CN116121231A - 一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其包括以下组分：含量为10‑100mmol/L的基础缓冲液、5‑20g/L惰性蛋白、5‑20g/L糖类、5‑50g/L的聚合物、1‑5mmol/L的抗氧化剂、0.1‑1mL/L防腐剂；且基础缓冲液的pH值为7.0‑9.0。本发明的缓冲液可有效增强肌酸激酶同工酶冻干品的保存稳定性、复溶稳定性和冻融稳定性，利于以肌酸激酶同工酶冻干品作为质控品的诊断试剂的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种改性化学试剂，具体涉及一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)有四种同工酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)，其中MB主要分布于心肌细胞内，属于特异性心肌酶学指标，是心肌损伤时最先升高，升高幅度最大的心肌酶。心肌梗死时，肌酸激酶在发病6小时内升高，24小时达高峰，3～4日内恢复正常，所以其成为目前心肌梗死标志物之一。CK-MB测值的升降伴随ECG演变和胸痛病史。CK-MB含量和时间变化，对评估心肌损伤发病时间、梗死体积以及再灌注后损伤有重要意义。临床诊断上，肌酸激酶同工酶是急性心肌梗死及其他心肌损伤(例如心衰和心肌炎)诱因的重要生物标志物。心脏症状出现后3～8小时即可在血液中检测到肌酸激酶同工酶，根据病情病程，在很长时间内仍可检测到。
肌酸激酶同工酶质控品在使用之前会经历一段时间的储存和运输，即便按照试剂保存条件和效期规定使用，也有很大的不稳定风险，会给配套试剂的使用造成困扰。实际上，作为一种代谢酶类，肌酸激酶同工酶的稳定性极易受到环境因素，如温度、pH、氧化、机械力、冻融、辐射、化学品、微生物等的影响。真空干燥是目前用于生物制品干燥保存的一种最有效、最常用的方法，脱水可以有效减少环境因素对有效物质的影响，利于其长期储存和运输。在冷冻干燥过程和贮藏过程中，很多因素(例如，化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变温度、干燥固体中剩余水分、贮藏环境的温度和湿度等)都会影响其中活性组分的稳定性甚至会导致失活。因此，生物制品在冷冻干燥过程中，需要添加保护剂和添加剂，配成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥和贮藏。
发明内容
为解决上述技术中存在的问题，本发明提供一种提供利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液。
本发明提供一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其包括以下组分：含量为10-100mmol/L的基础缓冲液、5-20g/L惰性蛋白、5-20g/L糖类、5-50g/L的聚合物、1-5mmol/L的抗氧化剂、0.1-1mL/L防腐剂；且基础缓冲液的pH值为7.0-9.0。
优选地，所述基础缓冲液为PB缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且基础缓冲液含量为20-80mmol/L。
优选地，所述惰性蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白中的至少一种，且惰性蛋白含量为8～15g/L。
优选地，所述糖类为海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的至少一种，且糖类含量为8-20g/L。
优选地，所述聚合物为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种，且聚合物含量为8-20g/L。
优选地，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐中的至少一种，且抗氧化剂含量为2-4mmol/L。
优选地，所述防腐剂为ProClin150、ProClin300中的至少一种。
本发明的有益效果：
(1)本发明提出一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其中的惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂不仅能够在冷冻干燥过程中和冻干品贮存过程中保护肌酸激酶同工酶的空间结构和生物活性，还有助于冻干品复溶后的稳定性，防止冻融产生变性和沉淀。本发明可有效增强肌酸激酶同工酶冻干品的保存稳定性、复溶稳定性和冻融稳定性，利于以肌酸激酶同工酶冻干品作为质控品的诊断试剂的质量控制。
(2)本发明的一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其操作简便、可实现性强、成本低，可用于定性或定量肌酸激酶同工酶检测试剂盒的质控品。
具体实施方式
第一实施例：
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
本发明的一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计(下文含量表述方式均以此为准)，包括以下组分：含量为10-100mmol的基础缓冲液、5-20g惰性蛋白、5-20g糖类、5-50g的聚合物、1-5mmol的抗氧化剂、0.1-1mL防腐剂；且缓冲液的pH值为7.0-9.0。
其中，基础缓冲液为PB缓冲液(磷酸缓冲液)、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且其含量为20-80mmol。基础缓冲液的pH值为7.0-9.0，优选为7.5-8.5。基础缓冲液具备一定缓冲能力、溶解性高，有很好的生物适应性，pH值随外界影响的改变很小。为后续抗原抗体反应提供合适的反应环境(pH、渗透压、离子强度等)。适量基础缓冲液有利于维持肌酸激酶同工酶冻干品复溶后溶液的稳定状态，不易出现沉降、pH值浮动、反应信号值降低等情况，因此本发明选择含量为20-80mmol。
惰性蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白中的至少一种，且其含量为8～15g。惰性蛋白能够提高溶液中的蛋白浓度，减少环境条件如加热、紫外照射、氧化、剪切力等对肌酸激酶同工酶的破坏；惰性蛋白可以与肌酸激酶同工酶发生可逆结合，形成稳定的、可溶的高分子复合物，防止蛋白发生无定形聚集；惰性蛋白还可以与容器表面结合，减少肌酸激酶同工酶吸附在容器壁上而浓度降低。
糖类为海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的至少一种，且其含量为8-20g。糖类可以作为冻干过程中的填充剂，防止有效成分在抽真空时与水蒸气一起飞散，还能在冻结和干燥过程中防止活性组分发生冷冻变性，且对冻干品复溶后的冻融稳定性有益。
聚合物为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种，且其含量为8～20g。聚乙二醇在生物材料的低温保存和冷冻干燥过程中是很有效的低温保护剂，其保护效果与PEG的分子量有关。在一定程度上，它的低温保护能力远远大于其他低分子化合物(如蔗糖)。聚乙二醇还可以作为促凝剂，提高抗原抗体的反应速度，但添加量过多会导致非特异性免疫复合物生成，干扰实验结果。因此本发明选择含量为8-20g。
抗氧化剂为DTT(二硫苏糖醇)、β-巯基乙醇、TCEP(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)中的至少一种，且其含量为2-4mmol。肌酸激酶同工酶CKMB是一个二聚体，每个亚基的N末端通过一个长连接头和C末端连接，每个亚基表面活性部位有两个半胱氨酸残基，内部深埋三个半胱氨酸残基，所有半胱氨酸残基都以还原态巯基形式存在，表面的两个半胱氨酸残基是催化活性所必需的，而内部的三个半胱氨酸残基能够维持肌酸激酶同工酶的空间结构和正确折叠。过量的抗氧化剂加入也会破坏肌酸激酶同工酶的空间结构和正确折叠，因此加入2-4mmol抗氧化剂，防止肌酸激酶同工酶的巯基被氧化，使其维持正确的空间结构。
防腐剂为ProClin150、ProClin300中的至少一种。
以下通过具体实施例进行说明：
实施例1
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为20mmol的PB缓冲液、15g牛血清白蛋白、8g海藻糖、15g的聚乙二醇6000、3mmol的二硫苏糖醇、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为7.5。
实施例2
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为10mmol的HEPES缓冲液、8g人血清白蛋白、20g蔗糖、10g的聚乙二醇4000、2mmol的β-巯基乙醇、0.2mLProClin150，调整缓冲液的pH值为8.0。
实施例3
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为80mmol的Tris缓冲液、10g马血清白蛋白、10g甘露醇、20g的聚乙二醇8000、4mmol的TCEP、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为8.5。
对比例1
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为20mmol的PB缓冲液、15g牛血清白蛋白、8g海藻糖、15g的聚乙二醇6000、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是没有添加二硫苏糖醇。
对比例2
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为20mmol的PB缓冲液、15g牛血清白蛋白、8g海藻糖、30g的聚乙二醇6000、3mmol的二硫苏糖醇、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是添加了30g的聚乙二醇6000。
对比例3
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为20mmol的PB缓冲液、15g牛血清白蛋白、8g海藻糖、15g的聚乙二醇6000、5mmol的二硫苏糖醇、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是添加了5mmol的二硫苏糖醇。
对比例4
一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，以试剂总体积为1L计，其包括以下组分：含量为20mmol的PB缓冲液、15g牛血清白蛋白、8g海藻糖、15g的聚乙二醇6000、10mmol的TCEP、0.2mLProClin300，调整缓冲液的pH值为7.5。
本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是添加了10mmol的TCEP。
可以理解地，在上述实施例及其替换方案中，基础缓冲液还可以替换为PB缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种；惰性蛋白还可以替换为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白中的至少一种；糖类还可以替换为海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的至少一种；聚合物还可以替换为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种；抗氧化剂还可以替换为DTT(二硫苏糖醇)、β-巯基乙醇、TCEP(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)中的至少一种；防腐剂还可以替换为ProClin150、ProClin300中的至少一种；缓冲液的pH值为7.0-9.0。
表1 实施例1-3、对比例1-4的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液的配方
对比试验：
一、冻干品的热稳定性实验
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000。
试验步骤：分别以实施例1、2、3，对比例1的配方按照相同的比例稀释CKMB高值，配制成质控品1、2，冻干后分别于2～8℃和37℃放置7天，到期后以上海品峰医疗科技有限公司生产的肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒(化学发光法)测试浓度，根据《YY/T1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》，对热稳定性的数据进行偏差计算，测量结果的相对偏差应当不超过±15.0％。结果如表2所示。
表2CKMB冻干质控品热稳定性试验结果
由表2可以看出，添加了惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，37℃热破坏7天与2～8℃放置7天相比，浓度相对偏差均在15％内，未添加抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，37℃热破坏7天与2～8℃放置7天相比，浓度相对偏差大于15％，说明本发明的肌酸激酶同工酶冻干品缓冲液有较好的热稳定性。
二、冻干品的长期稳定性实验
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000。
试验步骤：以上海品峰医疗科技有限公司生产的肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒(化学发光法)测试分别在2～8℃放置0个月、2个月、4个月、6个月、6个月后一周的肌酸激酶同工酶冻干质控品1、2，根据《YY/T 1652-2019体外诊断试剂用质控物通用技术要求》，对长期稳定性的数据使用t检验进行趋势显著性检验，结果如表3-表6所示。
表3CKMB冻干质控品长期稳定性试验结果
表4CKMB冻干质控品长期稳定性试验结果
表5CKMB冻干质控品长期稳定性试验结果
表6CKMB冻干质控品长期稳定性试验结果
由表3-表6可以看出，添加了惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，2～8℃保存2、4、6个月、6个月后一周与0个月相比，|b1︳＜t0.05,n-2×S(b1)，趋势不显著；未添加抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，2～8℃保存2、4、6个月与0个月相比，|b1︳＞t0.05,n-2×S(b1)，趋势显著，说明本发明的肌酸激酶同工酶冻干品缓冲液有较好的长期保存稳定性。
三、冻干品复溶后在-20℃的保存稳定性
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000
试验步骤：将肌酸激酶同工酶冻干质控品1、2复溶，混匀后取一部分以上海品峰医疗科技有限公司生产的肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒(化学发光法)立即检测，另一部分冻存于-20℃30天后检测，结果如表7所示。
表7CKMB冻干质控品复溶后在-20℃的保存稳定性试验结果
由表7可以看出，添加了惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，复溶后在-20℃保存30天与刚复溶时相比，浓度相对偏差均在15％内，未添加抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，复溶后在-20℃保存30天与刚复溶时相比，浓度相对偏差大于15％，说明本发明的肌酸激酶同工酶冻干品缓冲液在复溶后有较好的-20℃保存稳定性。
四、冻干品复溶后的冻融稳定性
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000
试验步骤：将肌酸激酶同工酶冻干质控品1、2复溶，混匀后分4份，分别于-20℃冻融0次、1次、2次、3次，并以上海品峰医疗科技有限公司生产的肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒(化学发光法)检测浓度值，结果如表48所示。
表8CKMB冻干质控品复溶后的冻融稳定性试验结果
由表8可以看出，添加了惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，复溶后于-20℃冻融1、2、3次与刚复溶的质控品相比，浓度相对偏差均在15％内，未添加抗氧化剂的肌酸激酶同工酶冻干质控品，复溶后于-20℃冻融3次与刚复溶的质控品相比，浓度相对偏差大于15％，说明本发明的肌酸激酶同工酶冻干品缓冲液复溶后有较好的冻融稳定性。
五、反应性
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000
试验步骤：用实施例1-3和对比例2的缓冲液将肌酸激酶同工酶在线性范围内梯度稀释，空白稀释液编号为S0，系列稀释点从低到高编号为S1-S5，以上海品峰医疗科技有限公司生产的肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒(化学发光法)检测发光值(RLU)，结果如表9所示。
表9反应性试验结果
由表9可见，过量添加聚合物的对比例2的S1/S0与实施例相比明显偏低，非特异性反应增强。
六、冻干品复溶状态
试验仪器：上海品峰医疗科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪kunLuni2000
试验步骤：用实施例1-3和对比例3-4的缓冲液配制成肌酸激酶同工酶质控品，冻干后复溶，观察复溶状态，结果如表10所示。
表10冻干品复溶状态结果
由表10可见，过量添加抗氧化剂对蛋白结构会造成破坏。
以上实验结果表明，惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂不仅能够在冷冻干燥过程中和冻干品贮存过程中保护肌酸激酶同工酶的空间结构和生物活性，还有助于冻干品复溶后的稳定性，防止冻融产生变性和沉淀。尤其是抗氧化剂的加入，对于肌酸激酶同工酶的保护作用特别明显。但聚合物的过量加入影响反应性，抗氧化剂的过量加入影响冻干品复溶后的状态。因此，通过添加适量的惰性蛋白、糖类、聚合物、抗氧化剂，可以达到增强肌酸激酶同工酶冻干品的保存稳定性、复溶稳定性和冻融稳定性的效果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，包括以下组分：含量为10-100mmol/L的基础缓冲液、5-20g/L惰性蛋白、5-20g/L糖类、5-50g/L的聚合物、1-5mmol/L的抗氧化剂、0.1-1mL/L防腐剂；且基础缓冲液的pH值为7.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的一种利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述基础缓冲液为PB缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的至少一种，且基础缓冲液含量为20-80mmol/L。
3.根据权利要求1所述的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述惰性蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白中的至少一种，且惰性蛋白含量为8～15g/L。
4.根据权利要求1所述的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述糖类为海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖中的至少一种，且糖类含量为8-20g/L。
5.根据权利要求1所述的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述聚合物为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的至少一种，且聚合物含量为8-20g/L。
6.根据权利要求1所述的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐中的至少一种，且抗氧化剂含量为2-4mmol/L。
7.根据权利要求1所述的利于肌酸激酶同工酶冻干品稳定性的缓冲液，其特征在于，所述防腐剂为ProClin150、ProClin300中的至少一种。
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