CN116474080B - 一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents

一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方法和应用，属于生物基因工程技术领域。所述疫苗包括含有EgM123基因的表面展示型酿酒酵母表达载体；所述表面展示型酿酒酵母表达载体包括pYD1载体质粒。本发明制备的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗能明显诱导特异性分泌型IgA抗体应答及体液免疫应答，可针对性促使肠道抵御病原体感染，改善细粒棘球绦虫所致的肠道感染疾病；并且本发明提供的疫苗采用口服途径，主要刺激肠道粘膜免疫反应，所建立的保护更持久广泛，有实际的应用价值。

Description

一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，特别是涉及一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方法和应用。
背景技术
囊型包虫病(Cystic echinococcosis，CE)是由细粒棘球绦虫的幼虫：细粒棘球蚴(E.g)感染引起的人畜共患疾病，该病呈全球性分布，但又极易被忽视，其具有重要的社会经济影响。有研究对川西地区的犬粪样本进行检测，发现E.g总感染率为16.5％。E.g对牧区当地的经济发展及群众健康的危害十分严重，E.g的防治刻不容缓。
Zhang等从E.g分离得到EgM123、EgM4、EgM93个EgM家族基因。通过多次重组蛋白免疫效果实验发现，EgM123在宿主抵御E.g感染有明显保护作用，包括减少虫体负荷量、抑制虫体生长及抑制虫体繁殖产卵等方面。揭示EgM123有作为免疫原制备细粒棘球绦虫疫苗的潜力。
目前的寄生虫疫苗多为注射制剂，动物对针剂疫苗的受控程度差，服从性低，且动物对针刺敏感性很高，易产生应激反应，严重时会致使动物死亡，直接影响经济效益。口服疫苗的研制为解决这一问题提供了很好的平台，对于大型养殖场来讲，开发口服疫苗比传统的注射制剂更可取。
目前已有很多关于寄生虫口服疫苗的研究报道，如疟原虫、华枝睾吸虫、链状带绦虫等。并且经过很多实验验证口服疫苗在预防和治疗寄生虫病发面效果显著，具有良好的应用前景。Petavy等将EgTrp和EgA312种E.g重组蛋白克隆并在减毒沙门氏菌中表达以制备口服疫苗，经口投喂试验犬，结果显示犬虫体负担显著降低70％～80％，结果证明沙门氏菌口服疫苗EgA31-EgTrp有很好的效果，表明口服疫苗可以作为一种新的预防E.g的手段进行研究发展。但目前尚未有关于EgM123口服疫苗的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备的口服疫苗能够诱发黏膜免疫应答和体液免疫应答，可针对性促使肠道抵御病原体感染，为细粒棘球绦虫所致的肠道感染疾病防治提供新思路。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗，包括含有EgM123基因的表面展示型酿酒酵母表达载体。
进一步地，所述EgM123基因的核苷酸序列如GenBank登录号AF482718.1所示。
进一步地，所述表面展示型酿酒酵母表达载体包括pYD1载体质粒。
本发明提供一种所述的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建EgM123重组质粒；
(2)将步骤(1)中构建的EgM123重组质粒与pYD1质粒分别进行双酶切；
(3)步骤(2)中的两种双酶切产物进行连接反应；
(4)步骤(3)中连接产物转化至酵母感受态细胞中扩大培养，筛选阳性菌株即为所述细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗。
进一步地，在步骤(1)中，所述EgM123重组质粒为pMD19-T-EgM123重组质粒。
进一步地，在步骤(4)中，所述连接产物为pYD1-EgM123重组载体。
本发明还提供一种防治囊型包虫病的药物，包含所述的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗。
进一步地，所述细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗的给药次数为1-2次，每次间隔时间为15-20d。
本发明公开了以下技术效果：
细粒棘球绦虫主要针对于宿主的肠道寄生，本发明制备的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗能明显诱导特异性分泌型IgA抗体应答及体液免疫应答，可针对性促使肠道抵御病原体感染，改善细粒棘球绦虫所致的肠道感染疾病；并且本发明提供的疫苗采用口服途径，主要刺激肠道粘膜免疫反应，所建立的保护更持久广泛，有实际的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EgM123基因PCR扩增结果；M：DNAMarkerⅠ；1：EgM123 PCR产物；
图2为pMD19-T-EgM123的酶切分析电泳图；M：DNAMarkerⅠ；1：酶切产物；
图3为质粒pYD1的酶切分析电泳图；M：DNAMarkerⅠ；1：酶切产物；
图4为质粒pYD1-EgM123的酶切鉴定电泳图；M：DNAMarkerⅠ；1：酶切产物；
图5为表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-EgM123 PCR鉴定电泳图；M：DNAMarkerⅠ；1：酶切产物；
图6为EBY100/pYD1-EgM123蛋白免疫印记分析；M：蛋白Marker；1：诱导后EBY100/pYD1-EgM123与小鼠高免血清反应条带；2：EBY100/pYD1与小鼠高免血清反应条带；3：诱导后EBY100/pYD1-EgM123与His标签单克隆抗体反应条带；4：EBY100/pYD1与His标签单克隆抗体反应条带；
图7为表面展示型酿酒酵母的免疫荧光分析；A：EBY100/pYD1-EgM123的荧光分析；B：EBY100/pYD1的荧光分析；(50μm；放大倍数：400×)；
图8为Regimen 1、Regimen 2、Regimen 3三种免疫方案的流程图；
图9为各组小鼠血清特异IgG梯度；
图10为小鼠血清特异IgM梯度；
图11为小鼠粪便特异IgA梯度；
图12为小鼠细胞因子IL-1检测结果；
图13为小鼠细胞因子IL-4检测结果；
图14为小鼠细胞因子IL-5检测结果；
图15为小鼠细胞因子IL-17检测结果；
图16为小鼠细胞因子γ-干扰素检测结果；
图17为小鼠细胞因子CD4检测结果；
图18为小鼠细胞因子CD8检测结果；
图19为三种免疫方案小鼠血清中总IgG梯度；A：Regimen 1；B：Regimen 2；C：Regimen3；
图20为三种免疫方案小鼠血清中总IgM梯度；A：Regimen 1；B：Regimen 2；C：Regimen3；
图21为三种免疫方案小鼠粪便中总IgA梯度；A：Regimen 1；B：Regimen 2；C：Regimen3。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1表面展示型酿酒酵母表达载体的构建及鉴定
1实验材料
细粒棘球绦虫原头蚴由省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室提供。
2实验方法
2.1引物设计
根据NCBI中EgM123基因序列(GenBank登录号：AF482718.1，基因CDs为594bp)，利用Primer 5.0软件设计特异性引物，在上、下游引物中设计酶切位点，合成引物。引物序列见表1，引物浓度为10μM。
表1引物序列
注：下划线标注为酶切位点。
2.2细粒棘球绦虫原头蚴总RNA提取
按照超纯RNA提取试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)说明书提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA。
2.3细粒棘球绦虫原头蚴总RNA反转录
按照RNA反转录试剂盒(购自诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书对2.2提取的总RNA进行反转录，得到cDNA，于-20℃保存备用。
2.4EgM 123的克隆
2.4.1EgM123的扩增
以2.3反转录的cDNA为模板，使用表1中的引物对序列进行特异性PCR扩增。PCR程序及体系见表2。
表2EgM123基因PCR扩增体系及程序
2.4.2PCR产物的回收
将2.4.1中的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳完成后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)按照说明书进行胶回收。
2.5胶回收产物的连接、转化、筛选及鉴定
将回收产物与pMD-19-T载体在4℃条件下进行过夜连接。将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，涂布于含有Amp抗性的LB固体筛选培养基，37℃过夜培养。次日挑取单菌落，接种至1mL含有100μg/mLAmp的LB液体培养基，37℃180rpm扩大培养4h后，进行菌液PCR鉴定。反应体系如2.4.1常规PCR所示。将PCR产物用2％的琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定为阳性的菌株(条带亮且单一，大小符合目的片段)菌液加入等体积50％甘油混匀送至上海生工测序，其余-20℃保存。测序结果与目的序列进行比对。经PCR验证为阳性且测序正确的菌液扩大培养后进行质粒提取，所提重组质粒命名为pMD19-T-EgM123。
2.6EgM123的酶切分析、切胶回收
将重组质粒pMD19-T-EgM123在37℃水浴锅进行1h双酶切反应。酶切体系见表3。
表3pMD19-T-EgM123双酶切体系
配置1.5％琼脂糖凝胶，将酶切产物加入10×Loading Buffer混匀进行点样，120V电泳至合适位置。回收后的DNA命名为EgM123(B/X)，于-20℃保存，待用。
2.7pYD1质粒的提取与酶切分析
2.7.1pYD1质粒的抽提纯化
pYD1质粒转化、抽提方法同2.5一致，所得到的pYD1质粒于-20℃保存，待用。
2.7.2pYD1的酶切分析、切胶回收
根据2.6的步骤，进行BamH I和Xho I双酶切、电泳及切胶回收。回收后的DNA命名为pYD1(B/X)，于-20℃保存，待用。酶切体系同表3(表3中pMD19-T-EgM123质粒替换成pYD1质粒)。
2.8质粒pYD1-EgM123的构建
2.8.1EgM123(B/X)与pYD1(B/X)的连接
反应体系见表4。
表4EgM123(B/X)与pYD1(B/X)连接体系
2.8.2质粒载体转化、筛选及鉴定
将连接好的EgM123(B/X)-pYD1(B/X)基因片段转化至E.coli DH5α感受态细胞，质粒转化、抽提方法同2.5一致，所提重组质粒命名为pYD1-EgM123。将所提重组质粒作为酶切对象，使用BamH I/Xho I酶进行双酶切鉴定。酶切体系同表3(表3中pMD19-T-EgM123质粒替换成pYD1-EgM123质粒)。
2.9表面展示型酿酒酵母表达载体的构建
2.9.1酵母EBY100感受态细胞的制备
(1)挑取一环S.cerevisiaeEBY100菌株接种于5mLYPD培养基中30℃，250-300rpm培养过夜。
(2)取适量过夜培养液分别接种于两瓶50mLYPD培养基中，250-300rpm培养约16-18h(OD600nm:1.3-1.5)。
(3)于4℃，4000g离心收集菌体，用25mL冰浴的无菌水洗涤一次后，细胞用10mL冰浴的无菌水重悬，可换成较小的离心管。
(4)加入1mL的10×TE缓冲液(PH 7.5)，摇晃均匀，再加入1mL 10×乙酸锂，旋转摇匀，于30℃轻轻摇动45min。
(5)再加入0.4mL 1mol/LDTT，并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15min。
(6)于4℃，4000-6000g离心，弃上清(用枪吸取)，再用25mL冰浴的无菌水洗涤，4℃离心收集菌体。
(7)用2.5mL冰冷的1mol/L山梨醇重悬细胞，离心收集菌体，弃上清(用枪吸取)。
(8)每管用100μL 1mol/L山梨醇溶解，分装于EP管中(80μL/管)，于-80℃保存备用。酿酒酵母EBY100感受态细胞已经制备好，可用于接下来的质粒DNA转化实验。
2.9.2质粒pYD1-EgM123的化学转化
(1)取2.9.1制备好的S.cerevisiaeEBY100感受态细胞100μL于冰上融化，一次加入预冷的2.8.2得到的pYD1-EgM123质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μL，pEG/LiAc 500μL吹打混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次)。
(2)42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次)。
(3)5000rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μL重悬，离心30s，弃上清。
(4)ddH2O 50μL重悬，涂板于亮氨酸MD固体培养基，30℃培养至菌落长至2-3nm大小(约培养36-48h)。
同时转化pYD1质粒作阴性对照。
(1)取2.9.1制备好的S.cerevisiaeEBY100感受态细胞100μL于冰上融化，一次加入预冷的2.7.1得到的pYD1质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μL，pEG/LiAc 500μL吹打混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次)。
(2)42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次)。
(3)5000rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μL重悬，离心30s，弃上清。
(4)ddH2O 50μL重悬，涂板于亮氨酸MD固体培养基，30℃培养至菌落长至2-3nm大小(约培养36-48h)。
2.9.3阳性克隆的筛选及鉴定
次日从平板挑取单菌落，进行PCR鉴定，含有pYD1-EgM123的酵母细胞为阳性表面展示型酿酒酵母载体，命名为EBY100/pYD1-EgM123。同时，将pYD1质粒转化后的表面展示型酿酒酵母载体作为阴性对照，命名为EBY100/pYD1。
3结果
3.1EgM123基因的PCR扩增结果
为构建带有EgM123基因的表达载体，首先需要通过PCR获得EgM123基因。以E.g原头蚴cDNA作为模板，PCR扩增产物的电泳分析如下图1所示，EgM123基因长度理论值应该是在594bp，图1中Lane 1有600bp左右亮条带，与预期结果相符。电泳结果显示有且只有一条亮带，表示其具有较高特异性，因此，经PCR扩增所得EgM123基因可用于后续实验。
3.2pMD19-T-EgM123的酶切鉴定
利用限制性内切酶BamH I/Xho I对环化pMD19-T-EgM123进行双酶切，酶切产物电泳分析如下图2所示。Lane 1可见在600bp处有一暗带即为酶切下的目的片段，大小符合预期，且可成功被BamH I/Xho I双酶切，可用于后续实验。
3.3质粒pYD1的酶切分析
用限制性内切酶BamH I/Xho I对质粒pYD1进行双酶切，酶切产物电泳分析如图3所示。质粒pYD1经BamH I/Xho I双酶切后理论长度为4961bp，图3中可见约在5000bp处有一亮带，大小符合预期，且可成功被BamH I/Xho I双酶切，可用于后续实验。
3.4pYD1-EgM123的酶切鉴定
将质粒pYD1-EgM123进行双酶切，酶切产物电泳分析如下图4所示。可见Lane 1有两条亮带，从上至下依次是4961bp、594bp，与预期长度一致。电泳结果图说明EgM123基因已经成功插入到质粒pYD1中。
3.5EgM123目的基因的PCR鉴定
通过PCR对EgM123基因片段是否成功插入S.cerevisiaeEBY100进行检测。所得PCR产物电泳分析如图5所示。预期所插入的EgM123基因片段长度为594bp，图5中可见Lane 1显示在600bp左右有一单一亮带，与预期一致，说明扩增特异性较高。由PCR鉴定可知，pYD1-EgM123已成功克隆到S.cerevisiaeEBY100。
4结果分析
酵母菌(yeast)被广泛应用于食品工业，是一种直径达到10μm的单细胞真核生物，具有翻译后再修饰的能力，并且酵母通过了美国食品药品监督管理局(FDA)的GRAS认证，可以保证其的生物安全性。酵母菌的细胞壁可以保护抗原通过胃肠道，正因为酵母的疫苗传递系统有以上特点，所以其非常适合用于口服疫苗的开发。
质粒pYD1可以穿梭于E.coil DH5α与酿酒酵母EBY100之间。筛选E.coil DH5α/pYD1-EgM123阳性克隆时需要使用Amp筛选培养基，构建EBY100/pYD1-EgM123后进行阳性筛选时需要使用色氨酸营养缺失型筛选培养基，因为带有目的基因的pYD1整合到EBY100的基因组时抗性标记便随即丢失。
本发明通过酶切分析、PCR鉴定证明成功构建了表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-EgM123，为EgM123口服疫苗免疫原性探究工作奠定了基础。
实施例2表面展示型酿酒酵母中EgM123蛋白的定位鉴定及定量分析
1重组表面展示型酿酒酵母的诱导表达
(1)挑取EBY100/pYD1-EgM123的单克隆菌落，接种于含2％的葡萄糖的YNB-CAA液体培养基，30℃、250rpm培养12-16h。检测OD600nm在2.0-5.0之间。
(2)将所述菌液重新接种于含2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基，20℃、250rpm诱导培养72h。
2％葡萄糖YNB-CAA菌液转移量计算方法：
假设新用2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基10mL，则：转移量×OD600nm值＝(10+转移量)×0.75。
2酵母表面EgM123蛋白的Western Blot鉴定
离心收集诱导表达蛋白72h后的酵母细胞并提取酵母细胞表面蛋白。取1中制备的菌液OD600nm，12000rpm，离心5min；弃上清，取80μLPBS重悬菌体；加入20μL 5×SDS上样缓冲液，吹打混匀，100℃煮沸10min；对照组EBY100/pYD1同样方法处理。
先将上述制备好的样品用SDS-PAGE凝胶进行电泳，为检测EgM123基因重组蛋白是否已经表达在酿酒酵母EBY100，电泳结束后，对诱导72h后的EgM123重组蛋白进行Westernblot检测。采用一抗分别为通过免疫EgM123原核表达蛋白制备的小鼠高免血清(1：100)；兔抗His标签单克隆抗体(1：1000)，二抗分别为HRP标记的山羊抗鼠IgG(1：10000)；HRP标记的山羊抗兔IgG(1：10000)。
具体操作步骤：
(1)制备蛋白质电泳凝胶，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
(2)上述步骤完成后，切下目的蛋白，放入转膜缓冲液中进行平衡，共3次，每次4min。
(3)将剪好的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)浸泡在甲醇溶液中3-6min进行激活。
(4)将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)和12层中性分析滤纸，浸于转移缓冲液中平衡10min。
(5)按顺序将阴极电极板、6层用转膜缓冲液平衡的滤纸、凝胶、PVDF膜、6层用转膜缓冲液平衡的滤纸置于Bia-Rad半干式转印槽内，每层放置时轻轻用玻棒擀去气泡，最后盖上阳极电极板。
(6)联通电极，加入转移缓冲液，将转移槽放置在置有冰袋的水盆里降温，80V转移1.5h。
(7)转移结束后，取出PVDF膜，将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有5％脱脂奶粉的封闭液平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
(8)将一抗用封闭液稀释至适当浓度，4℃过夜孵育后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
(9)将二抗用TBST溶液稀释至要求浓度，并与膜转蛋白一面充分接触，室温下孵育2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
(10)将PVDF膜置于平皿中，将PVDF膜浸于刚配好的底物显色液冲洗，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min(20～25℃)。
(11)显色后，用双蒸水冲洗PVDF膜终止显色，室温下晾干。
(12)将结果进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
3免疫荧光分析
利用激光共聚焦显微镜检测EgM123基因重组蛋白是否已经定位表达在了酿酒酵母EBY100的表面。对诱导72h后的EgM123重组蛋白进行免疫荧光检测，一抗为通过免疫EgM123原核表达蛋白制备的小鼠高免血清(1：100)，二抗为FITC标记的山羊抗鼠IgG(1：10000)。
具体操作步骤：
(1)取半乳糖诱导72h后的EBY100/pYD1-EgM123菌液2OD600mm，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清，保留沉淀。另取半乳糖诱导72h后的EBY100/pYD1作为阴性对照。
(2)用500μL的无菌1×PBS洗涤沉淀3次,每次6000rpm,4℃，离心5min,弃上清。
(3)用无菌PBS将鼠抗-EgM123多克隆抗体(一抗)稀释，稀释比例为1:200，在4℃条件下，用500μL稀释过的一抗，孵育过夜。
(4)回收一抗，重复步骤(2)。
(5)加入500μL用无菌PBS 1:5000稀释的FITC-标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h。
(6)重复步骤(2)。
(7)菌体悬浮于50μL无菌PBS中。
(8)取5μL菌液滴于干净的载玻片上，盖上盖玻片，边缘涂上透明树脂固定盖玻片。
(9)在共聚焦荧光显微镜下观察。
4实验结果
4.1Westernblot分析
Westernblot结果如图6所示，EBY100/pYD1-EgM123诱导后蛋白既能被小鼠高免血清识别，也能被His标签单克隆抗体识别，在30KDa附近出现条带，这与预期EBY100/pYD1-EgM123蛋白大小一致(约为31.78KDa)，表明EgM123蛋白表达在酿酒酵母EBY100细胞内。
4.2免疫荧光分析
通过免疫荧光分析，可以直观地说明诱导后的EBY100/pYD1-EgM123将EgM123蛋白成功地展示在酿酒酵母菌表面。结果如图7所示，EBY100/pYD1-EgM123有明显绿色荧光，EBY100/pYD1未出现绿色荧光，说明EgM123蛋白定位表达在酿酒酵母的表面。
经Western blot、免疫荧光实验验证说明本发明成功将EgM123蛋白定位表达在酿酒酵母的表面。
实施例3表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-EgM123免疫活性分析
1实验方法
1.1免疫前准备
1.1.1重组表面展示型酿酒酵母的诱导表达
(1)将EBY100/pYD1-EgM123、EBY100/pYD1分别接种于含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基，30℃250rpm过夜培养。
(2)取过夜培养菌液，根据转接量计算方法，将培养液转接于新鲜的含2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基，20℃250rpm诱导培养72h。
(3)诱导完成后，通过酶标仪测定EBY100/pYD1-EgM123(72h)、EBY100/pYD1(72h)的OD600nm值。
(4)5000rpm/min 4℃离心10min，弃上清收集沉淀，沉淀菌体用无菌PBS漂洗3次。
(5)无菌PBS重悬漂洗后的菌体，将其浓度调整至0.2OD600nm/μL，准备灌胃。
1.1.2免疫小鼠
(1)给药方案：第1d首次免疫(Prime)，第16d加强免疫(Boost)。
(2)8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠共60只，随机6只小鼠/组，EBY100/pYD1-EgM123为实验组，EBY100/pYD1为空载体对照组，EBY100为空酵母菌对照组，PBS为阴性对照组，共10组。按照图8所示的Regimen 1、Regimen 2、Regimen 3免疫方案的流程图进行免疫，考察Regimen 1、Regimen 2、Regimen 3三种免疫方案(剂量单位均为μg)的免疫效果。
(3)小鼠每次免疫前禁食6h。
1.2抗体、细胞因子水平检测
1.2.1血清的采集及处理
(1)每次免疫前及第30d，对小鼠进行眼眶后静脉丛采血(大约500μL)，4℃静置12h。
(2)2000rpm/min，4℃离心15min。取上清，保存于-80℃备用。
1.2.2粪便的采集及处理
(1)每次免疫前及第30d，取小鼠粪便150mg溶于300μL于无菌PBS中，浸泡2h。
(2)剧烈震荡，使其充分溶解后12000rpm/min，4℃离心5min。取上清，保存于-20℃备用。
1.2.3抗体水平检测
从-80℃取出小鼠血清，待其于4℃融化，若出现沉淀需再次离心取上清，使用样本稀释液10倍稀释(所得数据结果×10)。用ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG、IgM及小鼠粪便中特异性IgA水平。
1.2.4细胞因子检测
使用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(小鼠IL-1、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γELISA试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，小鼠CD 4因子、CD8因子ELISA试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司)测定IL-1、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γ、CD4、CD8细胞因子水平。
1.2.5数据处理及分析
抗体、细胞因子检测数据采用Graph Pad软件中的独立样本T检验进行统计学分析，P＜0.05时，组间差异具有统计学意义。并用Graph Pad软件作图。
2结果
2.1实验小鼠抗体水平变化
用ELISA法检测实验小鼠体内特异抗体水平变化。实验结果如图9、图10、图11所示，免疫第15d、30dEBY100/pYD1-EgM123疫苗组血清特异性IgG、IgM抗体和粪便特异性IgA抗体的分泌均高于PBS组、EBY100组及EBY100/pYD1组。与PBS组相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时血清特异IgM、粪便特异IgA抗体分泌水平就已经极其显著增强(P＜0.001)，而血清特异IgG无显著变化(P＞0.05)；在30d时，血清特异IgG抗体分泌水平极显著增强(P＜0.01)。与EBY100组相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时，血清特异IgG抗体分泌水平显著增强(P＜0.05)，粪便特异IgA抗体分泌水平极显著增强(P＜0.01)，血清特异IgM抗体分泌水平极其显著增强(P＜0.001)；第30d时血清特异IgG抗体分泌水平依旧显著增强(P＜0.05)，而血清特异IgM、粪便特异IgA分泌水平极其显著增强(P＜0.001)。
2.2实验小鼠血清内细胞因子变化
2.2.1小鼠细胞因子IL-1检测结果
小鼠细胞因子IL-1结果如图12所示，与PBS组相比EBY100、EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-EgM123在第15d及30d时，IL-1分泌量皆极其显著降低(P＜0.001)。
2.2.2小鼠细胞因子IL-4检测结果
小鼠细胞因子IL-4ELISA实验结果如图13所示，与PBS组相比EBY100组、EBY100/pYD1组、EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时IL-4分泌量无显著差异变化(P＞0.05)；第30d时，EBY100组、EBY100/pYD1组IL-4分泌量极其显著降低，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组IL-4分泌量降低极显著。第30d时，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组比EBY100组IL-4分泌量极其显著升高，比EBY100/pYD1组显著升高。
2.2.3小鼠细胞因子IL-5检测结果
小鼠细胞因子IL-5ELISA实验结果如图14所示，第15d和30d各组相比IL-5分泌皆无显著差异变化(P＞0.05)。
2.2.4小鼠细胞因子IL-17检测结果
小鼠细胞因子IL-17水平ELISA实验结果如图15所示，与PBS组、EBY100组及EBY100/pYD1组相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时IL-17分泌水平极其显著增强(P＜0.001)；第30d时，依旧如此。
2.2.5小鼠细胞因子IFN-γ检测结果
小鼠细胞因子IFN-γELISA实验结果如图16所示，与PBS组相比，EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时IFN-γ分泌水平极其显著增强(P＜0.001)；第30d时，与PBS组、EBY100组及EBY100/pYD1组相比，IFN-γ分泌水平极其显著增强(P＜0.001)。
2.2.6小鼠细胞因子CD4检测结果
小鼠CD4分子ELISA实验结果如图17所示，第15d时，与PBS组相比，EBY100组、EBY100/pYD1组CD4分子分泌极显著降低(P＜0.01)，但是EBY100/pYD1-EgM123疫苗组与PBS组相比无差异(P＞0.05)。第30d时，与PBS组相比，EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123疫苗组CD4分子分泌极显著升高(P＜0.01)。
2.2.7小鼠细胞因子CD8检测结果
小鼠CD8分子ELISA实验结果如图18所示，与PBS组相比，EBY100组、EBY100/pYD1组及EBY100/pYD1-EgM123疫苗组在第15d时CD8分子分泌量极显著降低(P＜0.01)，在第30d时分泌量极其显著降低(P＜0.001)。
2.3不同免疫方案对小鼠抗体的影响
2.3.1不同免疫方案对血清IgG的影响
为了探索最佳免疫方案，分别用Regimen 1、Regimen 2、Regimen 3三种免疫方案对SPF级的BALB/c小鼠进行灌胃免疫。
在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgG抗体在OD450nm的吸收值分别为2.47±0.194、2.47±0.138、2.40±0.160、2.97±0.174，加强免疫后，分别为2.46±0.217、2.57±0.423、2.83±0.282、3.41±0.163(图19中A)。
在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgG抗体在OD450nm的吸收值分别为2.43±0.178、2.24±0.178、2.25±0.211、2.73±0.046，加强免疫后，分别为2.44±0.194、2.58±0.445、2.54±0.078、3.46±0.265(图19中B)。
在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgG抗体在OD450nm的吸收值分别为2.21±0.178、2.03±0.178、2.11±0.209、2.59±0.052，加强免疫后，分别为2.22±0.189、2.36±0.446、2.35±0.079、3.32±0.264(图19中C)。
2.3.2不同免疫方案对血清IgM的影响
在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgM抗体在OD450nm的吸收值分别为1.24±0.021、1.35±0.071、1.34±0.021、1.78±0.134，加强免疫后，分别为1.37±0.064、1.77±0.007、1.58±0.099、2.52±0.184(图20中A)。
在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgM抗体在OD450nm的吸收值分别为1.14±0.120、1.39±0.021、1.38±0.035、1.84±0.049，加强免疫后，分别为1.65±0.332、1.80±0.042、1.55±0.049、2.46±0.276(图20中B)。
在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgM抗体在OD450nm的吸收值分别为1.14±0.127、1.35±0.035、
1.37±0.049、1.65±0.212，加强免疫后，分别为1.71±0.247、1.79±0.057、1.74±0.219、2.54±0.389(图20中C)。
2.3.3不同免疫方案对粪便IgA的影响
在Regimen 1免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgA抗体在OD450nm的吸收值分别为2.20±0.042、2.67±0.057、2.52±0.057、2.89±0.028，加强免疫后，分别为2.47±0.035、2.81±0.113、2.95±0.212、4.30±0.071(图21中A)。
在Regimen 2免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgA抗体在OD450nm的吸收值分别为2.19±0.057、2.63±0.120、2.68±0.283、2.69±0.318，加强免疫后，分别为2.58±0.120、3.08±0.488、3.15±0.071、4.86±0.714(图21中B)。
在Regimen 3免疫方案下，首次免疫后15d，PBS组、EBY100组、EBY100/pYD1组和EBY100/pYD1-EgM123组的IgA抗体在OD450nm的吸收值分别为2.19±0.049、2.60±0.085、2.73±0.219、2.60±0.198，加强免疫后，分别为2.62±0.057、3.19±0.325、3.04±0.226、5.50±0.198(图21中C)。
3结论分析
本发明选择SPF级BALB/c小鼠作为研究细粒棘球绦虫口服疫苗的动物模型，通过ELISA检测口服疫苗诱导的特异性的IgG、IgA和IgM抗体应答，通过结果可发现小鼠血清中的抗体水平可以随着免疫次数增加而上升，其中IgA升高水平尤为显著。这些结果表明EBY100/pYD1-EgM123表面展示型酿酒酵母口服疫苗载体可诱导小鼠产生特异性抗体，具有较好的免疫保护作用。
IgA抗体是黏膜免疫的重要检测对象，分泌型IgA是黏膜免疫应答的特征性抗体。通过黏膜途径(口服免疫)诱导的分泌型IgA在胃黏膜表面形成重要的免疫保护层，构成生物屏障进而防止细菌进入黏膜。分泌型IgA不能通过经典途径活化补体，也没有调理素的作用，所以不会引起炎症反应。因此，分泌型IgA可以阻止微生物渗透到黏膜但不会引起肠道粘膜较脆弱的组织产生炎症损伤，这对于肠道抵御病原体感染非常有利。本发明通过ELISA检测粪便中特异性分泌型IgA，表明EBY100/pYD1-EgM123能诱导特异性分泌型IgA抗体应答。
在包虫病中，宿主在感染细粒棘球绦虫后以两种免疫反应为主：Th1型和Th2型，Th1型能够抑制虫体发育生长、降低虫体在宿主体内致病作用；Th2型介导体液反应，起免疫抑制作用。Th1型和Th2型免疫反应之间相互制衡。而正常的肠道固有层中可以检测到属于CD4T细胞的三个主要功能性亚群：Th1、Th2、Th17。其中Th17亚群可产生IL-17和IL-22，可促进表达这两类细胞因子受体的肠道上皮细胞加速分泌黏液和β-防御素，具有保护黏膜作用。
本发明分别测定了Th1、Th2及Th17型的细胞因子，结果发现EBY100/pYD1-EgM123疫苗组对小鼠细胞因子IL-17、IFN-γ的分泌量显著加强(P＜0.001)，提示EBY100/pYD1-EgM123表面展示型酿酒酵母疫苗在小鼠体内成功诱导了Th17型、Th1型免疫。
表面展示型酿酒酵母口服疫苗载体具有较好的免疫保护作用。口服递送的表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-EgM123除了能够诱导机体产生黏膜免疫应答之外，还可以诱导体液免疫。鉴于口服免疫需要的剂量较高，在给药总剂量一定的条件下，本发明为了探究表面展示型酿酒酵母表达载体EBY100/pYD1-EgM123的免疫效果设置了不同的免疫剂量，考察了三个不同给药时间、及不同单次给药剂量对免疫效果的影响，实验证明，当运用Regimen3方案给药时，在EBY100/pYD1-EgM123中检测到血清特异IgM抗体效价和粪便特异IgA抗体水平最高，所以最优免疫方案是Regimen 3。单次免疫后，实验组粪便特异IgA抗体水平显著高于空白对照组和免疫对照组(p<0.05)，表明EBY100/pYD1-EgM123仅单次免疫就能诱发黏膜免疫应答(粪便IgA)。初次免疫15d后，以同样给药方案加强一次免疫，检测到实验组血清特异IgG、IgM抗体效价显著升高，且与空白对照组和免疫对照组存在显著性差异(p<0.05)，表明EBY100/pYD1-EgM123需要经过加强免疫才能诱发有意义的体液免疫应答(血清IgG和IgM)。
综上，本发明成功构建了EBY100/pYD1-EgM123表面展示型酿酒酵母表达载体，并将其免疫小鼠。通过小鼠血清、粪便中抗体变化和血清中细胞因子分泌情况，结果发现，EBY100/pYD1-EgM123口服酵母活载体疫苗具有免疫原性，能刺激小鼠产生免疫应答，成为E.g具有特异性治疗价值的新型候选疫苗。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗，其特征在于，含有基于表面展示型酿酒酵母基因表达载体pYD1表达外源基因EgM123的酿酒酵母菌体；
所述外源基因EgM123的核苷酸序列如GenBank登录号AF482718.1所示。
2.一种如权利要求1所述的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建EgM123重组质粒；所述EgM123重组质粒为pMD19-T-EgM123重组质粒；
（2）将步骤（1）中构建的EgM123重组质粒与pYD1质粒分别进行双酶切；
（3）步骤（2）中的两种双酶切产物进行连接反应；
（4）步骤（3）中连接产物转化至酵母感受态细胞中扩大培养，筛选阳性菌株即为所述细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗；所述连接产物为pYD1-EgM123重组载体。
3.一种防治囊型包虫病的药物，其特征在于，包含权利要求1所述的细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述细粒棘球绦虫表面展示型酿酒酵母口服疫苗的给药次数为1-2次，每次间隔时间为15d。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013142278A1 (en) * 2012-03-22 2013-09-26 New York University Plasmodium vivax vaccine compositions
CN107510841A (zh) * 2017-08-03 2017-12-26 新疆医科大学第附属医院 源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗
CN109082435A (zh) * 2017-04-24 2018-12-25 西南交通大学 一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法
CN110408637A (zh) * 2019-08-08 2019-11-05 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用
CN111440816A (zh) * 2020-03-06 2020-07-24 天津大学 表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用
CN113181352A (zh) * 2021-04-28 2021-07-30 新疆农垦科学院 一种犬抗囊型包虫dna疫苗及其构建方法和应用
CN113354722A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 细粒棘球绦虫Severin蛋白在检测囊型包虫病和细粒棘球绦虫感染试剂盒中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3424524A3 (en) * 2017-07-04 2019-02-27 CureVac AG Cancer rna-vaccine

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013142278A1 (en) * 2012-03-22 2013-09-26 New York University Plasmodium vivax vaccine compositions
CN109082435A (zh) * 2017-04-24 2018-12-25 西南交通大学 一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法
CN107510841A (zh) * 2017-08-03 2017-12-26 新疆医科大学第附属医院 源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗
CN110408637A (zh) * 2019-08-08 2019-11-05 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用
CN111440816A (zh) * 2020-03-06 2020-07-24 天津大学 表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用
CN113181352A (zh) * 2021-04-28 2021-07-30 新疆农垦科学院 一种犬抗囊型包虫dna疫苗及其构建方法和应用
CN113354722A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 细粒棘球绦虫Severin蛋白在检测囊型包虫病和细粒棘球绦虫感染试剂盒中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dog vaccination with EgM proteins against Echinococcus granulosus;Zhang ZZ等;Infect Dis Poverty.;第7卷(第1期);1-8 *
抗细粒棘球绦虫疫苗候选抗原免疫犬IgG抗体水平监测及免疫组化定位研究;赵莉等;中国预防兽医学报;第40卷(第6期);538-542 *
细粒棘球绦虫成虫相关基因EgM123的克隆、表达及鉴定;王慧等;中国病原生物学杂志;第12卷(第1期);38-41 *

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