CN108519338A - 一种用于烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量连续流动分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量连续流动分析方法，包括以下步骤：A、准确称取0.25g含有水溶性糖的样品置于25mL样品管中，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪自动进样器的进样盘上，直至全部放满；B、用移液枪向每个样品管中分别加入5％醋酸溶液25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，进行振荡萃取；C、萃取完后把内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

Description

一种用于烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量连续流动分 析方法

技术领域

本发明属于烟草化学研究领域，具体涉及一种适合烟草基因编辑素材中水溶性糖含量检测的高通量分析方法。

背景技术

随着烟草行业“烟草基因组计划重大专项基于基因组编辑技术的工厂化育种方案”的推进，以所有基因编辑素材为对象，通过化学成分分析对素材进行筛选，并通过烟叶的配伍性测试和卷烟配方验证，确定工业可用性强的品种，成为了烟草行业迫切需求的关键技术内容。

水溶性糖是烟草中重要的常规化学成分，也是烟草质量评价的重要指标。目前烟草中水溶性糖的检测常用连续流动分析法。连续流动分析技术将标准工作液、试样、试剂按比例泵入化学分析器中，并同时定时送入气体，使管路中形成连续流体分隔系统，使参与反应的物质在连续流动的过程中充分混合，然后经过一系列反应如混合、加热、过滤等，最后通过检测器检测得到相应的峰值电信号，再通过标准曲线自动计算得到相应的浓度。连续流动分析技术具有检测速度快、样品和试剂用量少等优点，在国内外烟草行业得到了广泛应用。

在目前烟草常规化学成分分析的标准方法(YC/T 159-2002)中，水溶性糖的测定均采用5％的醋酸水溶液萃取样品，萃取液中的还原糖和对羟基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中生成黄色的偶氮化合物，然后再用连续流动分析仪分光光度检测器于410nm波长处测定。一方面，在样品前处理过程中，需将样品称取至磨口三角瓶中，加入萃取剂振荡萃取，用定性滤纸过滤，然后再将滤液转移至连续流动分析仪的进样管中，然后才能进行后续测定。在过滤的过程中，需将提取瓶中固体样品残渣与提取液的混合物倾倒于瓶口放置有定性滤纸折叠的漏斗中，将滤后的提取液收集在收集瓶中。样品前处理过程中需几次转移样品，不够简便，影响检测的工作效率；而且转移过程中可能会因引入杂质和提取液的不小心泼洒等影响到检测结果的可靠性。另一方面，烟草样品中含大量的棕黄色有色物质，样品萃取液呈黄色，和还原糖与对羟基苯甲酸酰肼显色产物吸收波长接近，每个样品背景吸收的不一致会干扰测定结果。

基因编辑工厂化育种至少会产生数万个编辑素材，目前水溶性糖样品分析的日样品处理量只有60个左右，完成数万个素材的常规化学成分分析需要很长周期，分析结果的滞后将会影响到整个工厂化育种的进度，因此在基因编辑育种过程中对准确可靠的高通量快速分析方法的需求非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因编辑素材水溶性糖测定的快速样品前处理方法，包括以下步骤：

A、准确称取0.25g含有水溶性糖的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；

B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入5％醋酸水溶液25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；

C、萃取完后把样品管的内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

优选地，所述样品管顶部带有密封圈，所述内套管在振荡萃取前插入到所述密封圈内，然后加入萃取液，把内套管卡在样品管的口部防止振荡过程中萃取液溅出，但内套管底部的过滤筛板不与样品接触；样品萃取完后把内套管下压，萃取液就通过筛板过滤进入到内套管中，自动进样器可直接从内套管中抽取样品进行分析。

优选地，在分析过程中，向萃取液中加入含有显色剂3,5-二硝基苯甲酸酰肼且含有50wt％异丙醇的溶液，萃取液中的总还原糖与3,5-二硝基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中生成红色的偶氮化合物，其最大吸收波长为480nm，于最大吸收波长处用分光光度法测定。其中加入异丙醇可有效防止显色剂在流动分析仪的管道上沉淀。

为了减少转移工作量，发明人还设计了与自动进样器的样品盘匹配的振荡器，可从自动进样器上取下样品盘，装满一盘样品后直接振荡萃取，萃取完后内套管过滤，整个样品盘再放到自动进样器上进行分析。整个操作流程不需要对具体的样品进行转移，样品前处理过程得到了大大简化，样品分析效率和目前烟草行业标准方法相比可提高数倍。而且转移步骤的减少可有效防止样品前处理操作过程中的出错，大大降低了人为误差的引入。

另外，常规烟草水溶性糖流动分析测定过程中，需把烟草打成细粉进行萃取，在常规方法样品前处理过程中细粉会部分糊化堵塞滤纸，过滤速度较慢，而在改进的处理方法中，振荡萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。

在常规连续流动分析方法中，水溶性糖的测定采用对羟基苯甲酸酰肼反应作为显色剂，萃取液中的还原糖和对羟基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中生成黄色的偶氮化合物，然后再用连续流动分析仪分光光度检测器于410nm波长处测定。由于烟草样品中含大量的棕黄色有色物质，样品萃取液呈黄色，和还原糖与对羟基苯甲酸酰肼显色产物吸收波长接近，每个样品背景的不一致会干扰测定结果。为了解决该问题，本发明中采用3,5-二硝基苯甲酸酰肼替代常规方法中的对羟基苯甲酸酰肼作为显色剂，显色产物的最大吸收波长红移到480nm，在480nm处，烟草萃取液基本没有背景吸收，和常规方法中的410nm波长测定相比，背景干扰大大降低。由于显色基团的吸光系数更高，方法的灵敏度也得到了提高。

在常规方法中，显色剂容易在管路上沉淀，时间长后管路会变为黄色，需经常清洗管路，因此在本发明中采用显色剂中含50％异丙醇的方法，可有效防止显色剂在管路上的沉积，需清洗管路的周期也大大延长。

显色剂的的配制方法为：准确称取50g的3,5-二硝基苯甲酸酰肼于500mL的烧杯中，加入1.0mol/L的盐酸250mL和异丙醇250mL，充分溶解后即可用作流动分析的显色剂。

样品分析时，流动分析操作按图3的进行；按烟草行业标准YC/T 159-2002(烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法)选定的条件进行测定，除显色剂以外的试剂，均按YC/T 159-2002的规定配制。测定时先用葡萄糖标准溶液做工作曲线，样品按顺序摆放在自动进样器上，每隔10个样品后放一个中等浓度的标准液作为质量控制(进样频率为每分钟1个样品)；分析工作完毕后，根据峰高从工作曲线上计算样品中水溶性糖含量。

由于连续流动分析法样品取样量小，对样品的均匀性要求比常规方法高，本发明中试验了样品粉碎粒径对测定结果的影响，结果表明：样品不过筛，测定结果的精密度较差，随过筛目数的增加，样品测定结果的精密度增加，当目数达到60目以上时，样品测定结果的精密度趋于稳定，测定的相对标准偏差(RSD)均在1％以下，因此本发明中选择粉碎并过60筛。

选取烤烟、香料烟、白肋烟和成品卷烟样品，分别按本发明的方法和烟草行业标准YC/T 159-2002(烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法)进行还原糖测定，并对结果进行了比较(表1)。本发明方法测定结果和目前在用烟草行业标准方法测定结果无显著差异，分析结果准确可靠。

表1本发明方法与现行标准的对比(％)

本发明的有益效果

项目组针对目前烟草中水溶性糖连续流动分析样方法中存在的不足，有针对性的设计了快速样品前处理方法。在改进分析方法中，整个操作流程不需要转移样品，样品前处理过程得到了大大简化。采用两个以上的样品盘交替处理(一盘进样、一盘前处理)，可不间断的进行分析，每天可处理8-10盘样品，按常规进样速度60样/h计算，每天可分析400个以上的样品，样品分析效率和目前烟草行业标准方法相比可提高数倍，并且实际样品分析结果和目前行业标准方法相符合。本发明为基因工厂化育种产生的海量编辑素材的高通量筛选提供了高通量快速分析方法，大大的加快了基因编辑素材筛选过程中水溶性糖分析的进程。

常规烟草水溶性糖流动分析测定过程中，需把烟草打成细粉进行萃取，在常规方法样品前处理过程中细粉会部分糊化堵塞滤纸，过滤速度较慢，而在改进的处理方法中，振荡萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉到底下，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现。

在常规连续流动分析方法中，水溶性糖的测定采用对羟基苯甲酸酰肼反应作为显色剂，检测波长为410nm。由于烟草样品中含大量的棕黄色有色物质，样品萃取液呈黄色，和还原糖与对羟基苯甲酸酰肼显色产物吸收波长接近，每个样品背景的不一致会干扰测定结果。本发明中还有针对性的采用3,5-二硝基苯甲酸酰肼，替代常规方法中的对羟基苯甲酸酰肼作物显色剂，显色产物的最大吸收波长红移到480nm，在480nm处，烟草萃取液基本没有背景吸收，和常规方法中的410nm波长测定相比，背景干扰大大降低。由于显色基团的吸光系数更高，方法的灵敏度也得到了提高。

在常规方法中，显色剂容易在管路上沉淀，时间长后管路会变为黄色，需经常清洗管路，因此在本发明中采用显色剂中含50％异丙醇的方法，可有效防止显色剂在管路上的沉积，需清洗管路的周期也大大延长。

附图说明

图1是本发明中使用的进样盘。

图2是本发明中使用的进样管以及内套管的示意图。其中a图是进样管；b图是内套管；c图为内套管插入进样管顶部时的示意图；d图为内套管向下压下的示意图；e图为内套管压到底完成原位过滤后又插入取样针吸取上清液的示意图。

图3是水溶性糖连续流动分析测定管路图。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

实施例1：烤烟样品中总糖的测定

1)样品前处理：首先将烟叶(或烟丝)烘干，用高速旋风磨对烟草及烟草制品进行细胞壁破壁，然后过60目筛网，密封保存为备样。按YC/T31-1996标准测试样品含水率，然后按以下处理：

A、准确称取0.25g样品于25mL改进的进样管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放满连续流动分析仪进样盘的100个进样管位；

B、用25mL的移液枪向每一样品管中分别加入5％的醋酸溶液25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；

C、萃取完后把样品管的内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

2)显色剂的的配制方法为：准确称取50g的3,5-二硝基苯甲酸酰肼于500mL的烧杯中，加入1.0mol/L的盐酸250mL和异丙醇250mL，充分溶解后即可用作流动分析的显色剂。其余试剂及标准溶液按照现行标准配制。

3)按照标准方法YC/T 159-2002(烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法)相关规定完成样品中水溶性糖的后续测定工作。

测得烤烟样品中总糖含量为23.91％。

实施例2：烤烟样品中还原糖的测定

重复实施例1中的过程，进行烤烟样品中还原糖的测定，测出还原糖含量为20.52％。

Claims (3)

1.一种用于烟草基因编辑素材中水溶性糖的高通量连续流动分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、准确称取0.25g含有水溶性糖的样品置于25mL样品管中，从连续流动分析仪自动进样器上取下进样盘，将称好样的进样管依次放到连续流动分析仪进样盘上，直至将该进样盘中的100个样品管位全部放满样品管；

B、用25mL的移液枪向每个样品管中分别加入5％的醋酸溶液25mL，然后依次插入底部带有0.45μm孔径的过滤筛板的内套管，防止振荡萃取过程中溶液溅出，插好内套管后把样品盘放到振荡器上，按标准方法选定的振荡萃取条件进行振荡萃取；

C、萃取完后把样品管的内套管下压，让萃取好的样品溶液通过所述过滤筛板进入到内套管中，再把样品盘放置到连续流动分析仪的自动进样器上，自动进样器的进样针每次仅插入到内套管中的上清液处以吸取过滤好的样品，转入连续流动分析仪中进行分析。

2.根据权利要求1所述的高通量连续流动分析方法，其特征在于，所述样品管顶部带有密封圈，所述内套管在振荡萃取前插入到所述密封圈内，然后加入萃取液，把内套管卡在样品管的口部防止振荡过程中萃取液溅出，但内套管底部的过滤筛板不与样品接触；样品萃取完后把内套管下压，萃取液就通过筛板过滤进入到内套管中，自动进样器可直接从内套管中抽取样品进行分析。

3.根据权利要求1所述的高通量连续流动分析方法，其特征在于，向萃取液中加入含有显色剂3,5-二硝基苯甲酸酰肼且含有50wt％异丙醇的溶液，萃取液中的总还原糖与3,5-二硝基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中生成红色的偶氮化合物，其最大吸收波长为480nm，于最大吸收波长处用分光光度法测定。