CN109100447B - 烟草中糖和淀粉的快速测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草中糖和淀粉的测定方法，使用以下装置：样品萃取分离瓶，包括：外套管(1)、内套管(2)；样品萃取架(5)；样品收集架(6)；转抽(7)。步骤为：萃取糖份；水解淀粉后萃取；使用高效液相色谱法进行测定。本发明的测定方法可用于检测烟草中草中糖和淀粉的含量，具有前处理简单方便、重复性好的优点。

Description

烟草中糖和淀粉的快速测定方法

技术领域

本发明属化学分析技术领域，具体涉及一种测定烟草中糖和淀粉的快速方法。

背景技术

基因组学是现代生命科学中最活跃、最重要的前沿领域之一。中国烟草总公司于2010年底启动了“烟草基因组计划重大专项”，希望通过重大专项的实施能够在基因工程育种方面取得重大突破，实现烟草的香气质、香气量、有害成分、烟碱、产量、抗性、养分高效利用、烤性等的精确改良和定向育种，为卷烟减害降焦提供新的途径。烟草基因组编辑技术以所有基因编辑素材为对象，通过化学成分分析对素材进行筛选，并通过烟叶的配伍性测试和卷烟配方验证，确定工业可用性强的品种。

糖类化合物是烟叶所有成分中含量最大的一类化合物，占烟叶干物质总量的25～50％。烟草中的糖类化合物对烟叶品质影响巨大。烟草中的糖类除与氨基酸反应生成糖–氨基酸缩合物外，还可以直接作为某些香味成分的前体物经热解形成香味物质。并且，烟叶燃吸时，糖类化合物高温裂解后能使烟气呈酸性(pH 5.3～6.5)，对烟气的香气和吃味都有良好的作用，并能减少烟气的刺激性。因此糖类化合物是决定烟叶品质的重要化学成分，是烟草化学常规分析中的重要项目。

淀粉是高等植物中碳水化合物贮藏的主要形式，成熟的鲜烟叶中淀粉含量高达40wt％。与其他植物相比，新鲜烟叶中的淀粉只作为暂时贮存形态，烟叶经调制、发酵后，淀粉大部分转化为小分子碳水化合物，小分子碳水化合物在燃吸过程中会裂解产生酸性物质，这些酸性物质在中和含氮化合物燃烧过程中产生的碱性气体方面有着重要作用。因此适宜的淀粉含量是提高卷烟香吃味质量的重要指标。

目前，烟草行业糖的测定方法主要有费林试剂法、近红外分光光度法、连续流动分析法、毛细管电泳法、气相色谱法和高效液相色谱法等。淀粉的测定常用碘显色连续流动分析法、离子色谱法、高效液相色谱法等。在目前的技术条件下，如果需要对同一个样品中的糖类化合物和淀粉进行检测，需要称取两份样品，并采用不同的前处理方法分别对两份样品进行提取净化方能实现，不仅操作繁琐，而且需要耗费双倍甚至更多的时间、试剂、人力、物力，严重影响检测工作效率。随着烟草基因组编辑技术工作的启动，基因组编辑将产生数万个素材，要对海量素材进行快速化学分析评价，现有方法很难满足需求。

为解决上述问题，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种烟草中糖和淀粉的快速测定方法。

本发明的目的还在于提供一种集快速萃取、过滤为一体的前处理装置，可有效实现烟草样品中糖和淀粉的快速萃取和分离。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种烟草中糖和淀粉的测定方法，使用以下装置：

样品萃取分离瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其长度大于所述外套管1的长度；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；密封圈11，套在所述内套管2的下端外，与所述外套管1内壁形成密封；样品萃取架5，其内有若干样品萃取分离瓶放置孔51，用于放置所述样品萃取分离瓶；样品收集架6，其内有若干第一样品瓶放置孔61和若干第二样品瓶放置孔62，用于放置第一样品瓶610和第二样品瓶620；转抽7，位于所述样品收集架6中心部；所述样品收集架6和所述样品萃取架5可分别围绕所述转抽7旋转；水浴槽4，放置在所述样品萃取分离瓶放置孔51下面；

该方法包括以下步骤：

①称取0.5g烟草样品放置于外套管1中，加入50mL萃取剂，插入内套管2并放置在所述样品萃取架5上进行超声萃取30min；

②萃取结束后把上述内套管2下压，使糖类化合物萃取液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中，然后将糖类化合物萃取液转移至100mL的第一样品瓶610中；

③向内套管2中再次加入20mL萃取剂，将内套管2向上拉，使萃取剂在真空作用下通过筛板3进入到外套管1中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使糖洗涤液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中；合并洗涤液于第一样品瓶610中，用萃取剂定容至刻度得到试液A；

④向内套管2中加入25mg的α-淀粉酶和20mL水；把内套管向上拉，让淀粉酶溶液在真空作用下完全通过筛板3进入到外套管中，混合均匀，然后放置于水浴槽4中100℃下水解1.5小时；

⑤向外套管1中加入2.0mL的三氟乙酸，混合均匀，然后放置于水浴槽4中60℃下水解30分钟；

⑥将内套管2下压，让淀粉水解液通过筛板3过滤进入到内套管中，然后将淀粉水解液完全转移至50mL的第二样品瓶620中；

⑦向内套管2中再次加入20mL水，将内套管2向上拉，使水在真空作用下通过筛板3进入到外套管1中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使洗涤液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中；合并洗涤液于第二样品瓶620，用水定容至刻度得到试液B；

⑧在超高效液相色谱仪上测定试液A，即得到烟草中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量；

⑨在超高效液相色谱仪上测定试液B，得到烟草中葡萄糖的含量，然后折算成淀粉含量即为烟草中淀粉的含量。

优选地，所述的筛板3的孔径为20μm，所述筛板3由密封圈11固定在所述内套管2的下端开口内。

优选地，步骤①、②或③所述的萃取试剂为80v/v％乙醇水溶液。

优选地，步骤⑧或⑨所述的高效液相色谱条件为：分析柱为ACQUITYUPLC BEHAmide糖分析柱(2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司)；流动相为80v/v％的乙腈，流速为0.4mL/min，柱温为45℃；进样量5.0μL；ELSD的漂移管温度85℃，氮气作载气，流速2.00L/min。

优选地，所述流动相内还含有0.2v/v％的三乙胺。

本发明的有益效果：

1、本发明使用的装置通过一次样品前处理即可获得糖类测试液和和淀粉测试液，与现行标准方法中糖和淀粉分别进行样品前处理再分别测定含量相比，具有简单、方便、萃取效果好、样品处理通量高等优点。

2、本发明通过采用自主设计的样品萃取分离瓶，超声萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉降到样品外套管底部，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现，使样品前处理周期大大缩短。本发明的样品萃取瓶设计精巧，实用新强，使得样品萃取效果有较大提高。

3、本发明的测定方法样品萃取效果和精密度均比传统方法有较大提高，分析结果与标准方法测定的结果相符合。具有定量准确、重复性好、检出限低等优点，适用于大批量样品的准确测试。该测定方法样品分析效率比传统方法有较大提高，为烟草产品评价提供有效的技术支持。

4、本发明采用超高效液相色谱分析，5min即可完成每个样品中糖类化合物的分析检测，与常规离子色谱法和液相色谱法相比，色谱分析时间大大缩短。

5、本发明的方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高5倍以上，为基因编辑素材化学筛选提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

附图说明

图1为本发明的外套管示意图；

图2为本发明的内套管示意图；

图3为本发明的内套管插入外套管口部示意图；

图4为本发明的内套管下压示意图；

图5为本发明的内套管上拉示意图；

图6为本发明的样品萃取架和样品收集架示意图；

图7为本发明的-第一样品瓶、第二样品瓶及水浴槽示意图；

图8为标样色谱图(a)和样品色谱图(b)；

附图说明：1-外套管；11-密封圈；12-样品；2-内套管；3-筛板；4-水浴槽；5-样品萃取架；51-样品萃取分离瓶放置孔；6-样品收集架；61-第一样品瓶放置孔；62-第一样品瓶放置孔；610-第一样品瓶；620-第二样品瓶；7-转轴。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

除非另有说明，本发明的百分比浓度为体积百分比浓度。

1、仪器与试剂

Waters Acquity型超高效液相色谱系统，包括二元梯度泵，Empower色谱工作站，蒸发光散射检测器(美国Waters公司)；Milli-Q50高纯水处理器(美国Millipore公司)；

D-果糖、D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖(纯度大于99％，Supelco公司)。甲醇和乙腈为色谱纯试剂(Fisher公司)。实验用水为高纯水。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准溶液：准确称取50mg的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖于10mL的容量瓶中，用80v/v％的甲醇溶解并定容到刻度，得5.0mg/mL的储备液；使用时用80v/v％甲醇稀释成所需浓度的标准工作液。

α-淀粉酶，50U/mg，购于Bacillus subtilis公司。

样品萃取分离瓶见附图，样品萃取瓶由外套管1和带20μm过滤筛板3及密封圈的内套管2组成。外套管的内径为3.0cm，高度为8.0cm，内套管外径为2.9cm，长度为10cm，密封圈厚度为0.6mm(和外套管形成密封)。萃取分离瓶使用前先检验密封性，在1.3-1.5倍大气压下密封圈处不漏液为合格。

2、色谱条件

分析柱为ACQUITY UPLC BEH Amide糖分析柱(2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司)；流动相为80v/v％的乙腈(内含0.2v/v％三乙胺)，流速为0.4mL/min，柱温为45℃；进样量5.0μL；ELSD的漂移管温度85℃，氮气作载气，流速2.00L/min。

3、糖类化合物的提取

成品烟叶样品于40℃下烘2h，粉碎到40目，新鲜烟叶样品采样冷冻干燥24小时。于样品萃取架上放置萃取瓶外套管，于外套管中依次称取0.5g样品，于放置有样品的外套管中依次加入80v/v％乙醇溶液50mL；将带20μm过滤筛板的内套管依次插入外套管中，将放置有萃取分离瓶的样品萃取架放置于超声波发生器中，于室温下超声萃取30分钟；萃取结束后于超声波发生器中取出样品萃取架，把内套管下压，让糖类化合物萃取液通过筛板过滤进入到内套管中(含淀粉的样品残渣留在外套管中)，将萃取瓶中的糖类化合物萃取液转移至100mL第一样品瓶610中；往倒出萃取液后的内套管中再次加入80v/v％乙醇溶液20mL，把内套管向上拉，让80v/v％乙醇溶液在真空作用下通过筛板进入到外套管中，充分振荡洗涤样品，洗涤完后再次把内套管下压，合并洗涤液于放置有糖类化合物提取液的第一样品瓶610中，用80v/v％乙醇溶液定容至刻度得到试液A用于烟草中糖类化合物含量测定。

4、淀粉水解

于糖类化合物提取结束后的内套管中加入25mgα-淀粉酶和20mL水，把内套管向上拉，让淀粉酶溶液在真空作用下通过筛板进入到外套管中，充分摇匀，将放置有萃取瓶的样品萃取架放置于100℃水浴中水解1.5小时；酶水解结束后于100℃水浴中取出样品萃取架，于萃取分离瓶外套管的溶液中加入2.0mL三氟乙酸，充分摇匀，将放置有萃取瓶的样品萃取架放置于60℃水浴中水解30分钟；酸水解结束后于60℃水浴中取出样品萃取架，把内套管下压，让淀粉水解液通过筛板过滤进入到内套管中；将萃取瓶中的淀粉水解液转移至50mL的第二样品瓶620中；往倒出水解液后的内套管中加入20mL水，把内套管向上拉，让水在真空作用下通过筛板进入到外套管中，充分振荡洗涤样品；洗涤完后再次把内套管下压，合并洗涤液于放置有淀粉水解液的第二样品瓶620中，用水定容至刻度得到试液B，测定淀粉水解产物葡萄糖，折算为淀粉即为烟草中淀粉含量。

5、超高效液相色谱检测

在超高效液相色谱仪上测定试液A中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量；在超高效液相色谱仪上测定试液B中淀粉水解产物葡萄糖的含量，然后折算成淀粉含量。

实施例：10种卷烟样品

按上述的方法要求，测试10种烟草样品中糖和淀粉的含量。

分析结果为：10种烟草样品测定葡萄糖含量范围为：10.5-62.1mg/g，果糖含量范围为18.5-82.7mg/g，蔗糖含量范围为4.3-12.1mg/g，麦芽糖含量范围为1.9-5.5mg/g。

日内精密度和日间精密实验：烟草样品在相同条件下平行测定7次(同批次处理)，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得果糖的RSD为1.2％、葡萄糖的RSD为1.6％、蔗糖的RSD为1.8％、麦芽糖的RSD为2.5％，说明方法精密度良好。烟草样品在不同时间内测定(每天测定1次，共7次)，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得果糖的RSD为2.0％、葡萄糖的RSD为2.0％、蔗糖的RSD为2.2％、麦芽糖的RSD为3.0％；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。图8为标样色谱图(a)和样品色谱图(b)，图中的1峰为果糖、2峰为葡萄糖、3峰为蔗糖、4峰为麦芽糖。从图8可以看出本发明的烟草样品中四种糖类化合物的分离度较好。

回收率实验：样品按选定的前处理条件处理，并按选定的色谱条件进样分析，测定时称取相同的烟草样品2份，其中一份为基准，另一份加入已知量的糖标样(设0.05mg、0.2mg、1.0mg三个添加量)，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率。得各糖的回收率在91-102％之间，说明方法回收率很高。

工作曲线与检出限：配制系列不同浓度的标准溶液，在选定色谱条件下进样5μL，根据测得的峰面积A(单位：mV.S)对糖的浓度(mg/mL)进行线性回归，得到回归方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5μL，计算当信噪比S/N＝3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，计算当信噪比S/N＝10时所对应的标准溶液的浓度以确定定量限，结果见表1。由表1可知，本发明的测定方法精度较高。

表1各种糖的标准曲线方程、相关系数、线形范围和检出限

通过对比行业标准的前处理方法及检测方法，本发明的前处理方法和检测方法效率提高5倍以上，适合烟草样品高通量分析检测工作的开展。

Claims (5)

1.一种烟草中糖和淀粉的测定方法，其特征在于，使用以下装置：

样品萃取分离瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其长度大于所述外套管(1)的长度；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架(5)，其内有若干样品萃取分离瓶放置孔(51)，用于放置所述样品萃取瓶；密封圈(11)，套在所述内套管(2)的下端外，与所述外套管(1)内壁形成密封；样品收集架(6)，其内有若干第一样品瓶放置孔(61)和若干第二样品瓶放置孔(62)，用于放置第一样品瓶(610)和第二样品瓶(620)；转轴(7)，位于所述样品收集架(6)中心部；所述样品收集架(6)和所述样品萃取架(5)可分别围绕所述转轴(7)旋转；水浴槽(4)，放置在所述样品萃取分离瓶放置孔(51)下面；

该方法包括以下步骤：

①称取0.5g烟草样品放置于外套管(1)中，加入50mL萃取剂，插入内套管(2)并放置在所述样品萃取架(5)上进行超声萃取30min；

②萃取结束后把上述内套管(2)下压，使糖类化合物萃取液完全通过筛板(3)过滤后进入到内套管(2)中，然后将糖类化合物萃取液转移至100mL的第一样品瓶(610)中；

③向内套管(2)中再次加入20mL萃取剂，将内套管(2)向上拉，使萃取剂在真空作用下通过筛板(3)进入到外套管(1)中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使糖洗涤液完全通过筛板(3)过滤后进入到内套管(2)中；合并洗涤液于第一样品瓶(610)中，用萃取剂定容至刻度得到试液A；

④向内套管(2)中加入25mg的α-淀粉酶和20mL水；把内套管向上拉，让淀粉酶溶液在真空作用下完全通过筛板(3)进入到外套管中，混合均匀，然后放置于水浴槽(4)中100℃下水解1.5小时；

⑤向外套管(1)中加入2.0mL的三氟乙酸，混合均匀，然后放置于水浴槽(4)中60℃下水解30分钟；

⑥将内套管(2)下压，让淀粉水解液通过筛板(3)过滤进入到内套管中，然后将淀粉水解液完全转移至50mL的第二样品瓶(620)中；

⑦向内套管(2)中再次加入20mL水，将内套管(2)向上拉，使水在真空作用下通过筛板(3)进入到外套管中(1)中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使洗涤液完全通过筛板(3)过滤后进入到内套管(2)中；合并洗涤液于第二样品瓶(620)，用水定容至刻度得到试液B；

⑧在超高效液相色谱仪上测定试液A，即得到烟草中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量；

⑨在超高效液相色谱仪上测定试液B，得到烟草中葡萄糖的含量，然后折算成淀粉含量即为烟草中淀粉的含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的筛板(3)的孔径为20μm，所述筛板(3)由密封圈(11)固定在所述内套管(2)的下端开口内。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤①或③所述的萃取剂为80v/v％乙醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑧或⑨所述的高效液相色谱条件为：分析柱为ACQUITY UPLC BEH Amide糖分析柱2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司；流动相为80v/v％的乙腈，流速为0.4mL/min，柱温为45℃；进样量5.0μL；ELSD的漂移管温度85℃，氮气作载气，流速2.00L/min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相内还含有0.2v/v％的三乙胺。

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