CN118344987A - 一种表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的口服重组酵母、多组分疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原同源分子的口服重组酵母疫苗，上述酵母疫苗中表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原同源分子(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)，可明显抑制子孢子的入侵。上述口服重组酵母疫苗实现了EtAMA1‑4在酿酒酵母表达系统中的高效表达，具有较好的免疫保护效果，可用于柔嫩艾美耳球虫感染的免疫预防，可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。

Description

一种表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的口服重组酵母、多组分 疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的口服重组酵母、针对上述柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的单克隆抗体、含有上述两种有效成分的多组分疫苗及其应用。

背景技术

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属(Eimeria spp.)球虫寄生于鸡的肠道上皮细胞所引起的寄生原虫病，是集约化养殖业危害最大的流行病之一，给全世界养禽业造成了庞大的经济损失，严重制约产业的健康发展。在全球范围内，鸡球虫病防治的费用从2002年的8亿美元上升到2006年的30亿美元。到2020年，全球损失被重新估算为每年约104亿英镑。实践证明，疫苗接种能有效控制球虫病，是禁抗限抗背景下球虫病防控的发展趋势。但目前广泛使用的商品化球虫疫苗均是活疫苗，由3-8种球虫活卵囊组成，免疫后影响生产性能，且存在散毒、生产过程繁琐、价格昂贵等不足，因此，迫切需要研制新型口服球虫病疫苗。

顶膜抗原(Apical membrane antigens，AMAs)是顶复门原虫中一类高度保守的微线蛋白，能与棒状体分泌的棒状体颈部蛋白2(Rhoptry neck proteins 2，RON2s)相互作用形成复合物(AMAs-RON2s)且该复合物分布于运动连接环(Moving juncture，MJ)，是虫体入侵细胞的关键结构。近年来研究发现，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)具有4个AMA同源分子(AMA1-4)。在前期研究中，本实验室发现EtAMA1、EtAMA3是子孢子阶段调控表达，其抗体对子孢子的入侵具有显著的抑制效果；EtAMA2在裂殖子阶段表达，对子孢子的入侵抑制效果不明显；EtAMA4在裂殖子和子孢子阶段中均有表达，其抗体对子孢子的入侵具有显著的抑制效果。EtAMAs分子可以与对应的RON2s分子发生互作：EtRON2与EtAMA1、EtRON2L1-1与EtAMA4、EtRON2L1-2与EtAMA4、EtRON2L2与EtAMA3之间存在互作关系。已有研究表明，EtAMAs分子是球虫入侵的关键蛋白，可作为疫苗的候选抗原分子。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母长期以来一直被用于重组可溶性蛋白质的生产，用于疫苗接种等方面。近期，酿酒酵母以全重组酵母(活或死)方式被作为口服疫苗递送载体，可达到抗原表达、运输以及自身作为佐剂等多种目的。除了方便的免疫方式，重组酿酒酵母的口服免疫还可以促进疫苗与球虫入侵部位的肠黏膜表面直接相互作用，通过模式识别受体(PRRs)刺激免疫应答，可不依赖佐剂。此外，酿酒酵母及其细胞壁衍生物已被用作家禽的饲料添加剂，即使没有添加疫苗抗原，单独的酿酒酵母及其衍生物可明显减少球虫的卵囊产量和改善球虫感染期间的生产性能。已有的研究表明，将表达了球虫微线体蛋白的酿酒酵母活菌以口服的方式免疫鸡只后，能有效减少卵囊排出量和盲肠病变程度。最后，重组酵母可以被灭活，通常被认为是安全的(GRAS)的，失活可以通过改变酵母细胞表面结构如b-1,3葡聚糖的分布和暴露来增强酵母系的抗原性。

总之，酵母载体疫苗由于其安全性、免疫方式、生产成本等方面的显著优势，近年来受到关注。但是酵母疫苗同样存在效价低，稳定性差等问题。而现有技术中的亚单位疫苗、DNA疫苗免疫时，可明显减少寄生虫繁殖和肠道病变程度，例如重组蛋白通过皮下或肌肉注射免疫3次后，可明显降低低剂量攻虫后的卵囊产量(OPG)。但重组疫苗这种以肌内注射或其他逐只免疫的递送方式，不适用于现场鸡只的大规模疫苗免疫，因而不利于商业化。因此迫切的需要一种结合上述多种免疫物质的多组分疫苗，可以多角度多层次的进行免疫递送方式，具有强大的潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种柔嫩艾美耳球虫4个AMA同源分子(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)的应用，所述应用为抑制子孢子的入侵。其中，EtAMA1、EtAMA3是子孢子阶段调控表达，其抗体对子孢子的入侵具有显著的抑制效果；EtAMA4在裂殖子和子孢子阶段中均有表达，其抗体对子孢子的入侵具有显著的抑制效果。上述EtAMAs分子可以与对应的RON2s分子发生互作，作为全酵母菌疫苗。

进一步的，本发明提供一种口服重组酵母疫苗，所述疫苗表达柔嫩艾美耳球虫4个AMA同源分子(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)。

进一步的，本发明提供上述口服重组酵母疫苗的制备方法，所述制备方法为：(1)柔嫩艾美耳球虫4个AMA同源分子(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)的扩增：根据EtAMA的cDNA序列设计引物，在设计EtAMA目的片段时，在引物的两端引入pYD1载体的同源臂序列；扩增目的片段的同时，将载体PYD1进行双酶切后回收连接，筛选连接正确的质粒；(2)EBY100感受态细胞制备；(3)酵母转化与鉴定,经酵母基因组DNA提取、PCR鉴定、1％琼脂糖凝胶电泳检测，以确定为阳性的表面展示型酿酒酵母载体；(4)表面展示型酿酒酵母蛋白的表达；(5)口服疫苗的制备。

优选的，所述步骤(1)中引物具体为：

AMA1 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCCACAAGCTGCAGCACAGGC-3’(NheⅠ)(SEQ ID

NO.1)

5’-TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTAGACACCGCCCCCTTTAGACT-3’(EcoRⅠ)(SEQ

ID NO.2)

AMA2 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCCAAAAGTTCAACATTCCATACACTCA-3’(NheⅠ)

(SEQ ID NO.3)

5’-TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACTGCTGCAGTTGCAGTCGTCG-3’(EcoRⅠ)(SEQ

ID NO.4)

AMA3 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCAGCGCTAGAGATGCTGCA-3’(NheⅠ)(SEQ ID

NO.5)

5’-GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTACCAGTTGTTATTTTCTCCTTCTTGTT-3’

(NotⅠ)(SEQ ID NO.6)

AMA4 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCAACCGTTTTAATATACCTGCAAATCA-3’(NheⅠ)

(SEQ ID NO.7)

5’-GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTATGCAGCATTGCTGCTTCCT-3’(NotⅠ)(SEQ

ID NO.8)

优选的，所述步骤(3)具体为：向酵母感受态细胞中分别加入Y3、重组质粒，充分混匀后，水浴，离心取上清。重悬菌体沉淀，涂布筛选平板(SD/Trp)30℃培养，直至形成典型菌落。挑取酵母菌单菌落，并用接种环接种于含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃、250rpm增菌13 h。经酵母基因组DNA提取、PCR鉴定、1％琼脂糖凝胶电泳检测，以确定为阳性的表面展示型酿酒酵母载体，并命名为EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4。

优选的，所述步骤(4)为取鉴定正确的EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4的单克隆菌落，接种于含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃、250 rpm培养至OD600nm在2.0～5.0之间。按照公式，计算菌液转移量并接种于2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基，20℃、250 rpm诱导培养72 h。

其中所述公式为：2％葡萄糖YNB-CAA菌液转移量计算方法：假设新用2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基10 mL，则：转移量×OD600nm值＝(10+转移量)×0.75。

优选的，所述步骤(5)为：

活疫苗的制备方法：用含2％半乳糖的YNB-CAA溶液诱导EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4。诱导72 h后，使用血细胞计数板对酿酒酵母进行计数，按照1×10⁸/管分装，离心去上清，PBS洗涤三次，最后用1mL无菌PBS重悬，备用。活载体疫苗现诱导现用。

或者，灭活疫苗的制备方法：将部分上述分装好的酵母置于95℃水浴锅中灭活20min，并用适量1 mL无菌PBS重悬后，在超净台中用接种环蘸取少量菌液在YPD固体培养基上划线，并置于30℃恒温培养箱中培养，以检测灭活效果。将成功灭活的酿酒酵母载体菌液经离心后，菌体沉淀于-80℃保存备用，使用前解冻并用灭菌PBS重悬。

进一步的，本发明提供一种可以特异性的识别EtAMA4蛋白的单克隆抗体1G5，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：

重链可变区的氨基酸序列为：

其中黑体下划线为CDR1-3。.

进一步的，本发明还提供了一种上述蛋白、抗体或者口服重组酵母疫苗的应用，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。

有益效果

本发明提供了一种表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的口服重组酵母、针对上述柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原的单克隆抗体、含有上述两种有效成分的多组分疫苗及其应用。所述口服重组酵母表达柔嫩艾美耳球虫4个AMA同源分子(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)造成孢子化卵囊形态的改变及毒力的降低。同时，本申请提供的针对上述AMA的单克隆抗体可以有效地识别并结合上述AMA蛋白，对子孢子的入侵具有显著的抑制效果。两种疫苗形式相互协作，可以同时发挥其优势，克服相应的缺陷，通过协同作用具有较好的免疫保护效果，可用于柔嫩艾美尔球虫感染的免疫预防，可以用于制备治疗鸡球虫病的药物和疫苗。

附图说明

图1为目的基因扩增，其中，A：AMA1；B：AMA2；C：AMA3；D：AMA4；

图2为重组质粒双酶切电泳图，其中，A：AMA1；B：AMA2；C：AMA3；D：AMA4；

图3为表面展示型酿酒酵母表达载体生长曲线图；

图4为目的基因整合至EBY100基因组的PCR鉴定。其中，A.pYD1；B.AMA1；C.AMA2；C.AMA3；D.AMA4；

图5为表面展示型酿酒酵母的免疫荧光分析，其中，A：阴性对照；B：EtAMA1；C：EtAMA2；D：EtAMA3；E：EtAMA4；

图6为表面展示型酿酒酵母的流式细胞仪分析，其中，A：阴性对照；B：EtAMA1；C：EtAMA2；D：EtAMA3；E：EtAMA4。

图7为疫苗免疫期间抗体水平，其中，A：EtAMA1血清IgG；B：EtAMA4血清IgG；C：EtAMA1肠道IgG；D：EtAMA4肠道IgG；E：EtAMA1肠道sIgA；F：EtAMA4肠道sIgA。

图8为疫苗免疫期间CD4+、CD8+T淋巴细胞水平，其中，A：CD4；B：CD8；

图9为疫苗免疫期间细胞因子水平，其中，A：IL-6；B：IL-17；C：INF-γ；D：IL-18。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1表面展示型酿酒酵母表达载体的构建及鉴定

1.目的基因的扩增

根据选定的目的基因序列和pYD1表达载体的酶切位点特性设计引物。分别在AMA1、AMA2基因上游引物中设计NheⅠ酶切位点，下游引物中设计EcoRⅠ酶切位点和终止密码子TAA；AMA3、AMA4基因上游引物中设计NheⅠ酶切位点，下游引物中设计NotⅠ酶切位点和终止密码子TAA。引物设计如表1所示(下划线为酶切位点)：

表1 PCR引物列表Table 1 List of PCR primers

以纯化后的E.tenella孢子化卵囊cDNA第一链为模板，通过PCR扩增EtAMAs1/2/3/4，PCR反应体系如下：

使用以下PCR程序进行目的基因的扩增：

EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4目的片段PCR产物大小分别为1266bp(SEQIDNO.11)、1173bp(SEQ ID NO.12)、1416bp(SEQ ID NO.13)和2511bp(SEQ ID NO.14)。PCR结果如图1所示。

2.pYD1质粒的提取及双酶切

参照质粒小提试剂盒的说明书对pYD1质粒进行抽提和纯化，将抽提好的pYD1质粒分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，用NheⅠ和NotⅠ进行双酶切，酶切体系如下：

将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，线性化载体采用切胶的方式使用凝胶回收试剂盒进行回收。

3.重组质粒pYD1-AMAs的构建及鉴定

将上述pYD1质粒双酶切胶回收产物与目的基因片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

将连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，经热激，冷却后加入无抗LB增菌，涂布AMP抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜。将单菌落接种于LB+Amp液体培养基中培养6h，进行菌液PCR鉴定，PCR反应体系如下：

将上述体系充分混匀后，按照如下PCR扩增程序进行PCR反应：

得到的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR鉴定正确的菌液过夜培养后进行质粒的抽提与纯化，得到的重组质粒命分别名为pYD1-EtAMA1、pYD1-EtAMA2、pYD1-EtAMA3、pYD1-EtAMA4。分别对4个重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切体系同上。将双酶切鉴定正确的质粒送至生工生物公司进行测序，用pYD1表达载体通用引物进行测序。

重组质粒双酶切结果如图2所示，出现了两个条带，这与预期的pYD1质粒和EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4基因长度相符。重组质粒的双酶切鉴定，说明目的基因成功地克隆至表面展示质粒pYD1中。

4.酿酒酵母S.cerevisiae EBY100感受态细胞的制备

1)活化菌种：-80℃保存的菌种在YPDA培养基平板上划线，30℃培养2-4天。

2)挑取酵母单菌落在YPDA培养基平板上划3-5mm的短线，30℃培养2-4天。

3)待酵母单菌落直径长至2mm时，把酵母细胞接种到3mL液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。

4)第二天转接到含有50mL液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD₆₀₀达到0.4-0.5，5000rpm离心5min，弃上清。

5)用10mL Y1溶液重悬沉淀，5000rpm离心5min，弃上清。

6)加入1mL Y2溶液重悬，按50μL/管分装于1.5mL无菌冻存管，感受态细胞即制备完毕，-80℃冰箱保存备用。

5.重组酵母EBY100/pYD1-AMAs的构建

将上述测序正确的质粒转化至酿酒酵母感受态细胞S.cerevisiae EBY100中，同时转化pYD1质粒作为阴性对照。将360μL转化预混液(350μLY3溶液、2μL重组质粒、8μLddH₂O)加入50μL酵母感受态细胞中，30℃水浴1 h，12000 rpm离心15s弃上清。用400μL生理盐水重悬菌体沉淀，涂布酵母筛选培养基(SD-Trp)，30℃，培养2-4天。挑取培养基上的单菌落，于5mL2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中30℃、250rpm培养过夜。所得菌液分别命名为EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4以及EBY100/pYD1。

实施例2特异性识别EtAMAs蛋白的单克隆抗体的筛选和制备

在实施例1中的步骤1的基础上加以改进，利用其引物进行PCR扩增后产物连接到pENTR-4原核表达载体中，分别表达EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4蛋白，将构建的重组质粒经IPTG诱导表达重组蛋白，概述为：

(1)取鉴定正确的重组质粒pColdI-EtAMA1、pColdI-EtAMA2、pColdI-EtAMA3、pColdI-EtAMA4(下同，不再分述)转化到100μL Rosseta感受态细胞中。挑取单个菌落接种于4mLLB液体培养基中(含Amp100μg/mL)，37℃，225rpm过夜培养。

(2)取过夜培养的菌液按1：100接种于3mL LB液体培养基中(Amp100μg/mL)，37℃，225rpm培养3h，待OD值达到0.4～0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃，225rpm培养8h。

(3)将菌液移至离心管，10000rpm/min离心5min，弃上清，灭菌PBS洗两次，取适量PBS重悬细菌团块，冰上超声破碎，30HZ，7min，后10000rpm/min离心5min，收集上清，沉淀用80μL灭菌PBS重悬。

(4)取诱导表达的重组蛋白上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，加入等量的2×Loading Buffer,充分混匀后金属95℃煮样5min，冰浴2min，每孔上样20μL，80V恒压至分离胶，120V恒压1.5小时。

(5)电泳完毕后，小心剥离电泳胶，经考马斯亮蓝染色1h，充分脱色至蛋白条带清晰，观察结果，结果说明上述四种重组蛋白成功表达。

(5)按照《分子生物学》，利用常规表达条件，分别对上述四种重组蛋白进行大量的诱导表达，表达产物处理后经HisTrapF柱层析纯化并透析浓缩，取适量纯化蛋白经SDS-PAGE分析纯化效果，余下蛋白测得浓度后-20℃保存备用。

(6)选择6周龄BALB/c雌性小鼠，用纯化的重组蛋白进行免疫。首免：蛋白与弗氏完全佐剂按1:1比例充分混匀，用注射器乳化至“油包水，水包油”的状态，每只老鼠皮下注射0.2mL。二免：2周后再次免疫，按1:1的比例与弗氏不完全佐剂充分混匀，用注射器乳化至“油包水，水包油”的状态，每只老鼠皮下注射0.2mL。三免：二免2周后进行三免，方法同二免相同；三免后10天，小鼠断尾采血，分离血清，用间接ELISA法测定血清中抗体水平。血清抗体效价达到理想滴度后准备细胞融合，在融合前3天进行加强免疫，蛋白溶液不添加任何佐剂，直接腹腔注射，0.2mL/只。

(7)加强免疫3天后，按照常规试验方法取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，待培养板中的细胞长至底面积的1/3时，吸取细胞培养上清，用建立好的ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，三次筛选后，挑选ELISA读值均阳性的细胞孔进行扩大培养。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，直至筛选出的亚克隆细胞全部是阳性、单克隆时定株，最终得到一株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株1G5，可以特异性的识别EtAMA4蛋白，并及时将该细胞扩大培养、冻存。

(8)挑选10-12周龄的BALB/c小鼠，进行单克隆抗体腹水制备，用Protein G亲和层析柱介质纯化腹水，经SDS-PAGE电泳鉴定上述单克隆抗体的纯度。纯化后的单克隆抗体送到华大基因进行抗体序列测序，最终获得其序列为：

轻链可变区的氨基酸序列为：

重链可变区的氨基酸序列为：

(9)单克隆抗体效价测定

以EtAMA4蛋白为包被原，利用建立好的ELISA方法进行杂交瘤细胞上清以及小鼠腹水的血清抗体效价检测。设置阴、阳性小鼠血清对照孔，杂交瘤细胞上清用PBS从1﹕100开始倍比稀释，腹水首孔用PBS从1﹕1 000开始倍比稀释。最终得出1G5单克隆抗体的细胞上清效价为1﹕25600，纯化前腹水效价为1﹕4 096 000，纯化后腹水效价为1﹕512 000。

(10)单克隆抗体的特异性检测

取EtAMA4蛋白，超声破碎后的毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫以及巨型艾美耳球虫配子体蛋白样品加入6×上样缓冲液混匀，电磁炉沸水煮10-15min，12000rpm离心5min，取样品上清加入泳道进行SDS-PAGE并转印到硝酸纤维素膜上，转印结束后置于3％BSA中4℃过夜封闭，杂交瘤细胞上清原液为一抗，室温孵育50min，PBST洗4次，5min/次；二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育40min，PBST洗4次，5min/次；ECL显色后用Tanon5200全自动化学发光成像分析系统观察结果并扫描拍照。结果显示1G5单克隆抗体与EtAMA4蛋白重组蛋白发生特异性识别，而且仅与柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白发生特异性识别，不与毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫天然配子体蛋白发生特异性识别，结果表明其特异性好。

实施例3表面展示型酿酒酵母蛋白的表达与鉴定

1.诱导表达及生长曲线测定

1)挑取酵母筛选培养基上的单克隆菌落，接种于5mL含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，于30℃、250rpm条件下培养16-18h，通过分光光度计检测OD_600nm为2.0。

2)取3mL上述OD_600nm为2.0的菌液，接种于5mL含2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基中，于20℃、250rpm条件下诱导培养72h。

2％葡萄糖YNB-CAA菌液转移量计算方法：假设新用2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基10 mL，则：转移量×OD_600nm值＝(10+转移量)×0.75

3)诱导培养期间，通过可见光分光光度计分别测定第0h、12h、24h、36h、48h、第60h、72h的OD_600nm值，每个样品3个重复。

4)绘制酿酒酵母在不同时间段的生长曲线图。

结果如图3所示，结果表明不同菌株的生长曲线相似，倍增时间也无差异，说明外源蛋白(EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4)的展示并没有改变酵母细胞的生长特性，对其生长没有影响。

2.基因组PCR鉴定

取1mL诱导72h后的菌液，参照酵母基因组提取试剂盒说明书提取酵母重组质粒基因组DNA，以抽提得到的基因组DNA作为模板，分别以pYD1正反测序引物与目的基因正反引物进行PCR鉴定。

结果如图4所示，当利用pYD1正反引物进行PCR时，DNA条带分别为1587bp、1494bp、1711bp、2806bp；而利用EtAMA1-4基因的特异性引物进行PCR，DNA条带分别为1266bp、1176bp、1416bp、2511bp。EtAMA1、EtAMA2两种引物扩增的目的条带二者相差正好是321bp，EtAMA3、EtAMA4两种引物扩增的目的条带二者相差正好是295bp，这说明重组质粒pYD1-EtAMA1、pYD1-EtAMA2、pYD1-EtAMA3、pYD1-EtAMA4已经成功地整合至S.cerevisiae EBY100基因组中。

3.间接免疫荧光及流式细胞仪分析

取50μL诱导72 h后的EBY100/pYD1(阴性对照)、EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4 OD_600nm为2.0的菌液于1.5 mL离心管中，12000 rpm离心5 min，弃尽上清，沉淀用PBS洗涤3次，每次4℃，6000 rpm离心5min。PBS稀释1:100稀释兔抗-EtAMAs多克隆抗体，孵育过夜。12000 rpm离心5 min，弃尽上清，沉淀用PBS洗涤，4℃，6000 rpm离心5 min。加入500μL以PBS稀释1:800稀释的FITC-标记的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育1 h。洗涤二抗后，沉淀用50μLPBS重悬，取5μL菌体悬液滴于洁净的载玻片上，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。

结果如图5所示，EBY100/pYD1酵母细胞未出现特异性绿色荧光，EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4酵母细胞均出现特异性荧光，表明各目的蛋白成功地展示在酿酒酵母EBY100的表面。

剩余菌液中加入300μL PBS重悬均匀后于流式细胞仪分析。结果如图6所示，EBY100/pYD1作为阴性对照，EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4蛋白在酿酒酵母EBY100表面的表达效率分别为28.28％、53.62％、72.23％、29.92％。由于抗体不能进入酵母细胞，结果证实了EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4蛋白显示在酵母细胞的表面上。

实施例4口服重组酿酒酵母疫苗的免疫效果评价

1.口服疫苗的制备

活疫苗：用含2％半乳糖的YNB-CAA溶液诱导EBY100/pYD1(阴性对照)、EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4。诱导72 h后，使用血细胞计数板对酿酒酵母进行计数，按照1×10⁸/管分装，离心去上清，PBS洗涤三次，最后用1 mL无菌PBS重悬，备用。活载体疫苗现诱导现用。

灭活疫苗：将部分上述分装好的酵母置于95℃水浴锅中灭活20 min，并用适量1mL无菌PBS重悬后，在超净台中用接种环蘸取少量菌液在YPD固体培养基上划线，并置于30℃恒温培养箱中培养，以检测灭活效果。将成功灭活的酿酒酵母载体菌液经离心后，菌体沉淀于-80℃保存备用，使用前解冻并用灭菌PBS重悬。

2.动物实验设计与免疫程序

3日龄雏鸡称重，剔除过大或过小的雏鸡，选用体重基本一致的雏鸡，随机分为12组，每组20只鸡，即健康对照组、感染对照组、EBY100/pYD1-活、EBY100/pYD1-灭活、EBY100/pYD1-AMA1-活、EBY100/pYD1-AMA1-灭活、EBY100/pYD1-AMA2-活、EBY100/pYD1-AMA2-灭活、EBY100/pYD1-AMA3-活、EBY100/pYD1-AMA3-灭活、EBY100/pYD1-AMA4-活、EBY100/pYD1-AMA4-灭活组。除健康对照组和感染对照组口服100μL PBS外，其余各组均口服1×10⁸个酿酒酵母活/灭活载体菌。从第3日龄开始，每间隔3天免疫一次，共免疫6次，第20日龄每只鸡接种1×10⁴个新鲜E.tenella孢子化卵囊。

3.增重效果检测

分别于第3日龄、20日龄(攻虫前)和28日龄(攻虫后第7天)对每组鸡只称重并记录，以计算平均增重和相对增重率来评价增重效果。

平均增重1＝攻虫前体重-3日龄体重；平均增重2＝攻虫后体重-攻虫前体重；增重率＝(攻虫后8d平均体重-攻虫时平均体重)/攻虫时平均体重×100％。

相对增重率＝(实验组增重/健康对照组增重)×100％。

免疫期间的增重见表2，由表可知，与健康对照组相比，所有表达目的蛋白组和pYD1空载体组免疫期间的增重均稍有提高，但差异不显著(P>0.05)。与pYD1空载体组相比，AMA1活菌组、AMA3活菌组和AMA4活菌组的的增重稍高于空载体活菌组，AMA2灭活组、AMA3灭活组的增重稍高于空载体灭活菌组，其余各组均与空载体的基本相当。以上结果表明口服表达或不表达AMAs的酿酒酵母活菌和灭活菌均可促进鸡只的生长，其中AMA2灭活组、AMA3灭活组效果最好。

表2免疫期间鸡只的增重Table 2 Weight gain of chickens duringimmunization.

攻虫后的增重见表3，由表可知，所有表达目的蛋白组和和pYD1空载体组攻虫期间的增重均显著高于感染对照组(P<0.05)。与空载体组相比，AMA1、AMA2和AMA4活菌组的增重显著高于空载体活菌组(P<0.05)；AMA1灭活组的增重显著高于空载体灭活组(P<0.05)，其余各组的增重与对应空载体的相当(P>0.05)。以上结果表明口服表达或不表达AMAs的酿酒酵母活菌和灭活菌对球虫感染引起的失重均具有一定的抵抗作用，其中以AMA1活菌组和灭活组效果最好。

表3攻虫后鸡只的增重Table 3 Weight gain of chickens after challenge.

4.血便、盲肠病变计分

攻虫后第5天进行血便计分，即为每组鸡的粪便中血便撮数之和。

攻虫后第8天杀鸡，摘取盲肠组织进行盲肠病变计分，以Johnson和Reid(1970)报道的方法为标准进行病变计分，病变值＝每组平均病变计分×10。

结果如表4所示，由表可知，所有组均未出现死亡，存活率100％。AMA1活菌组没有出现血便，其余感染组均出现一定的血便。在肠道病变方面，所有表达目的蛋白活菌组的肠道病变与pYD1空载体活菌组的相当(P>0.05)；AMA1灭活组、AMA2灭活组的病变明显低于pYD1空载体灭活组(P<0.05)，AMA3灭活组的极其明显低于pYD1空载体灭活组(P<0.01)。

表4攻虫后的存活率、血便和肠道病变计分Table 4 Survival,bloody stool,andintestinal lesion scores after challenge.

5.每克粪便中的卵囊数(OPG)

分别采集攻虫后第6天、第7天和第8天的各组鸡粪便，混合均匀后，每组各称取2 g鸡粪便，加入58 mL自来水，充分混匀后，经四层纱布过滤，取2 mL滤液，并向滤液中加入4mL饱和食盐水，混匀后，置于麦氏计数板中，室温静置10 min后于光学显微镜下观察计数。

计数方法：每组粪便计数两个计数室，计算两个计数室的平均值A。计数室的容积为0.15mL，因此90÷0.15＝600，OPG＝A×600。每天每只鸡排出的卵囊数＝(OPG×粪便重)/鸡只数量，将每天每只鸡排出的卵囊数相加，即为每只鸡排出的卵囊总量。

结果如表5所示，由表可知，所有表达目的蛋白组和pYD1空载体组攻虫期间的卵囊产量均明显减少(P<0.05)。与pYD1空载体组相比，pYD1-AMA1活菌组明显少于空载体活菌组(P<0.05)，pYD1-AMA2灭活组、pYD1-AMA3灭活组、pYD1-AMA4灭活组明显少于空载体灭活组(P<0.05)，其余组与对应载体组的相当(P>0.05)。

表5攻虫后的卵囊OPG和相对卵囊产量Table 5 Oocyst OPG and relativeoocyst production after challenge.

6.抗球虫指数(ACI)

根据各组的存活率、相对增重、卵囊值和病变记分值，算出抗球虫指数。抗球虫指数(ACI)＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。

结果见表6，由表可知，所有表达目的蛋白组和pYD1空载体组的抗球虫指数均明显高于感染对照组(P<0.05)。与pYD1空载体组相比，pYD1-AMA1活菌组极其明显高于空载体活菌租(P<0.01)，达到良好抗球虫效果，pYD1-AMA2活菌组和pYD1-AMA4活菌组明显高于空载体活菌租(P<0.05)，达到中等抗球虫效果；pYD1-AMA1灭活组、pYD1-AMA2灭活组、pYD1-AMA3灭活组、pYD1-AMA4灭活组明显高于空载体灭活租(P<0.05)，达到中等抗球虫效果。

表6攻虫后各组的抗球虫指数(ACI)Table 6 Anti-coccidial Index(ACI)ofeach group after challenge.

7.免疫期间血清和黏膜抗体检测

分别于攻虫前(20日龄)每组鸡随机取4只进行采血，制备鸡血清，-20℃保存备用，同时，摘取盲肠组织，去除盲肠内容物，用预冷的PBS冲洗肠壁，刮取肠黏膜组织，并用遇冷的PBS重悬，混匀1 min，4℃，5000 g离心5 min，收集上清，-80℃保存。

血清及肠上清特异性IgG检测：根据蛋白浓度定量包被抗原，4℃孵育16～18 h；除去反应孔中液体，加250μL洗涤液洗涤；加入200μL封闭液37℃，恒温孵育2 h；洗涤后加入稀释好的血清或肠上清，37℃孵育2 h；洗涤后加入提前稀释好的HRP-兔抗鸡IgG，37℃孵育2h；洗涤后先加入显色液及终止液，用酶标仪测定其OD_450nm值。

肠上清特异性IgA检测：分别包被AMA1、AMA2、AMA3和AMA4蛋白，4℃包被过夜；经TBST洗涤，拍净孔中液体，用1％BSA封闭液，37℃孵育2 h；经TBST洗涤，加入稀释好的鸡肠上清为一抗，37℃孵育2 h；TBST洗涤后，加入HRP标记的山羊抗鸡IgA，37℃孵育2 h；洗涤拍干后，先后加入显色液，终止液，采用酶标仪测定其OD_450nm值。

结果如图7所示，无论是免疫活菌还是灭活菌，口服EBY100/pYD1-AMA1组的血清和粘膜IgG效价均显著高于PBS组和EBY100/pYD1组(P<0.05)，(图A)；无论是免疫活菌还是灭活菌，口服EBY100/pYD1-AMA4组的血清和粘膜IgG效价均显著高于EBY100/pYD1组(P<0.05)(图B)；免疫活菌，口服EBY100/pYD1-EtAMA1组盲肠中的IgG效价极显著高于PBS组和EBY100/pYD1组(P<0.001)，免疫灭活菌，口服EBY100/pYD1-EtAMA1组盲肠中的IgG效价极显著高于EBY100/pYD1组(P<0.05)与健康对照组无显著差异(P>0.05)(图C)；免疫灭活菌，口服EBY100/pYD1-EtAMA4组盲肠中的IgG效价极显著高于PBS组和EBY100/pYD1组(P<0.001)，而免疫活菌，盲肠中的IgG效价与PBS组、EBY100/pYD1组均无显著差异(P>0.05)(图D)；无论是免疫活菌还是灭活菌，口服EBY100/pYD1-AMA1组的血清和粘膜sIgA效价均极显著高于PBS组和EBY100/pYD1组(P<0.001)，(图E)；无论是免疫活菌还是灭活菌，口服EBY100/pYD1-AMA4组的血清和粘膜sIgA效价均显著高于PBS组和EBY100/pYD1组(P<0.01)，(图F)。

CD4、CD8淋巴细胞群检测：在体外采用ELISA法检测疫苗免疫期间对照组和试验组血清中CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的表达水平。

结果如图8所示，与空载体活疫苗免疫组相比，EtAMA2活疫苗免疫组血清中的CD4⁺淋巴细胞表达水平显著升高(P<0.001)，EtAMA1、EtAMA3组显著降低(P<0.001)，而EtAMA4组无显著差异；EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3活疫苗免疫组血清中的CD8⁺淋巴细胞表达水平显著降低，而EtAMA4组无显著差异(P>0.05)。

与空载体灭活疫苗免疫组相比，EtAMA1、EtAMA3灭活疫苗免疫组血清中的CD4⁺淋巴细胞表达水平显著升高(P<0.01)，EtAMA2、EtAMA4组血清中的CD4⁺淋巴细胞表达水平有所升高但差异不显著(P>0.05)；EtAMA1、EtAMA2灭活疫苗免疫组血清中的CD8⁺淋巴细胞表达水平显著升高(P<0.001)，EtAMA3组显著降低(P<0.05)，而EtAMA4组无显著差异(P>0.05)。

与健康对照组相比，空载体活疫苗免疫组血清中CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞表达水平均显著升高(P<0.001)，空载体灭活疫苗免疫组血清中CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞表达水平均无显著差异(P>0.05)。

细胞因子水平检测：在体外采用ELISA法测定疫苗免疫期间血清中IFN-γ、IL-6、IL-17和IL-18的表达水平。

结果如图9所示，与空载体活疫苗免疫组相比，EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4活疫苗免疫组血清中IL-6的表达水平显著降低(P<0.001)，而EtAMA2组无显著差异(P>0.05)；EtAMA2活疫苗免疫组血清中IL-17的表达水平显著升高(P<0.05)，EtAMA1、EtAMA3、EtAMA4组无显著差异(P>0.05)；EtAMA1、EtAMA3、EtAMA4活疫苗免疫组血清中INF-γ的表达水平显著降低(P<0.001)，而EtAMA2组显著升高(P<0.001)；EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4活疫苗免疫组血清中IL-18的表达水均无显著差异(P>0.05)。

与空载体灭活疫苗免疫组相比，EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4灭活疫苗免疫组血清中IL-6的表达水平显著升高(P<0.001)；EtAMA2、EtAMA4灭活疫苗免疫组血清中IL-17的表达水平显著降低(P<0.01)，EtAMA1、EtAMA3组无显著差异(P>0.05)；EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4灭活疫苗免疫组血清中INF-γ的表达水平均显著升高(P<0.001)；而血清中IL-18的表达水均无显著差异(P>0.05)。

与健康对照组相比，空载体活疫苗免疫组血清中IL-6的表达水平显著升高(P<0.001)，IL-17的表达水平无显著差异(P>0.05)，INF-γ的表达水平均显著升高(P<0.001)，而IL-18的表达水均无显著差异(P>0.05)；空载体灭活疫苗免疫组血清中IL-6的表达水平显著降低(P<0.05)，IL-17的表达水平显著升高(P<0.001)，INF-γ的表达水平均显著降低(P<0.001)，而IL-18的表达水均无显著差异(P>0.05)。

以上结果显示，表达柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原EtAMA1/2/3/4的重组酵母菌，以活菌或灭活口服免疫雏鸡后，实验组体重增加、卵囊输出量减少、盲肠病变减轻，并能诱导产生特异性血清IgG和肠道sIgA，具有一定的抗柔嫩艾美耳球虫免疫效果，是一种潜在的球虫口服疫苗。

实施例4 EtAMA4抗体与口服重组酿酒酵母疫苗的联合治疗效果评价

与实施例3相类似的，取40只1日龄SPF雏鸡随机分为5组，每组10只鸡，第1组为无免疫攻虫对照组(感染对照组)、第2组为抗体治疗组、第3组为EBY100/pYD1-EtAMA1活疫苗免疫攻虫组、第4组为联合治疗组。第1组和第2组口服100μL PBS，第3组和第4组均口服1×10⁸个酿酒酵母活载体菌，从第3日龄开始，每间隔3天免疫一次，共免疫6次。所有组第20日龄每只鸡接种1×10⁴个新鲜E.tenella孢子化卵囊。同时在接种后第4d，对第2组和第4组注射纯化后的EtAMA4抗体蛋白(0.5mg/mL，每只200μL)，接种后第8d结束试验，分别计算平均增重、血便、盲肠病变计分、每克粪便中的卵囊数(OPG)等为指标，综合评价联合治疗鸡球虫感染效果。

结果显示，与感染对照相比，抗体治疗组、活疫苗免疫组、联合治疗组增重均显著高于感染对照组(P<0.05)，其中，抗体治疗组为92％，活疫苗免疫组为95％，而联合治疗组的结果为100％，明显效果要好于单独治疗组。

血便、盲肠病变计分结果显示，所有组均未出现死亡，存活率100％。活疫苗免疫组和联合治疗组没有出现血便，其余感染组均出现一定的血便。同样的，联合治疗组的肠道病变值(14.5)要明显低于抗体治疗组(24.3)、活疫苗免疫组(23.4)。

每克粪便中的卵囊数(OPG)结果显示，所有治疗组的卵囊产量均明显减少(P<0.05)，联合治疗组效果与抗体治疗组相似，都要好于活疫苗免疫组。

上述结果提示，利用本申请获得的EtAMA4抗体与口服重组酿酒酵母疫苗进行联合治疗和免疫，这种联合免疫治疗方式可以诱导雏鸡有效抵抗柔嫩艾美耳球虫感染，提高雏鸡存活率、增高雏鸡的相对增重率、减少球虫卵囊排出量，是一种新的具有良好免疫保护效果的联合疫苗，具有作为预防和治疗鸡柔嫩艾美耳球虫病疫苗研发的潜力。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种口服重组酵母，其特征在于，所述酵母表达柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)4个AMA同源分子(AMA1-4)，EtAMA1、EtAMA2、EtAMA3、EtAMA4的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。

2.一种制备权利要求1所述的口服重组酵母的方法，其特征在于，所述制备方法为：(1)EtAMA1-4基因的扩增：根据EtAMA1-4的cDNA序列设计引物，在设计EtAMA1-4目的片段时，在引物的两端引入pYD1载体的同源臂序列；扩增目的片段的同时，将载体PYD1进行双酶切后回收连接，筛选连接正确的质粒；(2)EBY100感受态细胞制备；(3)酵母转化与鉴定,经酵母基因组DNA提取、PCR鉴定、1％琼脂糖凝胶电泳检测，以确定为阳性的表面展示型酿酒酵母载体；(4)表面展示型酿酒酵母蛋白的表达；(5)口服疫苗的制备。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中引物如下：

AMA1 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCCACAAGCTGCAGCACAGGC-3’(NheⅠ)

5’-TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTAGACACCGCCCCCTTTAGACT-3’(EcoRⅠ)

AMA2 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCCAAAAGTTCAACATTCCATACACTCA-3’(NheⅠ)

5’-TGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACTGCTGCAGTTGCAGTCGTCG-3’(EcoRⅠ)

AMA3 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCAGCGCTAGAGATGCTGCA-3’(NheⅠ)

5’-GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTACCAGTTGTTATTTTCTCCTTCTTGTT-3’

(NotⅠ)

AMA4 5’-GGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCAACCGTTTTAATATACCTGCAAATCA-3’(NheⅠ)

5’-GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTATGCAGCATTGCTGCTTCCT-3’(NotⅠ)。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)为：

活疫苗的制备方法：用含2％半乳糖的YNB-CAA溶液诱导EBY100/pYD1-EtAMA1、EBY100/pYD1-EtAMA2、EBY100/pYD1-EtAMA3、EBY100/pYD1-EtAMA4。诱导72h后，使用血细胞计数板对酿酒酵母进行计数，按照1×10⁸/管分装，离心去上清，PBS洗涤三次，最后用1mL无菌PBS重悬，备用。活载体疫苗现诱导现用。

或者，灭活疫苗的制备方法：将部分上述分装好的酵母置于95℃水浴锅中灭活20min，并用适量1mL无菌PBS重悬后，在超净台中用接种环蘸取少量菌液在YPD固体培养基上划线，并置于30℃恒温培养箱中培养，以检测灭活效果。将成功灭活的酿酒酵母载体菌液经离心后，菌体沉淀于-80℃保存备用，使用前解冻并用灭菌PBS重悬。

5.一种特异性识别权利要求1中所述柔嫩艾美耳球虫EtAMA4蛋白的单克隆抗体1G5，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：

重链可变区的氨基酸序列为：

其中黑体下划线为CDR1-3。

6.一种组合物，其特征在于所述组合物包含权利要求1所述的口服重组酵母，和/或权利要求5所述的单克隆抗体1G5。

7.一种权利要求6所述的组合物的应用，其特征在于所述组合物用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。