CN102033051B

CN102033051B - 植物中果胶含量的连续流动测定方法

Info

Publication number: CN102033051B
Application number: CN2011100071094A
Authority: CN
Inventors: 孔浩辉; 程志颖; 周瑢
Original assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: CN102033051A

Abstract

本发明公开一种植物中果胶含量的连续流动测定方法，包括如下步骤：1)将植物样品加入前处理液中，在水浴中加热回流；2)然后进行初次过滤，将初次过滤的滤渣用酸醇溶液冲洗；3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为1.5mol/L～2.5mol/L的提取液中，在水浴中加热回流；4)然后进行二次过滤，将二次过滤后的滤渣用酸溶液冲洗多次，随后将二次过滤后的滤液与冲洗液合并、定容，得到待检测液；5)将待检测液吸入到连续流动分析仪中，所述待检测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490nm～540nm波长下进行检测。本发明具有检测结果准确的优点。

Description

植物中果胶含量的连续流动测定方法

技术领域

本发明涉及植物组分的提取，尤其涉及一种植物中果胶含量的连续流动测定方法。

背景技术

在植物中果胶含量的测定中，常需用到显色法检测，但在显色法检测时，由于色素会有一定吸光度，从而对显色法造成干扰，同时糖会与显色剂反应形成有色物质，这也会对显色法造成干扰，所以在测定过程中，通常都需要先进行除糖、除色素的前处理。在植物中果胶含量的测定中，常用的样品前处理方法是：将植物粉末样品用浓度为80％的乙醇溶液加热回流1小时，去除滤液，余下滤渣再做进一步的提取处理，用于其它检测，此种方法一般称为乙醇处理法，但这种乙醇处理法存在的问题是：只能除去小分子水溶性糖，同时对色素的提取也有一定局限性。而在滤渣处理时，有时候需要用酸液提取，这就造成之前来被提取出来的多糖水解而被提取出来，而由于酸的作用破坏了细胞壁，使之前来能溶解出来的色素也被提取出来，从而影响最终检测结果。在进行完前处理后，要对经过前处理的样品进行检测。现有的检测方法有重量法，由于果胶不是单纯半乳糖醛酸的聚合，在采用重量法检测时，支链上的中性糖和α-L-(1→2)鼠李糖，以及甲酯化基团、乙酰化基团同时被沉淀下来，所以其重量必然高于对半乳糖醛酸累计量。因此，重量法检测结果无法反映出样品中半乳糖醛酸的含量情况，即无法反映出样品中表征果胶特性的半乳糖醛酸支链骨架的含量情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种植物中果胶含量的连续流动测定方法，检测结果更加准确。

本发明提供的一种植物中果胶含量的连续流动测定方法，包括如下步骤：

1)将植物样品加入前处理液中，在水浴中加热回流；

2)然后进行初次过滤，将初次过滤的滤渣用酸醇溶液冲洗；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为1.5mol/L～2.5mol/L的提取液中，在水浴中加热回流；

4)然后进行二次过滤，将二次过滤后的滤渣用酸溶液冲洗多次，随后将二次过滤后的滤液与冲洗液合并、定容，得到待检测液；

5)将待检测液吸入到连续流动分析仪中，所述待检测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490nm～540nm波长下进行检测；

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.005mol/L～0.05mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为60％～80％。

优选地，所述酸醇溶液选用盐酸或醋酸制成。

优选地，所述酸醇溶液选用乙醇、异丙醇、甲醇中的任一种制成。

优选地，所述提取液为氢离子浓度为1.5mol/L～2.5mol/L的盐酸溶液。

优选地，步骤1)中，在80℃～100℃的水浴中加热回流10min～60min。

优选地，步骤3)中，在80℃～100℃的水浴中加热回流1h～3h。

优选地，所述初次过滤、二次过滤均采用玻璃纤维滤片、活性炭纤维滤片、聚乙烯滤片、不锈钢烧结滤片、陶瓷烧结坩埚、玻璃烧结坩埚中的任一种进行过滤。

优选地，步骤5)中将待检测液与强酸性分解试剂通过螺旋管混合，在待检测液与强酸性分解试剂反应过程中加热，而后冷却。

优选地，所述植物样品为粉末状。

优选地，步骤1)中，所述植物样品体积较大时，加入前处理液后先搅拌成浆，再进行水浴加热回流。

优选地，所述显色剂为对羟基联苯溶液，所述对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg～500mg对羟基联苯及3g～5g氢氢化钠。

优选地，所述强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3g～6g的四硼酸钠。

优选地，在待检测液与强酸性分解试剂反应过程中加热的温度为90℃～99℃。

优选地，冷却采用匝数为20匝～50匝的冷却管冷却。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

一、由于采用酸醇溶液作为前处理液对植物样品进行处理，再用氢离子浓度为1.5～2.5mol/L的提取液进行提取，从而得到待检测液，因此，具有如下优点：

1、由于前处理液含有醇，醇可以有效提取植物样品中的糖和色素，并可以沉淀果胶；

2、由于前处理液含有酸，在酸性条件下，使植物样品中部分多糖水解成低分子糖，一并被提取出来，避免多糖在其后酸解时水解释放出来而干扰样品的显色检测；

通过酸化作用可以破坏植物样品的细胞壁，使包裹在里面的色素和糖类组分更容易被提取出来，从而大幅缩短除糖、除色素的时间，也有利于其后果胶的提取，可减少其后的样品果胶萃取时间；

此外，适当浓度氢离子的存在，可以破坏植物组分表面的水化层和电荷，从而有利于果胶、蛋白质等大分子植物组分的沉淀，减小植物组分的溶解和水解造成的损失，提高后续测定的准确性。但酸性过强会使植物组分水解成为水溶性组分，本发明中的酸醇溶液，氢离子浓度在0.005mol/L～0.05mol/L之间，能够有利于植物组分的沉淀，而又不会使植物组分水解成为水溶性组分；

3、较之现有技术-乙醇处理法只能除去小分子水溶性糖的局限，本发明采用酸醇溶液处理可以使植物中的多分子糖类水解并被提取出来，避免了在其后酸解浸提果胶时，多分子糖类水解被提取出来，避免糖类组分与显色剂发生反应显色而对检测造成干扰；

二、由于采用连续流动法对经过处理得到的待检测液进行检测，将待检测液吸入连续流动分析仪中，与强酸性分解试剂反应，对待检测液中果胶进行腐化、分解，因而使得检测过程更加容易。

附图说明

图1是本发明植物中果胶含量的连续流动测定方法的流程图；

图2是本发明中利用连续流动分析仪的检测流程图；

图3是半乳糖醛酸标准溶液显色后的吸光度扫描谱图；

图4是样品提取液显色后的吸光度扫描谱图；

图5是分析仪吸光度扫描图之一；

图6是标准曲线描图之一；

图7是分析仪吸光度扫描图之二；

图8是标准曲线扫描图之二。

具体实施方式

为使本发明的发明目的、技术方案更加清楚，以下通过实施例进行详细说明。

参见图1，本发明的植物中果胶含量的连续流动测定方法，包括如下步骤：

S1、将植物样品加入前处理液中，在水浴中加热回流；

设置此步骤，可以使植物样品中的糖和色素被前处理液提取，除去植物样品中影响检测结果的糖和色素；

S2、然后进行初次过滤，将初次过滤的滤渣用酸醇溶液冲洗多次；

经过过滤得到的滤渣，再用酸醇溶液冲洗多次，可以将滤渣上附着的滤液极大程度地去除；

S3、再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为1.5～2.5mol/L的提取液中，在水浴中加热回流；

通过此步骤，使得滤渣中的果胶被提取液提取出来；

S4、然后进行二次过滤，将二次过滤后的滤渣用酸溶液冲洗多次，随后将二次过滤后的滤液与冲洗液合并、定容，得到待检测液；

通过此步骤，使得提取液中提取得到的果胶能够充分收集，得到待检测液，以使最终检测结果更加准确；

S5、将待检测液吸入到连续流动分析仪中，所述待检测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490nm～540nm波长下进行检测；

待检测液通过与强酸性分解试剂反应，使得果胶腐化，转化为可以显色的衍生物，从而更便于光度检测；

其中，前处理液为酸醇溶液，该酸醇溶液的氢离子浓度为0.005mol/L～0.05mol/L，以体积百分比计，该酸醇溶液的醇浓度为60％～80％。

其中，显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300～500mg(优选400mg)对羟基联苯及3～5g氢氢化钠(优选4g)。

其中，强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3～6g(优选4.8g)的四硼酸钠。

其中，强酸性分解试剂采用两根泵管或三根泵管并联向连续流动分析仪进样；单泵管流量控制在0.6ml/min～1.2ml/min，总流量控制为1.6ml/min～3.0ml/min，强酸性分解试剂的流量与进样量的比例关系是：13.0∶1～30∶1(优选是16∶1～20∶1)。

下面通过具体的实施例对本发明进行进一步描述。

实施例一

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在100℃的水浴中加热回流10min；

2)然后采用玻璃纤维滤片进行初次过滤，将初次过滤的滤渣用酸醇溶液冲洗多次；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为1.5mol/L的提取液中，在100℃的水浴中加热回流2h；

4)然后采用玻璃纤维滤片进行二次过滤，将二次过滤后的滤渣用酸溶液冲洗多次，随后将滤液与冲洗液合并，定容，得到待检测液；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至90℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在510nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.005mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为60％。

其中，玻璃纤维滤片也可采用其它不含植物纤维的滤片代替。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解400mg对羟基联苯及4g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为；1000mL浓度为93％的浓硫酸中溶解3.5g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为35匝。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为30匝，冷却水入口直接连接到水龙头处，冷却水流量和螺旋管匝数的设置，以使冷却后流程管路温度接近室温为适宜。

实施例二

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在80℃的水浴中加热回流60min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2.5mol/L的提取液中，在85℃的水浴中加热回流1h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至95℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在540nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.05mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为80％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg对羟基联苯及3g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为；1000mL浓度为92％的浓硫酸中溶解3g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为64匝。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为40匝。

实施例三

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在90℃的水浴中加热回流40min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2mol/L的提取液中，在90℃的水浴中加热回流1.5h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至96℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在520nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.01mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为70％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解360mg对羟基联苯及5g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为94％的浓硫酸中溶解6g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为35匝。

实施例四

1)将植物样品加入前处理液中，加入前处理液后先搅拌成浆，在85℃的水浴中加热回流35min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2.3mol/L的提取液中，在98℃的水浴中加热回流1.2h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至93℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在500nm波长下进行检测。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解400mg对羟基联苯及4.5g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为95％的浓硫酸中溶解5g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为35匝。

实施例五

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在82℃的水浴中加热回流38min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为1.8mol/L的提取液中，在82℃的水浴中加热回流2.7h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至98℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在510nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.03mol/L，以体积百分比计，所述酸-醇溶液的醇浓度为79％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解420mg对羟基联苯及4.6g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为96％的浓硫酸中溶解4.5g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的螺旋管匝数为35匝。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为35匝。

实施例六

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在90℃的水浴中加热回流20min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2.3mol/L的提取液中，在90℃的水浴中加热回流1.8h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至97℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在510nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸-醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.008mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为68％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解480mg对羟基联苯及4.3g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为97％的浓硫酸中溶解5.5g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的螺旋管匝数为64匝。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为30匝。

实施例七

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在98℃的水浴中加热回流18min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2.1mol/L的提取液中，在82℃的水浴中加热回流2h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至91℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在520nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.005mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为70％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解490mg对羟基联苯及3.9g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为98％的浓硫酸中溶解5.3g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为40匝。

实施例八

1)将粉末状植物样品加入前处理液中，在80℃的水浴中加热回流50min；

3)再将冲洗后的滤渣加入到氢离子浓度为2.0mol/L的提取液中，在80℃的水浴中加热回流2.6h；

5)将待检测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至99℃，待检测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在540nm波长下进行检测。

其中，所述前处理液为酸-醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.012mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为74％。

其中，步骤5)中的检测流程参见图2。

其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解500mg对羟基联苯及3.1g氢氢化钠。

其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为99％的浓硫酸中溶解6g的四硼酸钠。

其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为50匝。

以下通过实验证明本发明植物中果胶含量的连续流动测定方法的测定效果。

一、提取液浓度的选取

前处理：准确称取0.1g粉末状植物样品，用100mL氢离子浓度为0.01mol/L、醇含量80％的盐酸-乙醇溶液，在90℃水浴条件下加热回流20min，过滤除去糖类组分和色素，将滤渣供下一步提取待测组分用。

果胶提取：用100mL不同浓度盐酸溶液作为提取液对滤渣进行果胶的酸解提取，在水浴90℃的条件下回流2h后过滤，滤液冷却后定容到250mL，并用连续流动分析法检测，比较检测结果(用质量百分比表示)的差异。同时，对提取后的滤渣再用浓度2mol/L的盐酸水浴提取2小时，提取液再次用连续流动分析法检测，看第一次提取后滤渣残留下来的果胶含量。

表1：酸解样品的果胶检测结果

盐酸浓度(mol/L)	滤液，％	滤渣，％	滤渣/滤液，％
				0.05	5.87	1.31	22.3％
0.1	6.23	1.01	16.2％
				0.5	9.37	0.46	4.91％
1.0	9.85	0.32	3.25％
				1.5	9.88	0.07	0.71％
2.0	10.18	0.06	0.59％
				2.5	10.17	0.07	0.69％

由表1数据看，当作为提取液的盐酸浓度达1.5mol//L，滤渣残留果胶量少于1％。因此，提取液——盐酸的浓度是1.5～2.5mol/L时，可以有效提取样品中的果胶，其中，优选2.0mol/L的盐酸。

二、萃取试样基底颜色的干扰

实验方案：将待检测液(即提取了果胶的提取液)作为试样注入连续流动分析仪中，在不加入显色剂的情况下，用紫外-可见分光光度计对分析仪流出(与除显色剂外的其他溶剂混合后)的溶液进行吸光度扫描，检测结果见表2。

表2：待测试样流经分析仪后的吸光度扫描结果

由表2的实验数据可知，待检测液中所含色素极少，待检测液的本底颜色在果胶检测波长范围附近对显色检测法的干扰很小，不会对拟采用的光度检测法造成干扰。

三、测定波长的设定

实验方案1：移取1mL半乳糖醛酸标准溶液(半乳糖醛酸浓度为50mg/L)置于20mL具塞试管，加入四硼酸钠-硫酸溶液6mL，待冷却后用移液枪加入1mL间羟基联苯溶液(显色剂)，混匀后超声振摇5min除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用紫外可见分光光度计在350nm～800nm波长范围内扫描。扫描结果如图3所示。

实验方案2：准确称取0.1g样品，分别用酸醇溶液和80％乙醇溶液处理，而后用2mol/L盐酸作为提取液提取，将提取了果胶的提取液定容到250mL，作为待检测液。分别取1ml两种不同的待检测液，置于20mL具塞试管中。而后分别加入6ml四硼酸钠-硫酸溶液，待其冷却后，加入1ml间羟基联苯溶液，混匀后超声振摇5min除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用紫外可见分光光度计在400-650nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长，扫描结果见图4。

由图3可见：半乳糖醛酸标准溶液显色后最大吸收波长为520.89nm；参见图4，曲线B为采取酸醇溶液除糖的样品扫描结果，曲线C为采取醇溶液除糖的样品扫描结果，由图4可见，不论何种前处理方式，待检测液中果胶组分显色后的最大吸收波长约为510nm(分别为507.90nm和508.03nm)。而在490nm～540nm波长范围内，测定波长变动5nm，样品显色出峰值波动小于5％。因此，合适的测定波长范围是490nm～540nm，优选波长范围是510nm～520nm。

四、糖含量对检测结果的干扰

经过试验检测，待检测液(即提取了果胶的提取液)中，糖的含量低于2.5％。试验方案与结果如下：

试验方案：采用烤烟(1#)和白肋烟(2#)两个样品，按照本发明的方法进行处理，制得待检测液，将待检测液采用连续流动分析法测定其中的水溶性总糖含量。

表3：酸解样品的糖含量检测结果

由上表数据可以看到，待检测液中的糖含量水平较低，其对果胶检测结果的干扰，通过下一步试验检验。

实验方案：为检查糖类组分对本发明连续流动测定法的干扰，制备浓度为20～100mg/L的各类糖(浓度是实际样品含糖量的2～10倍，是果胶含量的0.5～2.5倍)的待检测液，按照果胶检测法用连续流动法检测，检测结果见表4。

注：按照样品的前处理方案：称取0.1g烟末样品进行提取，提取液定容到250mL，在果胶含量为10％时，果胶浓度为40mg/L；在总糖含量为2.5％时，总糖浓度为10mg/L。)

表4：采用对羟基联苯显色法时不同糖类组分的检测结果(按半乳糖醛酸计)

注：由于组分显色后出峰高度很低，远小于最低浓度标液的出峰高度，接近于基线，因此检测结果波动性较大。

由表4的实验数据分析，不论是对于阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等单糖，还是蔗糖、乳糖等二糖，即使把试样中糖的浓度提高到正常情况的2～10倍，被误测定为果胶的值也十分低。因此，在本发明中的前处理方式和显色条件下，连续流动检测步骤中糖类组分对果胶检测结果的干扰很小。(但这也说明了必须进行除糖处理，因为不除糖时，烟草样品糖含量就不是2.33％而是20％甚至30％、40％——用了酸水解，所以提取到的糖含量会高于水溶性糖的含量。)

五、本发明的连续流动检测过程中参数的选取

本实验中的基本流程设计条件如下：

1)试样(待检测液)流量为1.0mL/min，硫酸总流量为1.8mL/min，即硫酸流量与进样量比为18∶1；

2)加热温度98℃，加热螺旋管数35匝；

3)冷却管匝数30匝。

在以下各单项实验中，只改变所实验项的条件，其余条件不变。

1、流量比例的选取

通过调节硫酸管路的数目和流量及调节进样管流量，来调节硫酸流量与进样量的比值：保持硫酸的总流量为3.0mL/min，调节试样管流量为0.32、0.23、0.10mL/min；保持试样管流量为0.10～0.23mL/min，调节硫酸的总流量为2.0、1.8、1.6mL/min。检测结果见表5，其中流量比为13.0∶1时分析仪的吸光度扫描图和标准曲线图见图5和图6，18.0∶1时的吸光度扫描图和标准曲线图见图7和图8。

表5：不同硫酸流量条件下标准曲线的相关系数R值大小

由表5以及图5和图6可以看出，当硫酸的流量与进样量比例关系较小时，低含量果胶出峰高度偏高，高含量果胶出峰高度偏低，造成果胶含量的检测结果偏低。这反映出果胶组分的显色反应来能充分完成，从而影响测定准确性。而当硫酸的流量与进样量比例关系合适时，则标准曲线的相关系数R值可达到0.999以上(参见图7和图8)。因此，合适的流量比为13∶1～30∶1，优选16∶1～20∶1。

2、加热温度的选取

调节加热器温度，并比较果胶含量检测值，结果见表6：

表6：不同加热条件下的果胶检测结果

注：最高设定温度没有达到100℃，是因为此温度下会出现螺旋管内气泡混乱的现象，使吸光度扫描图变得混乱，检测结果不稳定。

由表6数据可以看到，当硫酸与样品的反应温度较低时，检测结果偏低，反应出样品的反应不完全。因此，合适的加热温度是90℃～99℃，优选98℃(因为达到100℃时，管路流程中有时会出现气泡紊乱的现象)。

3、冷却螺旋管数(冷却时间)的选择

表7：不同冷却条件下的果胶检测结果

由表7数据看，当冷却管匝数达到30匝时，已经可以把反应后试样温度降低到室温附近，从而避免对光度比色池和废液管的损害。但冷却管匝数不宜太多，因为检测中发现，冷却管匝数达到60匝时，虽然检测结果没有太大变化，但样品的出峰高度出现较明显下降，反映此条件下已超出样品的合适显色反应时间段。所以，合适的冷却管匝数是20～50匝。

六、本发明测定方法的时间稳定性和检测结果重复性

实验方案：准确称取0.1g烟末样品，用100mL氢离子浓度为0.01mol/L、醇含量80％的盐酸-乙醇溶液，在90℃水浴条件下加热回流20min后过滤，滤渣用酸醇溶液多次冲洗。而后，冲洗后的滤渣用100mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，在90℃下回流2h后过滤，过滤后得到的滤渣用盐酸溶液冲洗。合并滤液，冷却后定容到250mL得到待测试样。对试样存放不同时间后，用连续流动分析仪进行检测，检测结果见表8：

表8：不同存放时间试样的果胶含量检测结果

由表8数据分析，采用酸解法处理样品，长期存放时会发生果胶检测结果逐渐变小的现象，表明酸解法的确存在使半乳糖醛酸进一步降解的情况。但变小的幅度很小，24小时内小于1％(为0.6％)，48小时内约为3％(为3.3％)，72小时后大于5％(为7.04％)。因此可认为，存放时间长短对酸解-连续流动法检测果胶含量的结果影响不大。

由表8数据还可以看出，同一样品在不同轮次试验中的检测结果保持稳定。

七、本发明测定方法的回收率

准确称取0.1g样品，加入100mL氢离子浓度为0.01mol/L、醇浓度80％的酸醇溶液，在90℃水浴条件下加热回流20min。采用玻璃纤维滤片进行过滤，滤渣用酸醇溶液冲洗3～5遍。将样品前处理后所得滤渣转移到三角瓶中，加入100mL氢离子浓度为2mol/L的盐酸，在90℃水浴条件下加热回流2h。采用玻璃纤维滤片进行过滤，滤渣用酸溶液冲洗3～5遍。合并滤液与冲洗液，冷却后定容到250mL，得到待测试样。经处理后的待测试样，被连续流动分析仪吸入，与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后与显色剂(对羟基联苯溶液)反应显色，在520nm波长检测。分析仪流程参见图1：

表9：不同硫酸流量条件下标准曲线的R值大小

果胶添加量，mg	换算成半乳糖醛酸，mg	测定值，mg	回收率，％
				0	0	10.2	-
9.8	7.45	17.8	102.0
				21.7	16.49	27.3	103.7
28.5	21.67	32.5	102.9

注：表中数据为3次重复测试的结果。

由表9可以看到，本发明的连续流动测定方法的回收率为102％～104％，满足定量检测要求。

八、对比实验

实验方案：采用现有技术中的重量法以及本发明的连续流动测定法，对同一个烟草样品进行果胶含量的检测，比对检测结果的差异性，结果参见表10。

重量法：准确称取1g(精确到0.0001g)烟末样品，在200mL无水乙醇中回流20min后抽滤，滤渣在100mL 80％的乙醇中回流20min。而后抽滤，将得到的滤渣加入200mL的硫酸溶液(pH＝2)，在90℃下提取1.5h后趁热抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3次，提取液经浓缩后在乙醇中沉淀，将沉淀过滤，干燥后称量沉淀质量。

本发明的连续流动测定法：准确称取0.1g(精确到0.0001g)烟末样品，用100mL氢离子浓度为0.01mol/L、醇含量80％的盐酸-乙醇溶液，在90℃水浴条件下加热回流20min，过滤、酸醇溶液洗涤，而后滤渣用100mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，在水浴90℃的条件下回流2h后过滤，滤渣用盐酸溶液(2mol/L)冲洗。合并滤液，冷却后定容到250mL，得到待检测液，待检测液采用四硼酸钠-浓硫酸溶液以连续流动分析仪处理，加入对羟基联苯显色，在520nm波长下进行测定。

表10：不同测定方法果胶的检测结果

样品	重量法，％	本发明连续流动测定，％
			1#	12.60	9.98
2#	12.54	10.03

由表10的数据可以得出：

重量法检测结果高于连续流动法的检测结果。这是由于果胶不是单纯半乳糖醛酸的聚合，在采用重量法检测时，支链上的中性糖和α-L-(1→2)鼠李糖，以及甲酯化基团、乙酰化基团同时被沉淀下来，所以其重量必然高于对半乳糖醛酸累计量。因此，重量法的检测结果要高于连续流动法的测定值，重量法检测结果无法反映出样品中果胶含量的半乳糖醛酸情况。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将植物样品加入前处理液中，在水浴中加热回流；

2)然后进行初次过滤，将初次过滤的滤渣用酸醇溶液冲洗；

其中，所述前处理液为酸醇溶液，所述酸醇溶液的氢离子浓度为0.005mol/L～0.05mol/L，以体积百分比计，所述酸醇溶液的醇浓度为60％～80％；

步骤1)中，在80℃～100℃的水浴中加热回流10min～60min；

步骤3)中，在80℃～100℃的水浴中加热回流1h～3h；

步骤5)中将待检测液与强酸性分解试剂通过螺旋管混合，在待检测液与强酸性分解试剂反应过程中加热，而后冷却；

所述显色剂为对羟基联苯溶液，所述对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg～500mg对羟基联苯及3g～5g氢氧化钠；

所述强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3g～6g的四硼酸钠；

在待检测液与强酸性分解试剂反应过程中加热的温度为90℃～99℃；

冷却采用匝数为20匝～50匝的冷却管冷却；

硫酸的流量与进样量的流量比为13∶1～30∶1。

2.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，所述酸醇溶液选用盐酸或醋酸制成。

3.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，所述酸醇溶液选用乙醇、异丙醇、甲醇中的任一种制成。

4.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，所述提取液为氢离子浓度为1.5mol/L～2.5mol/L的盐酸溶液。

5.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，所述初次过滤、二次过滤均采用玻璃纤维滤片、活性炭纤维滤片、聚乙烯滤片、不锈钢烧结滤片、陶瓷烧结坩埚、玻璃烧结坩埚中的任一种进行过滤。

6.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，所述植物样品为粉末状。

7.根据权利要求1所述的植物中果胶含量的连续流动测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述植物样品体积较大时，加入前处理液后先搅拌成浆，再进行水浴加热回流。