JPS63500264A - 哺乳動物およびその代りのテストキットにおける病理学的条件の存在とモニタリングを決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の　土とモニタリン　を゛　する 本発明は哺乳動物およびその代りのテストキットにおいて存在する既知の病理学 的状態をモニターするために、血液学的液体を試験する方法、およびもつと詳し く言うと、哺乳動物における病理学的状態あるいは条件の存在を試験し、決定す る方法に関する。

年１回の身体検査の過程の間に無症候性の者に実施される通例の診断テストは、 完全血球計算（ＣＢＣ）　、血液化学（例えば、グルコースあるいは電解質レベ ル）および尿分析（グルコース、ケトンなどのテスト）を含む。時によっては、 これらのテストは身体検査だけでははっきりしなかった病気を発見することがあ る。これらの常用スクリーニングテネトは、陥、リューマチ、エイズ、心臓疾患 、血液疾患などを含む大多数の者を死亡させ、無能力にする疾病を初期段階で発 見することには役に立たないであろう。このような疾病は部分的には血液凝固あ るいは免疫反応システム、または両者の何れかの異常によって特徴づけることが できる。

現在、哺乳動物における病理学的状態または条件、例えば癌、エイズ、敗血症な どの検出は一般に哺乳動物が何らかの異常な身体反応、例えばエネルギーの喪失 、頭痛、直腸出血、腫瘍などを経験した後、あるいは前に年１回の身体検査の間 に検出されたようにして実施される。そのような異常な身体反応を立証したら、 診断法や他のプロトコールが開始され、病理学的状態または条件の進行程度を測 定するのと同様に病理学的状態を限定するために評価される。診断法はＸ線、例 えば乳癌のための乳房造影法、結腸の直腸鏡検査などを含む。

更に、病理学的状態が哺乳動物に存在することが認められ、特定の病理学的状態 に関して限定されたら、哺乳動物に対する病理学的状態の衝撃を減少するための 治療法、例えば薬物、放射線療法、化学療法および同様のプロトコールがあるし 、あるいは代りに病理学的状態を例えば外科的方法によって除去する治療法があ る。何れにしても、治療方法の有効性を時を得て評価することは難しい。例えば 、癌の成長を外科的に除去する場合、近接組織のその後の生検のみが完全な除去 を証明することができ、従って必ずしも１００パーセントとは言えず、まして転 移の可能性は言うまでもない。

単核細胞、好中球、リンパ球などの免疫機能を測定するためのテストが開発され 、そこでは固体が分離され、種々の方法によって個々の機能性についてテストさ れる。このような方法はお金がかかり、時間を浪費するし、特定の病理学的状態 に対しては特異的ではない。また、個体テストの結果は説明するのが難しく、ま して相関させることは難しい。例えば、女性の乳房の腫瘍の大きさ、位置などを 乳房造影法は描写するけれども、その結果はｍ瘍が癌性であるか良性のものであ るかを必ずしも限定するとは限らない。このような病理学的評価は腫瘍の生検ま たは外科的切除後の実際の細胞構造の病理学的観察によって実施される。

臨床試験室で実施される上記のテストまたは方法のいくつかはある病気のモニタ リング、例えば肝臓疾患に対する肝臓酵素、腎臓疾患に対する血中尿素性窒素、 免疫学的疾患に対するＴ−細胞機能、出血性疾患に対するプロトロンビンおよび 部分的トロンボプラスチン時間など、に有用である。しかしながら、このような テストは血栓性疾患における凝固変化に対する治療の効果や癌および免疫反応シ ステムにおける変調に関わる他の疾患における治療の効果の何れも測ることはで きない。

発明の目的 本発明の目的は病理学的状態または条件が哺乳動物に存在するかどうかを決定す る方法を提供することぐある。

本発明のその上の目的は、簡単で安価なやり方で実施できる病理学的状態または 条件が哺乳動物に存在するかどうかを決定する方法を提供することである。

本発明のその他の目的は、比較的短時間で実施しやすい病理学的状態または条件 が哺乳動物に存在するかどうかを決定する方法を提供することである。

本発明のまた別の目的は、あったとしても誤った読みは最小である病理学的状態 または条件が哺乳動物に存在するかどうかを決定する信頼できる方法を提供する ことである。

本発明のなおその上の目的は哺乳動物における既知の病理学的状態または条件の 過程を継続的に測定するための簡単な方法を提供することである。

本発明のなおその他の目的は病理学的状態または条件を根絶し、あるいは再発の 疾患を発見するための外科的方法の哺乳動物に対する有効性を測定するための方 法を提供することである。

本発明のその他の目的は既知の病理学的状態または条件をもつ哺乳動物に対する 薬物療法または同様のプロトコールの有効性をモニターすることである。

本発明のなおその他の目的は哺乳動物における既知の病理学的状態または条件を 減退または破壊して成長を遅らせる治療ブＯグラムの有効性をモニターすること である。　。

１更度皿工鬼五」 本発明の前記および他の目的は、ここで定義された免疫モデュレータと哺乳動物 の細胞血液学的液体を混合して、反応パラメータを決定し、同様の免疫パラメー タをもつ既知の健康な状態の哺乳動物の細胞血液学的液体の既知の反応パラメー タとこの反応パラメータを比較することによって達成される。本発明の優先具体 例においては、反応パラメータはフィブリンレベルとして決定される凝固パラメ ータあるいはフィブリンレベル間の時間差の関数である。

本発明のその他の具体例においては、免疫モデュレータのない場合とある場合の テストされる哺乳動物のこのような細胞血液学的液体の反応パラメータ間の比率 をテストされる哺乳動物の病理学的状態または条件の存在または非存在を立証す るために同様の免疫モデュレータのない場合とある場合の既知の健康状態の哺乳 動物の細胞血液学的液体の反応パラメータ間の比率を比較する。

ｌ豆夏且亙鬼五里 免疫モデュレータと混合した場合の既知の病理学的状態にある哺乳動物の細胞血 液学的液体の反応パラメータは同じ免疫モデュレータと混合した場合の既知の健 康状態にある哺乳動物の細胞血液学的液体の反応パラメータとは異っていること が思いがけず観察された。一般的に言うと、ある場合には本発明のプロセスは特 定の病理学的状態を算術的に診断することができることもあるけれども、本発明 の方法は特定の病理学的状態を診断しないで、評価される哺乳動物の病理学的状 態の存在を指摘する。ここで用いられているのは、哺乳動物の細胞血液学的液体 は全血および単核細胞と他の細胞および非細胞成分を含む画分である。

発明の理論は充分に理解されていないが、出願者は発明の理論に守られたいと望 んでもいなければ、血液凝固および現存する病理学的状態または条件をもつ哺乳 動物の免疫モデュレータに対する免疫反応システムが血液凝固および同様の免疫 モデュレータに対する健康な哺乳動物の免疫反応システムとは違っていると信じ られている。単核細胞はいろいろな程度で免疫モデュレータに対する血液学的液 体の免疫反応システムに関係しているが、免疫反応システムは細胞血液学的液体 中の単核細胞と他の成分、例えばＴ−細胞、リンパ球、好中球などとの相互作用 を含むと考えられている。

その非特異的存在が本発明によって確認されている病理学的条件は癌、敗血症、 エイズ、糖尿病、多発性硬化症、急性心筋梗塞、外傷、血栓症などや哺乳動物の 免疫反応システムに影響を与える全ゆる病理学的状態または条件を含み、テスト 哺乳動物に存在する特定の病理学的状態または条件は一般に本発明の方法に従っ て病理学的状態または条件のはつきりした決定の後で限定されるということはこ の分野に精通した者によって理解されている。ここで用いられている゛哺乳動物 ″というタームはホモ・サビエンスや飼いならした動物、例えば競争馬を含む。

ここで用いられている°“免疫モデュレータ″というタームは全面あるいは全両 分の凝固（例えばカルシウム再添加時間によって表現されるように）を各々促進 または助長するか遅延または減衰させる試薬である免疫活性化剤あるいは免疫減 衰化剤を意味する。免疫モデュレータは中でもエンドトキシン、麻疹ウィルス、 インターフェロン、ホルボール・エステル、コラーゲン、ワルファリンのような 抗凝固剤、血小板活性化因子、カテゲーナン、補助ペプチド、トロンボプラスチ ン、抗原、ミニリン、グラム陰性細菌、コンカナバリン−Ａのようなレクチン、 アメリカヤマゴボウミトゲンのようなミトゲンを含む。

本発明の方法において評価される反応パラメータの多血症が存在するが、下でカ ルシウム再添加時間（ＲＴ）に帰せられるフィブリン生成によって測定される凝 固パラメータは免疫モデュレータに対する細胞血液学的液体の反応を評価するた めの特に簡単で、安価な方法であることが認められている。

“カルシウム再添加時間（ＲＴ）”というタームは終点まであるいはある中間点 までのフィブリン生成の開始の間の期間として定義され、例えば凝固パラメータ に対する値は境界の間の速度曲線より下の統合された領域によって定義されるよ うなフィブリン生成の速度に基づくのではないかと考えられている。

全面あるいはその両分に対する抗凝固剤はくえん酸ナトリウムのようなくえん酸 塩、しゆう酸塩、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムなどを含み、くえん酸ナト リウムが一般に望ましい。

前に考察したように、この免疫モデュレータに対する既存の病理学的条件をもつ 哺乳動物の細胞血液学的液体の反応パラメータに比較して、免疫モデュレータに 対する健康な哺乳動物の細胞免疫学的液体の反応パラメータの間に差があること が認められた。このように、凝固パラメータの関係において、特にカルシウム再 添加時間においては、その比較は現存の病理学的条件をもつ哺乳動物を容易に確 認する。この反応パラメータを用いた多くのアルゴリズムが展開されることもあ り、また特定の病理学的状態または条件の哺乳動物にお番ノる存在を決定するた めに凝固パラメータをより十分に評価するより特定のアルゴリズムが誘導される こともある。

より精巧なアルゴリズムは健康な哺乳動物の血栓指数と比較して試験される哺乳 動物の血栓指数により次の式（■）：Ｔｌ−ＲＴＶ÷ＲＴｉ に従って、ビヒクルにおけるカルシウム再添加時間（ＲＴＶ）に対する免疫モデ ュレータのない場合と免疫モデュレータのある場合の哺乳動物の細胞血液学的液 体（ビヒクル、例えば塩類中における）のカルシウム再添加時間（ＲＴｖ）の割 合として定義される“血栓指数″の計算に基づく。

また別のアルゴリズムは次の式（■）：ＰＤＯＣ−ふＬ口」］ユＸ１００ ＲＴｖ に従って凝固の百分率差（ＰＤＯＣ）によって公式化される。

試験哺乳動物の凝固の百分率差を次に健康な哺乳動物の凝固の百分率差と比較す る。

凝固パラメータを測定するためと同様に、反応パラメータ、を測定するために用 いられる多くの器具、例えば特別の化学薬品の濃度のためのクロマトグラフカラ ムがある。例えば、ＳＯＮＯＣＬＯＰＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅ ｒは５ｉｅｎＣＯ，Ｉｎｃ、から入手でき、試験されるサンプルの機械的障害物 の関数として粘弾性を測定する。このような分析はフィブリン生成に対して非常 に敏感であり、それによって結果の感度と再現性が改良される。粘弾性を同様に 測定する別の装置、ＴｈｒＯｍｂＯｅｌａＳｔＯＯｒａｐｈ（ＴＥＧ）があるが 、ＴＥＧは５ＯＮＯＣＬＯｆＸ）　はど感度はよくなく、処分と清浄の問題を呈 示する。なお別の器具はＩｎｔｅｒｎａ−ｔｉＯｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ 　Ｃ０ｒｌ）Ｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎｅｗ　ＦｅｒＳｅＶ、か ｂ　ｘ　手−ｃ　ｐ　；ｂ　ＨＥ）４０ＣＨＲＯＰ４００　ｒ、５ＯＮＯＣＬＣ １’ｌ”　（７）　Ｉ　合ト（７）　ｆｆｌ大なデータ相関を示している。

本発明の理解を容易にするために、次の説明が細胞血液学的液体のカルシウム再 添加時間−エンドトキシン（ＲＴ　ｉ　）に対して、適切なビヒクル、例えば塩 類の中における免疫モデュレータとしてエンドトキシン、特にＥ、ｃｏｌｉエン ドトキシン（菌株０５５：ＢＳ）の使用に関して先ず詳述されるであろう。

ＬＬＺ旦上二に 試験される哺乳動物から、うつ滞または血液を引く不適当な力のない注射器（２ ０ゲージ針）を用いる静脈穿刺により血液学的サンプルが採取される。不完全な サンプリングは組織因子を血液サンプルに導入して、結果の妥当性に強い影響を 与えるので、血液サンプリングの衝撃は最小でなければならないということはそ の分野に精通した者によって確認されるであろう。血液学的液体は抗凝固剤、例 えばくえん酸ブトリウムの３．８　％液を含むチューブに移され、混合される。

一般に、容量比は抗凝固剤１に対して血液学的液体９である。多くの抗凝固剤が 利用されるが、くえん酸ナトリウムはＩ）Ｈレベルが試験される哺乳動物の血液 学的液体のｐＨレベルに根本的に類似しているので、一般に好まれており、細胞 要素に対して毒性が少ない。

その後、抗凝固処理された血液学的液体またはくえん酸塩加全血（ＣＷＢ）の部 分標本部分（２ミリリツトル）はチューブの中でエンドトキシン（例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉエンドトキシンの１■／ＣＣ懸濁液または溶液の２０ｕｌ）と混合し、 一般には２時間から４時間の予め決められた時間インキュベートする。

インキュベーション時間が長いほどより感度の高い結果を与えることが一般に認 められた。

一般に、インキュベージコン温度は約３５℃から４０℃に及ぶが、約３７℃が好 ましい。インキュベーション後は、塩化カルシウム（ＣａＣ１ｚ　）のようなカ ルシウムイオン含有成分の予め決められた聞、例えば０．５ＨＣａＣＩ２１０ｕ ｌが初期のフィブリン生成を“与えられた“フィブリン濃度、例えば終点として とらえられるような１０％の目盛偏差、の間のカルシウム再添加時間を決定する ためにセットされた前記のＳＯＮＯＣＬＯＰＣｏａｇｕｌａ−■ ｔｉＯｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（ＨＯＨＯＣＨＲＯＭ　４００　０．５ｃｃに対 しての０．ＩＨｃａ１１２１００ｕｌ　）への挿入のためにキュベツトに導入さ れる混合物を含むインキュベートした血液学的液体０．４ＣＣと混合する。

血栓弾性描写が用いられれば、カルシウム再添加時間はＲ値による。カルシウム イオンがフィブリン生成に必要であることはその分野に精通した者によって認め られている。

カルシ　ム　−　モーユレータ Ｔｉ　・・・　態の　季　物 健康状態にある哺乳動物に対する細胞血液学的液体のカルシウム再添加時間−免 疫モデュレータ（ＲＴｉ）はＴＥＧによる測定では３．９３から６．０４の範囲 で、平均のカルシウム再添加時間は４．６６：また５ＯＮＯＣＬ旧０による測定 では４．６から７．２の範囲で、平均５．６９である。

他の診断法によって続いて確認されるような病理学的条件をもつ哺乳動物に対す るＩａｌ胞血液学的液体のカルシウム再添加時間−免疫モデュレータ（ＲＴ　ｉ 　）は後でもつと詳しく明らかにされ、考察されるように、健康な哺乳動物のＲ Ｔｉ値の上あるいは下までの範囲に及ぶ。

ム臣Σニル立星亘 試験哺乳動物の細胞血液学的液体のカルシウム再添加時間−免疫モデュレータ（ ＲＴ　ｉ　）の健康な哺乳動物の細胞血液学的液体の既知のカルシウム再添加時 間との比較によって、試験哺乳動物の状態、すなわち健康であるかあるいは病理 学・的条件があるか、を実施例によって後でもっと詳しく考察されるように全く 即時に評価することができる。

このようなデータを分りやすくし、結果から適切な結論を引き出すために、デー タを収集し、要約する統計学的分析が利用される。次の実施例の考察はその発明 の貢献度をよりよく理解させるための統計学的分析を含む。ここで用いられてい る“研究対象のグループ間の統計学的な有意差″というタームは、適切な統計学 的分析を用いた場合（すなわち、Ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅテスト、ｔ−テスト）、 同じであるグループの確率は５％以下、すなわちｐ＜、０５　である。言いかえ ると、完全に任意の場合の同じ結果を得る確率は１００の試みのうちの５以下で ある。

λ虱鬼叉互１ 次の実施例は本発明の詳細な説明しており、発明の範囲はそれで限定されるもの ではないことが理解される。さらに、特定の病理学的状態は試験された哺乳動物 （ホモ・サピエンス）が本発明の方法に正の反応を示した後で一般に決定される ことはその分野に精通した者によっては理解されるであろう。

さらに、カルシウム再添加時間−塩類（ＲＴＶ）およびカルシウム再添加詩間− エンドトキシン（ＲＴｉ）を得るために与えられた範囲で選択する免疫モデュレ ータについての健康な哺乳動物に関するデータは試験される哺乳動物がカルシウ ム再添加時間−エンドトキシン（ＲＴｉ）、血栓インデックスおよび凝固差の百 分率について一般に比較される基本値または標準値を設定した。

友血■ユ 正常なボランティアの対照は男性と女性を含み、年齢は２１才から６９才に及び 、喫煙者も非喫煙者も含んでいた。最近薬物を摂取していたかどうかのデータも ボランティアが最近病気の治療を受けていたかどうかのデータもボランティアか らは確認されなかった。

次の１表は癌患者のグループと健康なボランティアのグループ（対照）のＲＴ　 ｉ　、ＲＴＶ、ＴＩおよびＰＤＯＣに対する平均値と範囲を示す。

対　照　４．６６　３．９３−　６．１３　５．２４−　１．３２　１．１５− 　２３．４　１４．０−（ｎ＝２３）　６．０４　７．６１　１．５３　３４． ５癌　２．２５　１．５４−　６．４６　４．４５−　２．７１　１．６２−　 ６０．３　３８．３−（ｎ＝２５）　４．０２　８．７２　４．３９　８８．０ ｐ＜　ｏ、ｏｏｉ　Ｐ−ＮＳ −ＴＥＧによって測定されたカルシウム再添加時間癌患者は病気の診断時に評価 した。健康なボランティアのグループと癌患者のグループの間のカルシウム再添 加時間−エンドトキシン（ＲＴ　ｉ　）に重大な差があったが、これらのグルー プのカルシウム再添加時間−塩類（ＲＴｖ）に重大な差はなかった。さらに、血 栓インデックス（ＴＩ）は癌患者のグループについては健康なボランティアの場 合よりも大きいことがよく分かる。同じ説は凝固の百分率差（ＰＤＯＣ）の比較 でも証明された。ＴＩあるいはＰ　ｌ）　ＯＣに対する値はこれらのグループに ついては部分的に一致しない。腫瘍荷重の大部分が除去され、小部分が残ってい る癌患者の場合、ＲＴｉ、ＴＩおよびＰＤＯＣの差はまだ健康なボランティアの グループのパラメータの範囲を超えていることが認められた。結腸癌をもつ患者 のＴＩとＰＤＯＣは手術１週間後に各々１．９１および４１．６％を示した。そ の結果、腫瘍の生長により隣接の組織が侵されていることが分った。

本発明の方法により、臨床医は癌患者の癌の状態に応じた治療の効果を評価する ことができる。例えば、完全でない治療後のＲＴｉ値の小さな変化やＴＩあるい はＰＤＯＣ値の低下が証明された。化学療法や放射線療法がこの値を変えないな らば、より効果のある治療薬や放射線プロトコルを発見するために治療法を変え ることが示唆される。本発明の方法の利点は治療後のいろんな時期のサンプリン グと評価の便利さと臨床的変化の身体的出現の前の治療の有効性の評価である。

本発明の方法によって発見される癌のタイプの中には、肺、乳房、胆道、膀胱、 喉頭、卵巣、頭と首、結腸、直腸、食道、軟口蓋、膵臓、および口床の癌が含ま れる。前記のように、治療的手術後に残る悪性腫瘍があるかないかは本発明の方 法によって証明することができる。

Ｋ凰旦ユ 理２的条　・・脣 次の■表は６名の患者についての特別データを示している：患者の１から４は癌 をもち、患者５と６は良性の乳房病変を１　２．００　７．３１　３．６６　７ ２．６２　３．２８　７．０４　２．１５　５３．４３　２．５１　６．６１　 ２．６３　６０．２４　３．５２　６．０６　１．７２　４２．０５　４．３２ 　４．５４　１．０５　４．８４６　４．８７　５．９８　１．２３　１８．６ −　ＴＥＧによって測定したカルシウム再添加時間前記データは良性の乳房病変 をもった患者（＃５−＃６）とは区別されるように乳癌のある患者（＃１−＃４ ）についてはカルシウム再添加時間−エンドトキシン（ＲＴｉ）が低いことを示 している。比較の類似点は患者（＃１−＃４）のＲＴｉ値と前記１表に示される ＲＴｉ値の間にも認められた。

さらに、患者（＃１−＃４）はかなり高いＴＩおよびＰＤＯＣ値をもっていた。

手術１週間後の患者＃３と＃４は各々１．２５と１．３９　および２０．０％と ２７．９％のＴＩ値とＴＤＯＣ値を示し、これはその後の組織の組織学的検査や リンパ節に癌細胞がないことによって証明されるように全ての悪性腫瘍がうまく 除去されたことを示している。

前に考察したように、悪性腫瘍が完全に除去されない癌の症例において、ＲＴｉ 、ＴＩおよびＰＤＯＣ値は手術前の範囲のままである。

夫五五ｌ 理　峙　・・・ 次の■表は糖尿病をもつ３６名の患者のグループのＲＴｉとＲＴｖの平均値を示 す： 皿１む一 対　照　５．６９　±　０．７４　４．６−７．２　６．５５　±　０．０８　 ５．３−８．５（ｎ＝１９） 糖尿病　４．９９±１．２０　３．０−８．１　５．６５±２．３　３．３−１ ６．ＢＰ＜　０．００Ｉ　Ｐ＜　０．００１ ＊　ＳＯＮＯＣＬＯＰＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ＡｎａｌｙＺｅｒによッテ測定 されたカルシウム再添加時間 ３６名の糖尿病のうちの１８名（５０％）が塩類とインキュベートしたサンプル 中で凝固を促進し、３６名のうちの１５名（４２％）はエンドトキシンとインキ ュベートしたサンプルに対する最も短い対照値よりも短い凝固時間をもっていた 。異常値をもつ糖尿病はもつと重傷の疾患（例えば、若年性糖尿病、血管合併症 をもった糖尿病、１５年以上かかつている糖尿病など）をもっていると考えられ る。本発明の方法は食事制限、運動および薬物治療の糖尿病活性に対する治療効 果を測定するのに有用であり、糖尿病のＲＴｖおよびＲＴｉ値を正常な範囲にも ってくる治療目標となるであろう。

丈、、ＵＬＩｌｌ￥ ◆ｅ＋−９響 １込」」Σａ上 次の■表は４名の確認された進行したエイズ患者のＲＴｉ。

ＲＴｖ、ＴＩおよびＰＤＯＣの平均値と範囲とともに健康なボランティア（実施 例■にょる）のＲＴ　ｉ、ＲＴｖＳＴＩおよびＰＤＯＣの平均値と範囲を示す： エイズ　４．９４　４．４３−　５．７８　５．１２−　１．１７１．０８−１ ４．５　７．５−５．４０　６．９４　１．２９　２２．２対　照　４．６６　 ３．９３−　６．１３　５．２４−　１．３２　１．１５−　２３．４　１４． ０−６．０４　７．６１　１．５３　３４．５”　ＴＥＧによって測定されたカ ルシウム再添加時間前記のデータから、エイズ患者のカルシウム再添加時間−エ ンドトキシン（ＲＴ　ｉ　）の数値は比較的高いが、癌患者の同様の比較から分 るように必ずしも重要ではないことが分る。

しかしながら、ＴＩおよびＰＤＯＣ値は、特に４症例のうちの３症例でかなり低 いことが認められる。全てのエイズ患者をもっとはっきり確認するためにアルゴ リズムの別の形体が誘導された。このように、本発明の方法はエイズまたはエイ ズ様疾患をもつ哺乳動物は対照より低いｐｏｏｃ値をもち、人が供血に適してい るかどうかをみるためには統計学的に測定した基線値が必要である。

１廉［ 理　・・・ １且豆ヱ 外科による集中治療ユニットにおいては、特に患者は重い外傷や大手術を受けて おり、生命維持システムによって管理されていて、進行性や恐らく発見されてい ない敗血症からくる複数システム不全症でしばしば死ぬこともある。

次のＶ表はこのような条件を示さなかったグループ（６２名の患者）からの局部 性敗血条件を示すグループ（９名の患者）の値を示し、外傷を受けた組織の存在 による放出されるトロンボプラスチンと免疫学的重要性の結果として予期される ように（正常な母集団に比較して）　、ＲＴ　を値はより低く、ＴＩとＰＤＯＣ 値はより高いことが認められる：Ｌ五二 対　照　４．６６　６．５３　１．３２　２３．４敗血性　８　＜　１．３０　 ＞　２　８　＜２３．０＞　２非敗血性　２　＜　１．３０　＞６０　２　＜２ ３．０＞６０ｐ＜　０．００１ −　ＴＥＧにより測定したカルシウム再添加時間上述のように、試験される患者 の外傷条件の結果として、ＲＴｉおよびＴＩ値は非外科手術または外科手術前の 患者のＲＴｉおよびＴＩ値とは簡単に比較できない。

敗血症患者の８０％で、予期されたように、血栓指数は上昇しない。１．３０以 下のＴＩ値および２３．０％以下のＰＤＯＣ値は、高濃度の免疫モデュレータが このような患者の血流に入るという事実により、通常患者の腹腔の血栓の存在を 示した。

１凰Ｊ［１ 理　的条　・・・　− 次の■表は非生存患者（９）、生存患者（４６）、および手術をしていない正常 なボランティア（２３）の手術後および外傷後の患者のＲＴｉｌＲＴｖ、ＴＩお よびＰＤＯＣ値を示す：■Ｊし！ 対　照　４．６６　６．５３　１．３２　２３．４非生存者　４．５１　６．７ ２　１．４９　３２．９生存者　２．２１　６．０９　２．７５　６３．９−　 ＴＥＧにより測定されたカルシウム再添加時間。

生存者と非生存者の間でＲＴｖ値には重大な差はなかったが、ＲＴｉ、ＴＩおよ びＰＤＯＣ値にはかなり重大な差があった。癌患者にお番プるＴｌおよびＰＤＯ Ｃ値上昇と違って、手術後あるいは外傷後の患者で４８時間以内に起る値の上昇 は良い予知インディケータである。手術後の値が低い場合には、考えられる血栓 合併症の前兆がある。さらに、死亡した９名の患者のうち８名が１．６０以下の 値をもつのに対し、１．６０以上の値をもった１名の患者だけが死亡したので、 １．６０のＴＩ値が免疫能力のしきい値であると思われる。

試験は個体の免疫能力を測定する。従って、癌患者（初期に診断された）や手術 後または外傷後の患者の試験エンドトキシンに反応しての活性化（凝固促進）は 、各々が試験エンドトキシンの影響下での凝個時間促進で反映されるように免疫 反応システムの変化した（活性化した）状態を示しているが、これらの状態と関 連した血栓合併症を１部説明している。

宜Ｊ１粗■ 理　的条　・・・　Ｉ− 次の１表は多発性硬化症をもつ３３名の患者の値を示す：患者の多くは試験時に 臨床的軽快の状態にあった：Ｓ 患者３．６７±１．２７　１．２−７．０４．９９±、９３　２．７−７．３２ ６．２±２０．０（ｎ＝３３） 対照５．６９±、７５　４．６−７．２６．５５±、８２　５．３−８．５１２ ．２±１１．１（ｎ＝１９） 傘ＳＯＮＯＣＬＯＰＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒによッテ測定さ れたカルシウム再添加時間 ３３名のＭＳ患者のうちの２２名が異常なＲＴＶ値を示し、３３名の患者のうち の２９名が異常なＲＴｉ値をもっていた。臨床的軽快の状態が認められるとして も、そのデータは進行中の病状が存在することを示している。臨床医が治療中の 患者を監視するのと同様に、進行中の病気の存在に応じた医療方針を建てるため に本発明の方針を利用することはその分野に精通した者にはよく認められている 。

前述のように、また上で説明したように、本発明の試験方法は潜伏性の凝血促進 物質産生が上昇する各種の病状を検出することができる（活性化単核細胞）。こ れらの状態は心筋梗塞、発作、感染症、後天性免疫不全症候群（エイズ）、リュ ーマチ様関節炎、癌、多発性硬化症などを含む。

さらに、免疫モデュレータ、例えばエンドトキシン、カラゲーナンなどの濃度を 変えることによって、しきい値チャレンジに対する感受性を確認することができ る。ある状態の癌、多発性硬化症などにおいては、免疫モデュレータの最適濃度 の１００分の１の濃度で白液サンプル中の活性化細胞を検出することもできる。

これらの各種の免疫モデュレータ濃度を用いて、病気の発見や病気に対する治療 の効果が容易に分る。

単離した単核細胞を活性化し、それによってこれらの細胞が培地中で凝血促進活 性を発生するよう刺激する各種の免疫モデュレータがある。これらの刺激物質は 、エンドトキシン、免疫複合体、補体分解産物、炎症性粒子、アミン、ホルボー ルエステル、レクチン、抗原、炎症の科学的メディエータ、リポプロティン、ウ ィルス傷害細胞、腫瘍細胞などを含む。

単核細胞を活性化する刺激物質は細胞の原形質膜と相互作用をする。これらの膜 の摂動は特異的リセブターあるいは非特異的相互作用を含む免疫モデコルータ細 胞膜接触によって起る。

実】Ｉ４■ 動的　モーニレ−によ これらの実施例の目的は、全面が用いられる本プロトコルに多数の免疫モデュレ ータを利用することができ、またエンドトキシンがこのグループの代表であるこ とを証明することである。

次のデータを得るために用いられるくえん酸塩前血液サンプルはいろんな病状を もった者からのものと同様に、正常な者からのものであった。いくつかの例では 、塩類、エンドトキシンおよび他の免疫モデコーレータの間で得られる値に差が 見られたが、それは有意（Ｐ値）な変化とは思われな（Ｘｏこれはサンプルの大 きさが比較的小さいということや健康な状態やいろいろな病状が用いられたとい う事実によるものである。

■表において、試験したくえん酸塩前全血サンプルの数、平均ＲＴ基塩類ＳＤ（ 平均値の標準偏差）、ＲＴエンドトキシン±ＳＤおよびＲＴ免疫モデュレータ± ＳＤを表にした。

分散の分析（ＡＮＯＮＡ）はＰ−，０５の異ったグループ値の平均が有意である 場合に利用された。

隻ＺひＩ　１−一−ユ　１−−１ ３　１０μ牙／ｃｃ　６．４３±１，７０９　２０μ’）　／ＣＣ６，９７±１ ．９４９　２０μ牙、’ｃｃ　４．９０±１．２８９　未　知　４．９０±　１ ．２８ ７　２μ？／ＣＣ５，３０±、９１ ５　２０μ’）　、’Ｃｃ　６．０４±１．２６７　１μｃ７ｔ／ｃｃ　５．５ １±、７４−　ＲＴ基塩類は異つ ネ重　ＲＴ基塩類は異つ −■−−去一 補助ベブヂド　免疫学的活性化剤、１０μ＞　／ＣＣＣＷＢ５．２９±、９３　 ５．３６±１．５１　レクチンｏｎ　Ａ ４．５７±１．０７　４．５７±１．３２　シトゲンアメリカヤマゴボウ ４．５７±１．０７　４．７９±１．０３　麻疹ウィルスウィルス ４．０９±、５７　５．３０±１．０４　血小板活性化因子、脂質、外傷、ＰＡ Ｆ　炎症中に放出されるメディエータ、アレルギー ５．２２±、　４９　４．５４±、４５　ザイモサンー免疫モデュレータザイモ ザン ５．９４±、６３　５．１０±、８７　ミニリン、蛋白質、抗原ミニリン プたＲＴエンドトキシンを意味する フたＲＴ免疫モデュレータを意味する 前記免疫モデュレータの他に、次の物質が少なくとも１つのサンプルに用いて成 功している： 各−−淋　カテゴリー 脂質Ａ　脂質、細菌産生物質 Ｉ　ｏｒ　Ｑ　ｐ　：１０　ｒ　！３　Ａ　２３１８７　薬理学的刺激物質混合 血液　異種細胞、補体、免疫複合体生成などシクロへキシミド　ＤＮＡ、ＲＮＡ 阻害物質、抗生物質ヘビ毒　免疫学的に活性、凝血促進物質ニコチン　血管活性 生化学的物質 サルモネラ＆　細菌産生物質 他のエンドトキシン アデノシン・　細胞エネルギーバランスに作用二りん酸エステル　血小板凝集 混合血漿　異種種族 ＴｔｌｆｔＳｉｎ　テトラペプチド−白血球刺激物質グルカン　Ｆｆ母細胞壁、 異種表面 ストレプトキナーゼ　凝塊溶解剤、溶解剤、免疫学的に活性な ウロキナーゼ　凝塊溶解剤、溶解剤、免疫学的に活性な パパイン　酵素 免疫グロブリンＧ　炎症性血液産生物質（Ｉ　ｏＧ） フェリチン　異種蛋白質 ＰＰＤ　精製した蛋白質誘導体 植物性血球凝集素　レクチン 病理生理学的試剤　傷害を受けた細胞など犬凰［ 本実施例においては、カルシウム再添加時間に対して免疫モデュレータ濃度を変 えることの影響を測定した。免疫モデュレータ、および試験の他のパラメータは 下記のように示さめる： Ａ、トロンボ　ラスチン（組織因子あるいは凝固因子■とも呼ばれる）。単核細 胞、凝血促進物質、免疫モデュレータ。

組織因子の濃度（μ牙／ｃｃ　ＣＷＢ）異ったグループの間の比較のための有意 ＡＮＯＶＡ　Ｐ＜：０５ ３、Ｅ、ｃｏｌｉエンドトキシン エンドトキシンの濃度（μ’ｔ／ｃｃＣＷＢ　）有意（ＡＮＵＡ＞ Ａ　ｖｓＢ　：　Ｐ　＜　、０Ｈ ＡｖｓＣ；　Ｐ　＜ｏｓ ＡｖｓＤ　：　Ｐ　＜、０５ ＢＶＳＣ：Ｐ＝ＮＳ ＣＶＳＤ：Ｐ＝ＮＳ 免疫モデュレータ濃度を変えることによって、塩類値の場合と比較してＲＴの有 意の変化を与えるのに必要なしきい値開は臨床的有意性をもつと考えられる。変 化を引き起すのに必要な特定の免疫モデュレータの最小濃度はしきい値と呼ばれ 、これは疾病間で変化し、鑑別診断（例えば、癌であって、糖尿病ではないなど ）を行うことができる。

実１引Ｘ ゛　°を〜　る　Ａの　の１ ワルフアリン（抗凝固剤）療法を受けている患者（４）からのくえん酸塩加全面 のサンプルをこの試験を用いて分析した。

患者のプロトロンビン時間は１８．６秒から６５秒の範囲に及んだ（正常は１２ 秒）。

ＲＴ基塩類ｍｉｎ　）　ＲＴエンドトキシン（ｍｉｎ　）１８．７±３．５６５ ．４８±２，９１有意、対のｔ試験、ｐ＜、０２ ＲＴ基塩類抗凝固剤により非常に延長される。しかしながら、ＲＴエンドトキシ ン平均値は正常範囲内にあり、このことはこの抗凝固剤は組織因子発生に余り効 果がないことを示している。

本発明の利点は多い、例えば供血は、特にエイズの病理学的条件が存在する可能 性がある場合、前もってスクリーンされ、このような血液が供血者の病理学的状 態または条件の存在を立証している場合には輸血に血液を使用することは望まし くない。本発明は特定の供血者の輸血の適合性を評価するのに利用できる。さら に、本発明の方法は哺乳動物における特定の病理学的状態または条件、例えば糖 尿病に対する薬物療法または治療法の有効性をたやすくモニタリングすることが できる。本発明は移植器官が哺乳動物により受容されるか拒絶されるかをたやす く評価することができる。

本発明は、哺乳動物が既存の病理学的条件をもっているかどうかを決定するため に細胞血液学的液体の評価について検討しているが、本発明の方法が哺乳動物の 既知の病原状態の治療の予後に用いることができるということはこの分野に精通 した者には明白である。前記の実施例■で説明されているように、癌組織の除去 のために外科手術を受けた哺乳動物の細胞血液学的液体の免疫反応システムが癌 組織が哺乳動物から除去されたかどうかやそれからの敗血症の程度を決定するた めに評価される。同様に、手術後のプロトコル、例えば化学療法がこの手術後プ ロトコルの有効性についてモニターされる。

この発明は模範的な具体例とともに述べられているが、多くの修正はその分野の 通常の技術をもった者には明白であり、この出願はその適用または変動をカバー することを意図していることが理解されるであろう。従って、本発明は特許請求 の範囲とそれに相当するものに限定されるだけであることははっきりと言える。

手続補正書 昭和６２年　１月２３日 特許庁長官　黒　１）　明　雄　殿　扇町（特許庁審査官　殿） １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１０７５ 存在とモニタリングを決定する方法 ３、補正をする者 事件との関係　特　許　出　願　入 代　名（名称）　ユニバージティー　オブ　メデイスン　アンドデンテイストリ ー　オブ　ニュー　シャーシー７、補正の内容 明細書の浄＠（内容に変更なし）を別紙の通り補正する。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　τ五五　ＩＮτＥＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　ＳＥ入ＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａ．哺乳動物から採取した全血のサンプルから大量の抗凝固処理した全血を 製造し； Ｂ．前記の抗凝固処理した血液の部分標本をとり、その部分標本を適当なビヒク ルをもつ第１の容器に導入し、これで対照サンプルを製造し； Ｃ．前記の抗凝固処理した血液のさらにその上の部分標本をとり、前記のさらに その上の部分標本を中に免疫モデュレータと適当なビヒクルをもつ第２の容器に 導入し、これで活性化サンプルを製造し、前記の免疫モデュレータは前記サンプ ル中の全血の凝固をそれだけで引き起すには不十分な量で前記活性化サンプル中 に存在する；Ｄ．前記対照サンプルと前記活性化サンプルを約２時間から４時間 前以って決めた温度でインキュベートし；Ｅ．凝血活性を開始し、前記対照サン プルと前記活性化サンプルの各々について反応パラメータを測定し；Ｆ．特定の 病変の存在を確認するためにＳｔｅｐＥで測定した反応パラメータを健康な状態 の哺乳動物から測定した反応パラメータと比較する、 ことからなる、敗血症、前心筋梗塞、癌、糖尿病、後天性免疫不全症候群などの 病変の存在または展開を決定するために哺乳動物の血液を分析するための方法。
2. ２．前記の反応パラメータが凝血パラメータである、前記第１項記載の方法。
3. ３．前記の凝血パラメータがフィブリン生成によって決定されるカルシウム再添 加時間である、前記第２項記載の方法。
4. ４．ＳｔｅｐＥの凝血活性がサンプルにカルシウムイオンを含む化合物を加える ことによって開始される、前記第３項記載の方法。
5. ５．Ａ．前記対照サンプルのカルシウム再添加時間（ＲＴｖ）と前記活性化サン プルのカルシウム再添加時間（ＲＴｉ）の割合（ＴＩ＝ＲＴｖ／ＲＴｉ）によっ て前記哺乳動物血のＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｉｎｄｅｘ（ＴＩ）を決定し；Ｂ． ＳｔｅｐＡで決定したＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｉｎｄｅｘを標準対照サンプルと 健康な哺乳動物から誘導した相当する活性化サンプルのカルシウム再添加時間か ら出てくる割合から前以て決定される１つ以上のＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃＩｎｄｅ ｘと比較する、ことによって、ＳｔｅｐＦの比較が行われる、前記第３項記載の 方法。
6. ６．Ａ．その差が前記対照サンプルのカルシウム再添加時間（ＲＴｖ）と前記活 性化サンプルのカルシウム再添加時間（ＲＴｉ）の間の差であり、前記の差に１ ００を掛け、前記対照サンプルのカルシウム再添加時間で割る、ＰＤＯＣ＝（Ｒ Ｔｖ−ＲＴｉ）×１００÷ＲＴｖことによって前記の哺乳動物血液の凝固の百分 率差（ＰＤＯＣ）を決定し、 Ｂ．ＳｔｅｐＡで決定した凝固の百分率差（ＰＤＯＣ）を標準対照サンプルと健 康な哺乳動物から誘導される相当する活性化サンプルのカルシウム再添加時間の 相関から前以て決定される標準ＰＤＯＣ値と比較する、ことによってＳｔｅｐＦ の比較が行われる前記第３項記載の方法。
7. ７．前記の抗凝固処理血液が前記哺乳動物から採取した血液のサンプルをくえん 酸ナトリウムと蓚酸ナトリウムから成るグループから選択した抗凝固剤と混合す ることによって製造される、前記第１項記載の方法。
8. ８．前記免疫モデュレータがくえん酸塩加全血の約１０から約２０μｇ／ｃｃの 量で存在する、前記第１項記載の方法。
9. ９．前記免疫モデュレータがエンドトキシン、ウイルス、インターフェロン、ホ ルボールエステル、コラーゲン、抗凝固性血小板活性化因子、カラゲーナン、補 助ペプチドトロンボプラスチン、抗原、ミエリン、グラム陰性細菌、レクチンお よびミトゲンから成るグループから選ばれる、前記第１項記載の方法。
10. １０．前記免疫モデュレータがエンドトキシンである、前記第９項記載の方法。
11. １１．前記の前以て決定される温度が約３５℃から約４０℃の範囲である、前記 第１項記載の方法。
12. １２．前記の前以て決定される温度が約３７℃である、前記第１１項記載の方法 。
13. １３．前記の適切なビヒクルが大量の生理学的塩類液から成る、前記第１項記載 の方法。
14. １４．前記哺乳動物がホモ・サピエンスである、前記第１項記載の方法。
15. １５．Ａ．前記の既知の病理学的状態に対する反応パラメータを決定するために 、前記の既知の病理学的状態が存在する前記哺乳動物の血液を前記第１項記載の 方法に従って分析し；Ｂ．その反応パラメータを決定するために、前以て決定さ れた時間間隔で前記哺乳動物の血液のその上のサンプルを前記第１項記載の方法 に従って分析し、Ｃ．前記哺乳動物の前記の現状を決定するためにＳｔｅｐＡと Ｂの反応パラメータを比較する、ことから成る哺乳動物の既知の病理学的状態の 現状をモニタリングするための方法。
16. １６．Ａ．反応パラメータを決定するために前記第１項記載の方法に従って補正 手術の前に哺乳動物の血液を分析し；Ｂ．反応パラメータを決定するために同じ く前記第１項記載の方法に従って修正手術の後に採取した哺乳動物のその上の血 液サンプルを分析し； Ｃ．修正手術の有効性を決定するためにＳｔｅｐＡとＢの反応パラメータを比較 する、ことからなる手術性の病理学的状態をもつ哺乳動物に対する補正手術の有 効性を評価する方法。
17. １７．Ａ．ＳｔｅＰＡとＳｔｅｐＢの各々から集められる各々の反応パラメータ から誘導される哺乳動物血液のＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃＩｎｄｅｘ（ＴＩ）を決定 し、前記Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｉｎｄｅｘは対照サンプルのカルシウム再添加 時間（ＲＴｖ）の活性化サンプルのカルシウム再添加時間（ＲＴｉ）に対する比 率（ＴＩ＝ＲＴｖ／ＲＴ１）からなる、 Ｂ．ＳｔｅｐＡの反応パラメータから誘導されるＴｈｒｏｍｂｔｌｃ　Ｉｎｄｅ ｘをＳｔｅｐＢの反応パラメータから誘導されるＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｉｎｄ ｅｘと比較する、ことによってＳｔｅｐＣの比較が行われる、前記第１５項また は第１６項の何れかに記載の方法。
18. １８．Ａ．Ｓｔｅｐ　Ａ、とＳｔｅｐ　Ｂの何れかから集められる各々の反応パ ラメータから誘導される哺乳動物血液の凝血の百分率差（ＰＤＯＣ）を決定し、 前記ＰＤＯＣは対照サンプル（ＲＴｖ）と活性化サンプル（ＲＴｉ）のカルシウ ム再添加時間の差からなり、前記の差は１００を掛け、前記対照サンプルのカル シウム再添加時間で割る、 ＰＤＯＣ＝（ＲＴｖ−ＲＴｉ）×１００÷ＲＴＶ；Ｂ．ＳｔｅｐＡの反応パラメ ータから誘導されるＰＤＯＣ値をＳｔｅｐ　Ｂの反応パラメータから誘導される ＰＤＯＣ値と比較する、 ことによってＳｔｅｐ　Ｃの比較が行われる。前記第１５項または第１６項の何 れかに記載の方法。
19. １９．Ａ．全血を入れ、これを抗凝固処理させるために、前以て決められたこの 中で処理される抗凝固剤をもつ少なくとも１つの第１の容器； Ｂ．前記の第１の容器からの抗凝固処理された血液の部分標本が導入される時に 対照サンプルの調製に役立つ、中に適当なビヒクルをもつ少なくとも１つの第２ の容器；Ｃ．前記の第１の容器から抗凝固処理した血液のその上の部分標本を入 れるために、予め決められた量の免疫モデュレータと適当なビヒクルをもつ少な くとも１つの第３の容器； Ｄ．サンプルの各々の反応パラメータの連続測定を促進するために対照サンプル と活性化サンプルの凝固を開始するための方法； Ｅ．各々の反応パラメータの比較によって対照と活性化血液サンプルの分析によ って哺乳動物の病理学的状態の測定のための診断プロトコル、 からなる敗血症、前心筋梗塞、癌、糖尿病、後天性免疫不全症候群などのような 病変の存在または展開を決定するために哺乳動物の血液を分析するためのプリパ ッケージされた診断キット。
20. ２０．対照サンプルの反応パラメータの活性化サンプルの反応パラメータに対す る割合を含み、対照サンプルと活性化サンプルの反応パラメータ間の差、この差 は１００を掛け、前記対照サンプル反応パラメータで割る、を含む、プロトコル がＴｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｉｎｄｅｘ（ＴＩ）の測定のための説明書を含む前記 第１９項記載のキット。
21. ２１．前記プロトコルが、標準対照サンプルの反応パラメータの健康な状態や特 定の病変の存在あるいは展開と関連した各々の標準活性化サンプルの反応パラメ ータに対する各割合から誘導される予め決められた１つ以上のＴｈｒｏｍｂｏｔ ｉｃ　ＩｎｄｅｘやＰＤＯＣ値から成り、比較測定や分析がキットの残りの成分 の使用によって調製され、処理されるサンプルによる、前記第２０項記載のキッ ト。
22. ２２．哺乳動物から全血を採取するための少なくとも１個の注射器を含む前記第 １９項記載のキット。
23. ２３．少なくとも第２および第３の容器が取り外しのできるキャップをもった試 験管から成る前記第１９項記載のキット。
24. ２４．免疫モデューレータがくえん酸塩加全血の約１０μｌ／ｃｃから約２０μ ｌ／ｃｃの量が個々のサンプル容器に存在する前記第１９項記載の方法。
25. ２５．前記免疫モデュレータがエンドトキシン、ウイルス、インターフェロン、 ホルボール・エステル、コラーゲン、抗凝固性血小板活性化因子、カラゲーナン 、補助ペプチドトロンボプラスチン、抗原、ミエリン、グラム陰性細菌、レクチ ンおよびミトゲンら成るグループから選択される前記第１９項記載のキット。
26. ２６．前記免疫モデュレータがエンドトキシンである前記第２５項記載のキット 。
27. ２７．前記抗凝固剤がくえん酸ナトリウムおよび蓚酸ナトリウムから成るグルー プから選択される化合物からなる前記第１９項記載のキット。
28. ２８．前記抗凝固剤がくえん酸ナトリウムからなる前記第２７項記載のキット。
29. ２９．凝固を開始するための前記手段が凝固開始化合物からなる前記第１９項記 載のキット。
30. ３０．前記凝固開始化合物がカルシウム含有化合物からなる前記第２９項記載の キット。
31. ３１．前記の適当なビヒクルが大量の生理学的塩類液からなる前記第１９項記載 のキット。