CN115656525A - 血栓弹力图凝血激活检测试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血栓弹力图凝血激活检测试剂及其制备方法，该试剂包括以下组分：缓冲液、盐离子化合物、高岭土、磷脂、组织因子酯化物、抗氧化剂、水解明胶、冻干保护剂以及防腐剂，所述水解明胶的质量浓度为0.1％‑10％。本发明提供的血栓弹力图凝血激活检测试剂，在常用冻干保护剂基础上添加水解明胶，使得冻干后试剂不但稳定性好，抗潮能力也大大增加，无需对测试杯进行压膜密封处理，可以直接将试剂冻干于测试杯中，与现有同类产品以及技术相比，无需对试剂进行复溶、转移，取出即可用，不但简化了生产工艺，同时也简化了操作流程，减少测试前过多操作带来的误差，更适用于全自动血栓弹力图仪。

Description

血栓弹力图凝血激活检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及凝血检测领域，特别涉及一种血栓弹力图凝血激活检测试剂及其制备方法。

背景技术

TEG是一种全血粘弹性检测技术，粘弹性检测的本质是对阻力或摩擦力的记录，通过在模拟人体体内环境中全血标本的血液粘弹性变化来反映血液凝固的动态变化，用物理学原理监测从凝血因子激活到形成血小板-纤维蛋白、血小板聚集、形成稳定的血凝块再到纤维蛋白溶解的过程，以此来反映血凝块形成的速率、强度及稳定性(纤溶水平)，这是对凝血与纤溶的全过程进行功能性评估。TEG可以实时连续反映除血管因素外所有血液成分参与的整个的凝血过程，以此判断患者出血及血栓的风险。TEG能更敏感更全面评估凝血的异常状态，预测患者出血与死亡的风险，有利于临床医生清晰明确的制定输血策略、指导合理用药及抗血栓等临床治疗，可有效控制患者的死亡率。

快速TEG检测项目所使用的检测试剂为凝血激活检测试剂，包含高岭土、组织因子，同时激活内源性和外源性凝血途径，与普通TEG检测项目相比，检测时间更短，可在10min左右对患者凝血功能全貌进行评估。快速TEG适用于急诊创伤后凝血功能异常的诊断和实时检测。快速TEG的主要检测参数包括：TEG ACT、R、K、Angle、MA等。激活全血凝固时间(ACT)能够快速预测输血的需求，其延长提示凝血因子缺乏或血液稀释；凝血反应时间(R)指检测开始到描记幅度达到2mm的时间，用于评估凝血启动过程中凝血因子的综合作用；血液凝血时间(K)和凝固角(Angle)反映血凝块形成的速度，主要与纤维蛋白原水平和功能相关；最大振幅(MA)为血凝块的最大强度时的振幅，主要反映由凝血酶激活的血小板和纤维蛋白原在止血中的作用。

市场上现有的血栓弹力图仪以半自动为主，存在自动化能力弱，检测通道较少，人工操作误差等不足，因此全自动设备的需求和应用也越来也多。市面上现有血栓弹力图仪配套凝血激活检测试剂，不管是半自动还是全自动，均需要对凝血激活检测试剂进行复溶，然后吸取检测试剂到测试杯中，才能进行下一步操作，操作过程繁琐。如CN108982865A描述冻干试剂在半自动血栓弹力图中的检测过程：从2-8℃环境中取出试剂，室温平衡一段时间后加20ul水复溶，再吸取10ul复溶试剂加入测试杯，之后再加入氯化钙溶液和检测样本。CN108761104A公开了一种液体凝血激活剂的操作流程：将冷藏试剂常温放置，恢复至室温。装载测试杯，移取氯化钙溶液和凝血激活剂，再加入检测样本。CN207516385公开了一种快速血栓弹力图仪检测试剂盒：将试剂盒分为血样试剂瓶和助剂试剂瓶。抽取1mL血样，依次与装有组织因子的助剂试剂瓶、装有磷脂的助剂试剂瓶和装有高岭土的助剂试剂瓶内试剂混合，转移入血样试剂瓶存放，然后配合血栓弹力图进行上机检测。目前，市售主要产品如乐普医疗及Haemonetics等凝血激活检测试剂盒均为西林瓶装样冻干粉，为保证检测试剂的密封性，冻干结束后进行真空压塞，并加盖铝塑盖，若密封不当，可能会试剂盒失活。同时测试前需加入纯化水复溶，上下颠倒混匀后再转移至测试杯中用于检测。此过程中复溶不充分，转移操作过程产生的误差均影响检测结果准确性。大多数全自动设备配套凝血激活检测试剂盒与半自动设备一致，仍采用西林瓶装样试剂，操作步骤复杂。深圳沃德生命科技有限公司研制出一种单人份试剂卡，但为了保证试剂密封性，需要对试剂卡进行铝封操作，同时还需要对检测试剂进行复溶、转移。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种血栓弹力图凝血激活检测试剂及其制备方法。本发明在多元冻干保护剂基础上增加了现有技术中未使用过的水解明胶，不但保证了试剂的稳定性，同时冻干后的试剂具有优越的抗潮能力，使得试剂冻干在试剂杯后无需进行压膜密封等特殊封装，试剂取出即可用，无需开盖、加水复溶、转移试剂等操作。本发明的试剂直接在测试杯中冻干，并且不需要进行压膜密封处理，免去了检测前复溶和转移过程，减化检测过程中的操作流程，降低因过多操作流程带来的检测误差，使检测更方便，同时也更加适用于全自动血栓弹力图仪。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种血栓弹力图凝血激活检测试剂，包括以下组分：缓冲液、盐离子化合物、高岭土、磷脂、组织因子酯化物、抗氧化剂、水解明胶、冻干保护剂以及防腐剂，所述水解明胶的质量浓度为0.1％-10％。

其中，水解明胶能够显著提高凝血激活检测试剂的稳定性，能有效避免凝血激活试剂在长期保存及运输过程中出现受潮而失活的问题。

优选的是，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、三羟甲基氨基甲烷(tris)和磷酸盐缓冲液(PBS)中的任意一种，所述缓冲液的pH为7.0-7.5，浓度为50-200mM。

优选的是，所述盐离子化合物为氯化钠或氯化钙或氯化钾，且盐离子化合物的浓度为50-200mM。

优选的是，所述高岭土的质量浓度为0.1％-10％。

优选的是，所述磷脂为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、兔脑磷脂、磷脂酰肌醇中的任意一种或多种，且磷脂的浓度为1-100mg/L。

其中，磷脂是凝血激活检测试剂的主要成分，参与内源性凝血途径。磷脂富含不饱和脂肪酸，易被氧化和水解。

优选的是，所述组织因子酯化物的浓度为0.001-0.1mg/mL。

优选的是，所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚(BHA)、甜菜碱、抗坏血酸、茶多酚中的任意一种或多种，且抗氧化剂的质量浓度为0.1％-10％。

其中，加入抗氧化剂保证磷脂的稳定性。

优选的是，所述冻干保护剂包括BSA、甘氨酸、海藻糖、甘露醇中的任意一种或多种，且冻干保护剂的质量浓度为0.1％-10％。

其中，中BSA、甘氨酸能够提高对凝血因子的保护作用。

优选的是，所述防腐剂为Proclin 300，防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。

优选的是，该血栓弹力图凝血激活检测试剂的制备方法包括以下步骤：

S1、配制缓冲液体系：向缓冲液中加入盐离子、水解明胶、保护剂、防腐剂，调节pH为7.0-7.5；

S2、配制磷脂混合液：向S1得到的缓冲液体系中加入抗氧化剂，抗氧化剂充分溶解后，加入磷脂，研磨使磷脂溶解；

S3、配制高岭土母液：将高岭土加入S1制备的缓冲液中，超声处理5-20min，搅拌均匀；

S4、向S1得到的缓冲液体系中加入组织因子酯化物及S2得到的磷脂混合液、S3得到的高岭土母液，混合均匀，然后将得到的混合溶液分装至测试杯中，冷冻干燥，加测试杯盖，保存于干燥纸盒中，得到凝血激活检测试剂，2-8℃保存。

本发明的有益效果是：

本发明提供的血栓弹力图凝血激活检测试剂，在常用冻干保护剂基础上添加水解明胶，使得冻干后试剂不但稳定性好，抗潮能力也大大增加，无需对测试杯进行压膜密封处理，可以直接将试剂冻干于测试杯中，与现有同类产品以及技术相比，无需对试剂进行复溶、转移，取出即可用，不但简化了生产工艺，同时也简化了操作流程，减少测试前过多操作带来的误差，更适用于全自动血栓弹力图仪。

附图说明

图1为本发明的实施例1的试剂热破前后对比图；

图2为本发明的对比例2的试剂热破前后对比图；

图3为本发明的实施例1的长期稳定性测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种血栓弹力图凝血激活检测试剂，其制备方法包括以下步骤：

S1、配制缓冲液体系：配制100mM的hepes缓冲液，向缓冲液中加入100mM氯化钠、1％水解明胶、1％ BSA、1％甘氨酸、0.01％ Proclin 300，调节pH为7.5；以上百分比均为质量浓度；

S2、配制磷脂混合液：在25％(体积浓度)的乙醇水溶液中加入丁基羟基茴香醚(BHA，质量浓度2％)，BHA溶解后加入兔脑磷脂100mg/L，研磨使磷脂溶解；

S3、配制高岭土母液：将高岭土加入溶液中S1制备的hepes缓冲液中，超声处理10min，搅拌均匀得到质量浓度2％的高岭土母液；

S4、向S1得到的缓冲液体系中加入0.01mg/mL组织因子酯化物及S2得到的磷脂混合液、S3得到的高岭土母液，使磷脂浓度为30mg/L，高岭土质量浓度为0.2％。混合均匀，然后将得到的混合溶液分装至测试杯中，15uL/杯，冷冻干燥，加测试杯盖，保存于干燥纸盒中，得到凝血激活检测试剂，2-8℃保存。

实施例2

一种血栓弹力图凝血激活检测试剂，其制备方法包括以下步骤：

S1、配制缓冲液体系：配制50mM的tris缓冲液，向缓冲液中加入50mM氯化钠、0.5％水解明胶、5％ BSA、2％甘氨酸、0.01％ Proclin 300，调节pH为7.0；以上百分比均为质量浓度；

S2、配制磷脂混合液：在S1制备的tris缓冲液中加入5％甜菜碱，然后加入磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺各50mg/L，研磨使磷脂溶解；

S3、配制高岭土母液：将高岭土加入S1配制的tris缓冲液中，超声处理10min，搅拌均匀得到质量浓度2％的高岭土母液；

S4、向S1得到的缓冲液体系中加入0.02mg/mL组织因子酯化物及S2得到的磷脂混合液、S3得到的高岭土母液，使磷脂浓度为15mg/L，高岭土质量浓度为0.1％。混合均匀，然后将得到的混合溶液分装至测试杯中，10uL/杯，冷冻干燥，加测试杯盖，保存于干燥纸盒中，得到凝血激活检测试剂，2-8℃保存。

对比例1

本例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，本例中的缓冲液体系中不含抗氧化剂BHA。

对比例2

本例与实施例2基本相同，不同之处仅在于，本例中的缓冲液体系中不含水解明胶和甘氨酸。

以下对实施例1-2、对比例1-2制备的凝血激活检测试剂进行性能检测。

一、凝血激活剂盒的准确性检测

分别使用本发明实施例1、2制备所得的试剂盒测定质控血浆，重复测定3次，所得结果见表1。其中测试用质控血浆为中科精瓒(武汉)医疗技术有限公司提供的血栓弹力图快速杯质控品，该质控品使用美国西芬斯公司的凝血激活检测试剂盒进行检测赋值，质控血浆的参考范围如下所示：

具体的检测流程如下：

1、取质控品，复温后加入1mL蒸馏水复溶，充分摇匀，室温静置10min备用。

2、取出本发明所制备试剂杯备用；取出对比试剂，加入20uL蒸馏水复溶，充分摇匀。

3、打开测试软件，选择样品类型“CRT”。

4、本发明测试：装载试剂杯，吸取20uL0.2mol/L氯化钙注入测试杯中。比对产品测试：装载空白测试杯，在底部加入10uL重构的凝血激活检测试剂(加样前快速混匀试剂)，并吸取20uL0.2mol/L氯化钙注入测试杯中。

5、吸取复溶质控品340uL加入测试杯中，用移液器上下混吸3次。

6、上推杯架，控制杆转到Test位置，点击“开始”进行检测。

测定TEG ACT值，3份样本的检测结果见表1。

表1：激活凝血试剂盒准确性检测

表1表明，实施例1-2制备的试剂的检测结果均在质控范围内，满足质控标准。

二、凝血激活剂盒的重复性检测

分别使用本发明实施例1、2制备所得的试剂盒测定质控血浆，重复测定10次，所得结果见表2-3，检测流程如下：

1、取质控品，复温后加入1mL蒸馏水复溶，充分摇匀，室温静置10min备用。

2、取出本发明所制备试剂杯备用。

3、打开测试软件，选择样品类型“CRT”。

4、本发明测试：装载试剂杯，吸取20uL0.2mol/L氯化钙注入测试杯中。

5、吸取复溶质控品340uL加入测试杯中，用移液器上下混吸3次。

6、上推杯架，控制杆转到Test位置，点击“开始”进行检测。

表2：激活凝血试剂盒重复性检测(实例1)

表3：激活凝血试剂盒重复性检测(实例2)

由表2、表3可见，实施例1-2制备的试剂R值CV≤20％，Angle及MA值均满足CV≤10％，满足检测要求。

三、凝血激活剂盒的加速稳定性测试

将实施例1、2，对比例1、2试剂置于37℃环境中热破7天，过程中每天观察样本的外观，7天后取出用质控品进行测试(准确性与重复性)，加速稳定性结果见表4-7，实施例1和对比例2热破前后外观见图1、2。

表4：激活凝血试剂盒加速稳定性测试(实例1)

表5：激活凝血试剂盒加速稳定性测试(实例2)

表6：激活凝血试剂盒加速稳定性测试(对比例1)

表7：激活凝血试剂盒加速稳定性测试(对比例2)

由表4-5以及图1可以看出，实施例1和2的试剂加速处理7天后，试剂外观无明显变化，且检测结果CV小于10％，且满足质控标准，说明本发明试剂稳定性较好。表6以可以看出，未加抗氧化剂的对比例1加速处理7天后，试剂外观有一定改变，同时检测结果TEG ACT值，R值均超出质控范围。由表7及图2可以看出，加入不同保护剂的对比例2加速处理7天后，试剂外观改变，对检测结果影响较大，且TEG ACT值，R值超出质控范围。

四、凝血激活剂盒的长期稳定性测试

将实施例1的试剂置于干燥纸盒中，自封袋封装，于2-8℃条件下存放，分别于0、3、6、12个月取出，用质控品进行测试，结果见表8-9，外观见图3。

表8：激活凝血试剂盒长期稳定性测试(实例1)

表9：第12个月重复性测试(实例1)

由表8、9以及图3可以看出，试剂长期稳定性检测结果均满足质控要求，R值CV≤20％，Angle及MA值均满足CV≤10％。表明本发明激活凝血试剂盒稳定性好，适合长期保存。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，包括以下组分：缓冲液、盐离子化合物、高岭土、磷脂、组织因子酯化物、抗氧化剂、水解明胶、冻干保护剂以及防腐剂，所述水解明胶的质量浓度为0.1％-10％。

2.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷和磷酸盐缓冲液中的任意一种，所述缓冲液的pH为7.0-7.5，浓度为50-200mM。

3.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述盐离子化合物为氯化钠或氯化钙或氯化钾，且盐离子化合物的浓度为50-200mM。

4.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述高岭土的质量浓度为0.1％-10％。

5.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述磷脂为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、兔脑磷脂、磷脂酰肌醇中的任意一种或多种，且磷脂的浓度为1-100mg/L。

6.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述组织因子酯化物的浓度为0.001-0.1mg/mL。

7.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、甜菜碱、抗坏血酸、茶多酚中的任意一种或多种，且抗氧化剂的质量浓度为0.1％-10％。

8.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括BSA、甘氨酸、海藻糖、甘露醇中的任意一种或多种，且冻干保护剂的质量浓度为0.1％-10％。

9.根据权利要求1所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，所述防腐剂为Proclin 300，防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的血栓弹力图凝血激活检测试剂，其特征在于，该试剂的制备方法包括以下步骤：

S1、配制缓冲液体系：向缓冲液中加入盐离子、水解明胶、保护剂、防腐剂，调节pH为7.0-7.5；

S2、配制磷脂混合液：向S1得到的缓冲液体系中加入抗氧化剂，抗氧化剂充分溶解后，加入磷脂，研磨使磷脂溶解；

S3、配制高岭土母液：将高岭土加入S1制备的缓冲液中，超声处理5-20min，搅拌均匀；

S4、向S1得到的缓冲液体系中加入组织因子酯化物及S2得到的磷脂混合液、S3得到的高岭土母液，混合均匀，然后将得到的混合溶液分装至测试杯中，冷冻干燥，加测试杯盖，保存于干燥纸盒中，得到凝血激活检测试剂，2-8℃保存。

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