Figure BDA0002629578740000061
设置的液相色谱仪器参数如表3所示，流动相选择:A 0.5mmol/L的乙酸铵缓冲液+B乙腈
表3液相色谱仪参数
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 备注
3 50 50 无
5 40 60 无
7.5 40 60 无
8 30 70 无
9.5 30 70 无
10 10 90 无
11 10 90 无
11.5 50 50 无
程序终止
设置的质谱仪器参数如表4所示：
表4质谱仪器参数
化合物名 m/z 保留时间 事件号 参比离子
乙醛 223.05>163.05 6.089 4:MRM(-) 223.05>122.00
本发明试剂盒和方法检测的灵敏度，以信噪比9作为定量限，在气体成分中最低能检测到194ng/L。乙醛的仪器检测灵敏度如表5所示。
表5乙醛的仪器检测灵敏度
Figure BDA0002629578740000062
稳定性好，精密度高，RSD％控制在5％以内。表6为标记物质控日内和日间定量结果的稳定性测定结果。用100ug/L的乙醛-2,4-二硝基苯腙作为质控品，即用本发明检测方法在不同的时间内测定质控品中乙醛-DNPH含量，经过计算得到乙醛的量，从而检测方法稳定性。
表6标记物质控日内和日间定量结果的稳定性测定结果
Figure BDA0002629578740000071
实施例1
(1)选择不含任何添加剂成分的食用乙醇，以水稀释成20ml，稀释后的乙醇中乙醇的体积分数为0.5％，然后受试者饮入，饮入乙醇的总量为0.1ml。
(2)饮入后，立即往气袋内吹气3L，10分钟后进行一次呼气采集，此后每隔60分钟采集呼出气。将气袋内的人体呼出气持续以50mL/min的流速流经吸附采样管，吸附采样管和气袋在此过程中的温度控制在50℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的乙醛。
(3)用洗脱剂乙腈洗脱吸附采样管，洗脱后的溶液过滤，并用定容剂乙腈定容至2ml作为待测液，液相色谱-串联质谱联用仪对待测液进行检测。
(4)液相色谱-质谱联用仪分析，选用乙醛-DNPH标准溶液作为本发明的标准溶液，制备标准工作曲线，外标法进行各个时间点下乙醛的定量。
针对体内乙醛变化，一般具有以下两种特征曲线，如图1-3所示，图2为图1中1#乙醇变化曲线图，图3为图1中2#乙醇变化曲线图。
如图2，体内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，尤其是后者的活性大时，喝下去的乙醇在第一步转化为乙醛后，继续迅速代谢转化为乙酸，体内乙醛浓度不会积累，对身体造成的伤害小。图2为强乙醇代谢能力特征曲线图。
如图3，体内两种酶活性小，乙醇在转变为乙醛后，容易在体内积累，对身体造成伤害。图3为弱乙醇代谢能力特征曲线图。
实施例2
(1)选择市售商品白酒，乙醇的体积分数为40％，然后受试者饮入，饮入5ml。饮入乙醇的总量为2ml。
(2)饮入后，立即往气袋内吹气1L，此后每隔30分钟采集呼出气，将气袋内的人体呼出气持续以50mL/min的流速流经吸附采样管，吸附采样管和气袋在此过程中的温度控制在40℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的乙醛。
(3)用洗脱剂乙腈洗脱吸附采样管，洗脱后的溶液过滤，并用定容剂乙腈定容至2ml作为待测液，液相色谱-串联质谱联用仪对待测液进行检测。
(4)液相色谱-质谱联用仪分析，选用乙醛-DNPH标准溶液作为本发明的标准溶液，制备标准工作曲线，外标法进行各个时间点下乙醛的定量。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，包括乙醇水溶液，收集装置，选择性吸附装置，洗脱剂，定容液；所述的选择性吸附装置为填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有用有机溶液配制成的含有衍生试剂的涂渍液。
2.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的衍生试剂为2，4-二硝基苯肼。
3.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的涂渍液中衍生试剂的质量含量≥0.01％，所述的涂渍液呈酸性。
4.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的乙醇水溶液中乙醇总量大于0.1mL。
5.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的洗脱剂、定容液和有机溶液均为乙腈。
6.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述的标准品为浓度不同的乙醛-DNPH标准溶液。
7.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的标准品中，以乙醛计，乙醛分别为10ug/L、50ug/L、200ug/L、1000ug/L、2000ug/L。
8.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢能力测定试剂盒，其特征在于，所述的收集装置为经过预处理的气袋，处理步骤为在60-80℃的温度下，往气袋内通入氮气或者氦气，使气体在气袋内停留至少30分钟，抽出再通入新的氮气或者氦气，反复4-8次。
9.一种检测乙醇代谢能力的方法，其特征在于，包括如下步骤；
S01：摄入乙醇水溶液，吹气并用收集装置收集；
S02：收集装置连接选择性吸附装置，人体呼出气以恒定的流速流经选择性吸附装置；所述的选择性吸附装置为填充有固定相的吸附柱，固定相上涂渍有用有机溶液配制成的含有2，4-二硝基苯肼的涂渍液；
S03：用洗脱剂洗脱选择性吸附装置，得到待测液，然后用检测仪器对待测液进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种检测乙醇代谢能力的方法，其特征在于，所述的检测仪器为液相色谱-质谱联用仪。
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