CN107561295A - 一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒主要是针对临床检测内源性凝血途径而设计，试剂在启动内源性凝血过程中使用的试剂主要包含有激活剂、氯化钙溶液组分、同时试剂盒普通杯检测装置中加入了高分子粘附涂层，有效解决了临床全血样本在凝固过程中与运动旋转的样品杯粘附不稳定的问题，真实有效模拟人体内凝血全过程；试剂盒激活剂成分解决了现有血栓弹力图凝血试剂盒的试剂保质期短、液体试剂干涸、稳定性不高、激活剂与血液复溶不完全等问题，通过在血栓弹力图普通杯检测试剂盒组分中添加了上述稳定剂，大大提高了试剂盒的保存期限、稳定性等试剂性能，提高临床样本检测结果的准确性。

Description

一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于临床血栓与止血诊断领域，主要涉及一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法

背景技术

凝血是一个极其复杂的动态过程，涉及到许多相互作用的因子，包括凝血蛋白和纤溶蛋白、激活剂、抑制剂以及细胞成份(如血小板、细胞骨架、细胞质粒、血小板细胞表面)。治疗出血或Prothrombotic患者的最理想的方法是在最短的时间内测量相互作用的因子、细胞成份的数量以及它们的相互作用，但这是不太可能实现的。此时，临床医师只好用预防药物来降低出现凝血病的可能性，尽管这些药费用高并且可能有副作用。出现凝血功能不全时，临床医师常不得不依靠估计，或给患者输注各种血液成份，并且希望有积极的治疗效果。因此，研究人员及临床医师一直在努力探索一种较好的方法来有效处理凝血问题，从而使他们能够监测临床血栓或出血患者的整体凝血全貌，指导临床输血及治疗方案建立。

近年来血栓弹力图项目被国内外广泛用于输血及药物治疗的监测，该检测方法于1948年由德国人Harter发明。80年代开始广泛用于临床指导术中输血取得了良好效果，现已成为当今检测凝血功能的最重要指标。血栓弹力图监测血凝块的物理特性基于以下原理：一特制静止盛有血液的圆柱形杯，以4°45’的角度旋转，每一次转动持续10秒。通过一根由螺旋丝悬挂且浸泡在血样中的针来监测血样的运动。纤维蛋白血小板复合物将杯和针粘在一起后，杯旋转所产生的旋转力能传递至血样中的针。纤维蛋白-血小板复合物的强度能影响针运动的幅度，以致强硬的血凝块能使针的运动与杯的运动同步进行。因此，针的运动幅度与已形成的血凝块的强度有直接关系。当血凝块回缩或溶解时，针与血凝块的联结解除，杯的运动不再传递给针。针的旋转被机电传感器转换成电子信号，这一电子信号能用电脑来监测。由血栓弹力图仪的设计原理可知凝血剖面图是对某些指标的测量，即第一块血凝块形成的时间、血凝块形成的动力学特性、血凝块的强度(用切应力单位dyn/cm2表示)以及血凝块的溶解。

目前已有的血栓弹力图普通凝血功能检测试剂盒检测平台主要有TEG、ROTEM等厂家，试剂盒主要检测原理一般是根据内源性凝血原理在激活试剂成分中添加高岭土试剂启动内源性凝血激活途径，在空白检测样品杯中加入激活后的全血和氯化钙溶液，通过凝血酶促反应，使可溶性纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块，在血栓弹力图检测过程中，由于激活试剂的单人份体积含量低，一般每个激活试剂管分装体积规格为10ul-30ul/管，由于试剂微量体积，试剂最低储存效期为18个月以上，传统方法制备的试剂盒在长期储存运输过程中会有干燥失效风险，影响液体高岭土激活试剂的临床检测的准确性、稳定性及效期，同时传统高岭土试剂在干燥后进行全血激活存在复溶性问题，导致检测凝血时间延长，造成患者低凝结果；其次血栓弹力图普通凝血功能检测主要是通过全血粘附在样品杯表面，检测探针在样品杯和粘附全血转动过程中感受到血块弹性强度，模拟人体血栓形成过程，如检测样品杯及杯盖内表面光滑，血块粘附样品杯及杯盖内表面容易脱落，所以全血粘附样品杯内表面的能力决定了检测的有效性和血栓弹力图的稳定性。

因此，针对以上不足，需要制备一种临床稳定性高，测量结果准确可靠的血栓弹力图普通凝血功能检测试剂盒。

发明内容

一、要解决的问题

由于以上所述的血栓弹力图普通凝血检测试剂盒在技术领域的局限性，本发明提供了一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法，本发明解决了血栓弹力图普通凝血试剂传统技术中的激活剂体积含量低，在储存运输过程中液体容易干燥的问题，本发明同时解决了普通凝血检测样品杯血块粘附容易脱落的问题，提高试剂的准确性和稳定性。

二、技术方案

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒主要是针对临床检测内源性凝血途径而设计，试剂在启动内源性凝血过程中使用的试剂主要包含有激活剂(1)高岭土、鞣花酸、白陶土、硅藻土、等激活剂中的一种和几种混合物，该激活试剂中加入了缓冲剂、悬浮剂、分散剂、磷脂混合物、防腐剂、保湿剂等稳定剂成分。氯化钙溶液(2)组分提供了内源性凝血所需的钙离子。同时试剂盒普通杯检测装置(3)中加入了高分子粘附涂层。

优选地，所述血栓弹力图普通杯检测试剂盒组分包括激活剂、氯化钙、普通杯组成。

优选地，所述普通杯检测试剂盒激活剂主要有高岭土、鞣花酸、硅藻土、白陶土中的一种或几种混合，作为内源性凝血的激活试剂

优选地，所述激活剂配制的质量体积终浓度为0.1-1mg/ml，例如 0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、 0.7mg/ml、0.9mg/ml、0.9mg/ml或1mg/ml。

优选地，所述激活剂的缓冲剂成分包括但不限于HEPES、咪唑、 PBS、Tris、巴比妥中的一种，缓冲剂配制摩尔体积比终浓度为 1-10mM，例如1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

优选地，所述的激活剂中的悬浮剂包括但不限于葡聚糖、黄原酸、 PVA、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶中的一种和几种混合物，质量体积百分比终浓度为1％-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、 8％、9％或10％、。

优选地，所述的激活剂中的分散剂包括但不限于木质素、亚甲基双甲基萘磺酸钠、聚羧酸盐中的一种和几种混合物，质量体积百分比终浓度为0.1％-0.5％。例如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、 0.4％、0.45％或0.5％。

优选地，所述的激活剂包含的磷脂混合物成分主要包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺的一种或几种混合物，质量体积比终浓度为10ug/L-20ug/L，例如10ug/L、11ug/L、12ug/L、 13ug/L、14ug/L、15ug/L、16ug/L、17ug/L、18ug/L、19ug/L或20ug/L。

优选地，所述的激活剂中的防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或几种混合物，质量体积比终浓度为 0.05％-0.1％，单位为g/ml，例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。

优选地，所述的激活剂中的保湿剂包括但不限于甘油、海藻糖、烷基萘磺酸盐中的一种或几种混合物，终浓度为0.1％-0.5％，单位为 g/ml。例如0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％。

优选地，所述氯化钙组分包含有氯化钙溶液，摩尔体积比终浓度为0.1M-1M，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、 0.8M、0.9M或1M。

优选地，所述普通杯装置内表面通过真空涂覆工艺加入了高分子粘附涂层，普通杯涂覆多聚-D-赖氨酸PDL(分子量范围是70到 150kDa),使表面产生净正电荷，更有利于细胞吸附，增加全血凝固后与普通杯内壁的粘附。

在本发明中，所述血栓弹力图普通杯检测检测试剂盒配合 LEPU8800血栓弹力图仪检测，检测过程包括以下步骤：

1.在相应的LEPU8800血栓弹力图仪软件界面上，输入患者姓名，测试名称，测试类型于下拉框中选择“CK-Citrated kaolin”。

2.在血栓弹力图仪的每一通道上装载一套普通杯，用1ml移液器移取枸橼酸钠抗凝全血样本1ml到激活剂瓶中，颠倒试剂瓶5次使之充分混匀，静置4分钟激活血液。

3.移取20μl氯化钙溶液到普通杯杯底。

4.激活完成后，移取340μl激活剂瓶中的血液到普通杯中。

5.将杯子移至测试位置，测试杆拨至“测试”位，点击“开始”或“Start”，开始测试。

6.凝血过程约30分钟结束，如观察纤溶过程需延长至1小时。

7.测试完成后，在软件界面点击“停止”或“Stop”，卸去一次性普通杯，按实验室要求丢弃处理。

三、有益效果

本发明的有益效果在于：本发明公开的一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒，该检测试剂通过创新设计激活剂配方中的悬浮剂、分散剂、保湿剂、防腐剂及磷脂混合物，解决了传统激活剂10ul/管包装规格在保存过程中出现干燥失效的问题；同时解决了检测过程中血栓弹力图普通检测样品杯中内表面与血块粘附脱落的问题，提高了血栓弹力图普通凝血检测的准确性及稳定性，为临床诊断提供可靠依据。

附图说明

图1是本发明实施例普通杯检测试剂盒中激活剂样品管的结构剖视图。

图2是本发明实施例普通杯检测试剂盒中氯化钙样品管的结构剖视图。

图3是本发明实施例普通杯检测试剂盒中样品杯的结构剖视图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

本发明提供的血栓弹力图普通杯检测试剂盒制备方法包括以下步骤：

步骤1：血栓弹力图普通杯检测试剂盒PBS磷酸缓冲液配制：

其中PBS缓冲液含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄。称量NaCl试剂8g、氯化钾试剂0.2g、 Na₂HPO₄试剂1.42g、KH₂PO₄试剂0.27g，置于1L烧杯中。向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加浓盐酸将pH值调节至7.0，然后加入去离子水将溶液定容至1L。

步骤2：将普通杯中的试剂成分激活剂、悬浮剂、分散剂、磷脂混合物、防腐剂、保湿剂进行工艺配制，制备血栓弹力图普通杯激活剂。

其中，普通杯检测试剂盒激活剂主要有高岭土和鞣花酸混合物组成，高岭土的配制终浓度为0.3mg/ml，鞣花酸配制终浓度为0.3mg/ml，混合溶解于PH7.0、PBS磷酸缓冲液中，用超声波机器进行超声溶解，使高岭土和鞣花酸充分溶解成乳白色的悬浊液；

其中，在激活剂悬浊液中加入悬浮剂，悬浮剂优选主要成分为葡聚糖和黄原酸混合物，葡聚糖配制质量体积比终浓度为2％，黄原胶配制质量体积比终浓度1.5％，加入悬浮剂后的，高岭土颗粒可有效悬浮，增加了激活剂在血液中的分散程度。

其中，在激活剂悬浊液中加入了分散剂，分散剂优选主要成分为木质素，配制质量体积比终浓度0.2％，可有效提高高岭土和鞣花酸在全血中的分散速度，降低全血激活时间。

其中，在激活剂悬浊液中加入磷脂混合物，优选磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)三种磷脂组成的混合液，制备方法主要是在烧杯中加入10g磷脂混合物(含4g磷脂酰胆碱、2g磷脂酰丝氨酸、4g磷脂酰乙醇胺)，0.3g硬脂酸钠盐和30ml去离子水，在50℃下用磁力搅拌器搅拌30min,在短时间后，加入的磷脂混合物膨胀，形成高粘度均匀的磷脂混合物，用水稀释至3L，配制成终浓度为3.33ug/ul的磷脂混合物，取该浓度的磷脂混合物4.5ul加入上述1L的激活剂悬浮液中，配制成含磷脂混合物终浓度为15ug/L的激活剂悬浊液。

其中，在激活剂悬浊液中优选加入的防腐剂为叠氮钠0.5g/L、硫柳汞0.5g/L、硫酸庆大霉素0.1g/L，三联防腐剂可有效延长传统激活剂的保质期限

其中，在激活剂悬浊液中优选加入0.5％的甘油试剂作为激活剂的保湿剂，防止激活剂中的水分长期储存干燥。

将上述配制的激活剂用步骤1所述的缓冲液PBS定容至1L后，搅拌均匀，用试剂管分装，10ul/管，2-8℃保存。

实施例二

氯化钙组分制备

准确称量氯化钙22.2g加入到1L生理盐水中，充分溶解均匀，配制成终浓度0.2M的氯化钙溶液，分装成1ml/管中，放置在血栓弹力图普通杯试剂盒中。

实施例三

聚D-赖氨酸涂覆的普通杯制备

将聚D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma，P7405，分子量范围是70到 150kDa)—聚D-赖氨酸溶解到无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，浓度为100ng/ml。将等分聚D-赖氨酸溶液(50ul/杯)分装到普通杯各孔中。将其在室温(通常为25℃)下温育30min。该时间过后，将普通杯中剩余的聚D-赖氨酸溶液倾析，并用步骤1中的磷酸缓冲盐溶液PBS 200ul各洗涤3次，常温晾干，制备成血栓弹力图普通杯。D-赖氨酸涂覆普通杯使表面产生净正电荷，更有利于细胞吸附，增加全血凝固后与普通杯内壁的粘附。

本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims (11)

1.一种血栓弹力图普通杯检测试剂盒，其特征在于，组分包括激活剂、氯化钙、普通杯组成。

2.根据权利要求1所述，其特征在于普通杯检测试剂盒激活剂主要有高岭土、鞣花酸、硅藻土、白陶土中的一种或几种混合，作为内源性凝血的激活试剂。

3.根据权利要求2所述激活剂，其特征在于终浓度优选但不限于0.1-1mg/ml。

4.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，缓冲剂包括但不限于HEPES、咪唑、PBS、Tris中的一种，终浓度为1-10mM/L。

5.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，悬浮剂包括但不限于葡聚糖、黄原酸、PVA、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶中的一种和几种混合物，终浓度为1％-10％。其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

6.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，分散剂包括但不限于木质素盐、亚甲基双甲基萘磺酸钠、聚羧酸盐、中的一种和几种混合物，终浓度为0.1％-0.5％。其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

7.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，磷脂混合物主要包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺的一种或几种混合物，终浓度为10ug/L-20ug/L。

8.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或几种混合物，终浓度为0.05％-0.1％。其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

9.根据权利要求1所述的激活剂，其特征在于，保湿剂包括但不限于甘油、海藻糖、烷基萘磺酸盐中的一种或几种混合物，终浓度为0.1％-0.5％。其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

10.根据权利要求1所述氯化钙，其特征在于，组分包含有氯化钙溶液，终浓度为0.1M-1M。

11.根据权利要求1所述普通杯，其特征在于，装置内表面通过真空涂覆工艺加入了高分子粘附涂层，涂覆多聚-D-赖氨酸PDL(分子量范围是70到150kDa),使表面产生净正电荷，更有利于细胞吸附，增加全血凝固后与普通杯内壁的粘附。