CN103232972B

CN103232972B - 一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺

Info

Publication number: CN103232972B
Application number: CN201310127152.3A
Authority: CN
Inventors: 韦剑; 黄明; 陈建农; 王灿顶; 邱壮伟; 丘力功; 符美娟; 蔡小杰
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-04-15
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-04-15
Also published as: CN103232972A

Abstract

本发明公开了一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺，包括如下步骤：（1）配制培养基原液；（2）将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉；（3）往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品。本发明的工艺通过在冻干阶段的二次干燥结束后通入含有一定氮氧比例的混合气体，出乎意料地提高了培养基冻干粉的活性及稳定性。即使放置一段时间后，利用冻干粉复溶液进行人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析，“淋巴细胞转化率”及“分裂相指数”这两个关键性活性指标保持稳定，且显著高于传统的液体培养基。且本发明的工艺制备得到的淋巴细胞培养基冻干粉保存时间长、效果稳定，贮存、携带及运输方便，实现了淋巴细胞培养基的商品化。

Description

一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺

技术领域

本发明涉及一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺。

背景技术

传统的用于外周血淋巴细胞染色体制备采用的培养基一般为在液体状态的基础培养基（如RPMI1640）的基础上添加一定量血清和植物血球凝集素（PHA）而成。利用PHA对处于G₀期的淋巴细胞的刺激作用，使之进入分裂周期，从而能进行染色体核型分析。但液体状态的淋巴细胞培养基不利于室温下存放，其包含的活性物质如谷氨酰胺、PHA等易失活。即使在2-8℃低温存放，经一段时间后培养基的培养的淋巴细胞中可进行核型分析的处于分裂相数目显著下降。

利用冻干技术制备培养基冻干粉是解决上述问题的方法。但到目前为止，并没有发现提供具体的培养基冻干工艺或方法的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于淋巴细胞培养的培养基冻干粉生产工艺。

本发明所采取的技术方案是：

一种淋巴细胞培养基的冻干粉生产工艺，包括如下步骤：

（1）配制培养基原液；

（2）将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉；

（3）往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品。

所述培养基原液含有如下组分：小牛血清、L型植物血球凝集素、RPMI1640培养基干粉、谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠。

所述培养基原液中各组分的浓度为：小牛血清780～820 g/L、L型植物血球凝集素为8～12 mg/L、RPMI1640培养基干粉为9.5～10.5 g /L、谷氨酰胺为40~60 mM/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸为45~55 mM/L、碳酸氢钠为6.8~7.2 g/L。

优选的，所述培养基原液中各组分的浓度为：小牛血清800 g/L、L型植物血球凝集素为10 mg/L、RPMI1640培养基干粉为41.0 g/L～42.0 g /L、谷氨酰胺为50 mM/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸为50 mM/L、碳酸氢钠为7.0 g/L。

步骤（2）所述过滤是指先用1um孔径的滤器进行预过滤，然后用0.22 um孔径的滤器进行无菌过滤。

步骤（2）冷冻干燥工艺包括：

1）预冻：箱内温度降至－35～－45℃，保持3～5小时；

2）升华：将冷凝器的温度降到－45～－55℃以下，对整个系统抽真空；

3）升华开始，控制真空度在10pa以下，搁板温度控制在－19～－21℃，升华干燥11～13小时；

4）二次干燥：提高板层温度至7～9℃干燥3～5小时。

步骤（2）冷冻干燥工艺包括：

1）预冻：箱内温度降至－40℃，保持4小时；

2）升华：将冷凝器的温度降到－50℃以下，对整个系统抽真空；

3）升华开始，控制真空度在10 pa以下，搁板温度控制在－20℃，升华干燥12小时；

4）二次干燥：提高板层温度至8℃干燥4小时。

步骤（3）的操作为：冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到期0.9～1.1个标准大气压，然后压塞，出箱。

所述混合气体中氧气和氮气的体积比为5～10：90～95。

优选的，所述混合气体中氧气和氮气的体积比为7：93

由以上工艺制备得到的冻干粉，用无菌水复溶后，用于人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析。

本发明的有益效果是：

（1）本发明的工艺通过在冻干阶段的二次干燥结束后通入含有一定氮氧比例的混合气体，出乎意料地提高了培养基冻干粉的活性及稳定性。即使放置一段时间后，利用冻干粉复溶液进行人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析，“淋巴细胞转化率”及“分裂相指数”这两个关键性活性指标保持稳定，且显著高于传统的液体培养基。

（2）本发明的工艺制备得到的淋巴细胞培养基冻干粉保存时间长、效果稳定，贮存、携带及运输方便，实现了淋巴细胞培养基的商品化。

（3）本发明的冻干工艺无须加入赋形剂，可以降低赋形剂对细胞培养的不良影响，且降低生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

本发明的冻干培养基和传统的液体培养基活性、稳定性研究结果比较

1、按表1配方的顺序分别配制本发明的冻干用的5倍浓缩培养液和传统的液体培养基。其中，RPMI1640干粉来源于GIBCO公司，新生小牛血清来源于杭州四季青公司。各材料加好后用磁力搅拌子以300 rpm于室温下搅拌两小时溶解。

2、分别将两种溶液过滤：溶解后的溶液先用1 um孔径的滤器进行澄清预过滤，然后再用0.22 um孔径的滤器进行无菌过滤。所用滤器为5英寸筒式滤器，对应的1 um和0.22 um滤芯皆为PES材质；过滤流速设为1 L/hr。非浓缩的液体培养基过滤步骤和浓缩培养液的过滤步骤相同。

3、灌装：无菌过滤后的浓缩培养液灌装量为1.0 mL，非浓缩培养基灌装量为5.0 mL。所用容器皆为20 mL西林瓶。

4、灌装完成后非浓缩培养基压盖，抽样贮存备用；5倍浓缩培养基进行冻干步骤。冷冻干燥步骤为：

（1）预冻：箱内温度降至-40℃，保持4小时。

（2）升华：将冷凝器的温度降到－50℃以下，对整个系统抽真空，控制真空度在10 pa以下，搁板温度控制在－20℃，升华干燥12小时。

（3）二次干燥：提高板层温度至8℃，进行二次干燥(8℃干燥4小时)。

（4）通入混合气体：二次干燥后，打开箱体的气源开关输入混合气体，使箱内压力达到1个标准大气压，其后样品压塞，出箱。所述混合气体由7%的氧气和93%的氮气组成，按体积计。

5、制备后的冻干粉于室温或2℃-8℃低温保存，使用时每瓶加入5.0 mL的无菌注射用水复溶。溶解后的液体培养基用于人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析。

6、培养基制备的工艺过程数据和收率统计见表2。

7、细胞培养效果检测方法

非浓缩的培养基和5倍浓缩的冻干培养基复溶后按下列步骤进行细胞培养效果检测：

（1）在无菌操作工作台上，加0.5 mL外周血至含5 mL培养基的培养瓶中；

（2）将样品混匀，置37℃恒温箱中培养约72小时，每24小时轻轻摇晃一次培养瓶；

（3）培养结束前2-4小时前加入秋水仙酰胺至终浓度为0.5 ug/mL；

（4）将细胞悬液加入10 mL离心管，以1000转/分钟离心10分钟；

（5）去上清，留细胞团；

（6）低渗：加入37℃ 0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴3-5分钟；

（7）预固定：加入1.5 mL甲醇：冰醋酸=3：1的固定液，轻轻混匀，37℃水浴5分钟，以1000转/分钟离心10分钟。去上清约留0.5 mL；

（8）固定：加入固定剂8 mL，37℃水浴5分钟，以1000转/分钟离心10分钟。去上清约留0.5 mL；

（9）重复步骤8一次，其后1000转/分钟离心10分钟，去上清，视管底细胞量加入适当几滴固定剂；

（10）滴片、烤片：每片1-2滴，75℃烘烤3小时；

（11）GIEMSA染色后检测淋巴细胞转化率和分裂相比例。

8、稳定性检测结果

将样品于室温闭光下保存，于不同时间抽样进行培养效果检测，结果见表3。

从检测结果可见，按传统方法配制的液体培养基在室温保存下10天内就质量就有明显下降，至30天时已完全不可用；而本发明的冻干培养基室温下于30天内检测效果无明显区别。

实施例2

不同配方或冷冻干燥工艺制备的淋巴细胞培养基冻干粉效果比较

本发明的冻干淋巴细胞培养基工艺与其他冻干培养基工艺的不同点和培养结果见表4。其中工艺1-3的具体工艺参数同实施例1，仅氮气和氧气的比例不同；工艺4通入的气体为普通空气，其他工艺参数同实施例1；工艺5由于溶解甘露醇的需要，需添加灌装体积，故相应调整了升华和二次干燥的过程参数，通入的气体为普通空气。

从表4可以看出，添加甘露醇的工艺5制备的冻干粉复溶液渗透压值已超过正常的淋巴细胞培养的上限值（290mOSM），相应的培养效果亦很差。

工艺4与本发明工艺的唯一区别在于冻干后通入的是普通的无菌过滤空气。从结果来看，工艺2的培养效果在分裂相指数方面与本发明工艺相比亦差异显著。

从以上实验可见，本发明的工艺能够显著提高淋巴细胞培养基的稳定性。即使于室温下放置一段时间后，利用冻干粉复溶液进行人外周血淋巴细胞培养和染色体核型分析，“淋巴细胞转化率”及“分裂相指数”这两个关键性活性指标保持稳定，且显著高于传统的液体培养基。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

Claims

1.一种淋巴细胞培养基的冻干粉生产工艺，包括如下步骤：

（1）配制培养基原液；

（2）将培养基原液过滤、冷冻干燥，得到冻干粉；

（3）往冻干粉中通入含有氮气和氧气的混合气体，即得产品；

步骤（1）所述培养基原液中各组分的浓度为：小牛血清800 g/L、L型植物血球凝集素为10 mg/L、RPMI1640培养基干粉为41.0 g/L～42.0 g /L、谷氨酰胺为50 mM/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸为50 mM/L、碳酸氢钠为7.0 g/L；

步骤（2）冷冻干燥工艺包括：

1）预冻：箱内温度降至－40℃，保持4小时；

4）二次干燥：提高板层温度至8℃干燥4小时；

步骤（3）的操作为：冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到1.0个标准大气压，然后压塞，出箱；所述混合气体中氧气和氮气的体积比为5～10：90～95。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤（2）所述过滤是指先用1um孔径的滤器进行预过滤，然后用0.22um孔径的滤器进行无菌过滤。

3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述混合气体中氧气和氮气的体积比为7：93。