CN102676419A - 一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用，该菌株是伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)ΔcrpST-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011373。本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保护性，且毒力较弱，对免疫猪无任何不良副作用，跟传统该类疫苗相比更安全。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景。另外，本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株保留了针对伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，而且遗传背景清晰，性状稳定，因而具有更好的生物安全性。本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

Description

一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株及由其制备的疫苗和应用

技术领域

本发明涉及一种不含抗性标记的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，由其构建的疫苗及该疫苗的应用，属于动物细菌基因工程技术领域。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物体内的一种革兰氏阴性杆菌。在人、家畜、家禽、野生动物、啮齿动物体内常分离到沙门氏菌，本属细菌也常存在于水、乳、肉、蛋中及其他食品和饲料中。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。某些沙门氏菌是重要的人畜共患病原，有些是动物疾病病原，有些是人和动物食物中毒或饲料中毒常见病原性细菌，因而本属细菌在食品卫生、外贸出口、人畜疾病发生中均十分重要。据统计在世界各国的各种细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。细胞免疫在抗沙门氏菌感染中具有重要作用。细胞免疫反应性与大剂量沙门氏菌攻击动物的保护性通常呈现很好的相关性。但体液抗体可加速病原菌的排出。动物接触环境中的沙门氏菌或在注射疫苗后，其体液免疫应答主要是IgM抗体。在疾病康复或口服弱毒苗感染的动物肠道中，可出现特异性分泌型IgA。动物在感染沙门氏菌病愈后，可获得坚强的免疫力，能抵抗再次感染。目前应用的兽用疫苗多限于预防各种家畜特有的沙门氏菌病，例如猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、马流产沙门氏菌(S.abortusequi)以及牛、羊都柏林沙门氏菌(S.dublin)等灭活疫苗，在国内外均已应用，两次接种即可预防孕畜流产或幼畜感染。据报道，用减毒或无毒活菌注射或口服免疫动物，效果优于灭活菌苗。

人类感染的沙门氏菌主要来源于畜禽，而沙门氏菌感染家畜后可引起一系列的临床疾病并成为肉制品污染的一个重要来源。因此，国内外动物检疫规程均把沙门氏菌列为重要的卫生检出指标之一。伤寒沙门氏菌(S.typhi)是一种常见、重要的人畜共患肠道病原菌，不仅能导致鸡白痢、家畜流产等动物性疾病发生，还能使人类发生伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒等疾病。1877年几乎同时由德国细菌学家Karl Joseph Eberth和Robert Koch从伤寒病人粪便中发现伤寒沙门氏菌，1884年德国细菌学家Georg T.A.Gaffky从病人脾脏中再次分离到该病原菌，并鉴定出其抗原结构式为：9，12，[Vi]:d:-，为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，具周身鞭毛，能运动，不形成芽孢。伤寒沙门氏菌能引起人和动物全身性、急性、发热性的感染，致病菌主要侵入网状内皮系统、肠道淋巴结及胆囊，并导致广泛的全身性临床症状，主要表现为持续性高热、腹痛及小肠结肠炎等症状。在成人和年长儿童常出现便秘，而幼龄儿童则常出现腹泻。虽然随着社会卫生条件的改善，可降低伤寒的发病率，但由于耐药菌株的不断增多，应用免疫预防手段仍然是控制本病的有效措施，因此伤寒疫苗的研究对预防伤寒病的发生具有更实际的意义。

目前在全世界各地获准使用的伤寒沙门氏菌疫苗主要有：热灭活-酚防腐全菌体疫苗或经丙酮灭活冻干全菌体疫苗，纯化Vi多糖疫苗，口服减毒Ty21a减毒活疫苗。由于灭活苗具容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。多糖结合疫苗生产工艺较难、成本高，在发展中国家推广仍有一定困难。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活疫苗或亚单位疫苗更为有效。于是，尽管传统的灭活疫苗和亚单位疫苗一直在沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被弱毒活疫苗所取代。各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果(Curtiss R，III，Doggett T，Nayak A，Srinivasan J.1996.Strategies for the use of live recombinantavirulent bacterial vaccines for mucosal immunization，p.499-511.In H.Kiyonoand M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials of mucosal immunology.Academic Press，SanDiego，Calif；Sirard J C，Niedergang F，Kraehenbuhl J P.1999.Live attenuatedSalmonella：a paradigm of mucosal vaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。Ty21a是由野生型Ty2经化学剂亚硝基胍处理而获得的株，该株毒力明显降低，可提供67～79％的免疫保护力，因此许多国家生产并应用该型减毒活疫苗，使伤寒病得到有效控制。但该弱毒疫苗菌株由野生强毒株经过化学致弱方法制得，遗传背景不清，存在毒力返强的风险。因此，仍然需要开发遗传背景清楚、性状稳定、更符合生物安全性的新型伤寒沙门氏菌弱毒疫苗。

随着现代分子生物学和DNA重组技术的发展以及许多其他毒力或毒力相关基因的不断发现，许多研究者仍在不断以改进某些毒力或毒力相关基因来制备新的弱毒活疫苗。使用基因工程手段致弱沙门氏菌从而筛选获得弱毒疫苗株已经成为国际上的研究热点。这主要是因为新型弱毒沙门氏菌疫苗不仅能用于沙门氏菌病的防制，而且能作为开发其它多种传染病疫苗的载体(Sirard J C，Niedergang F，Kraehenbuhl J P.1999.Live attenuated Salmonella：aparadigm of mucosal vaccines.Immunol.Rev.171：5-26；Spreng S，Dietrich G.Weidinger G..2006.Rational design of Salmonella-based vaccination strategies.Methods 38：133-143)。与致病性密切相关的沙门氏菌毒力因子主要包括：脂多糖、肠毒素、细胞毒素、侵袭力与毒力基因及毒力调节基因等。人们尝试通过各种基因工程手段缺失其中的某些毒力相关基因，致使沙门氏菌毒力降低，但仍保留其免疫原性，最终筛选获得沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株。研制中的减毒伤寒沙门氏菌口服疫苗主要有以下几种：aroA(编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)和purA(编码嘌呤的生物合成)株541Ty、aroA和aroD株CVD906、cya(编码环化腺苷酸合成酶)和crp(编码cAMP受体蛋白)株χ3927、cya、crp和cdt(编码深部组织的繁殖)株χ4073、phoP/phoQ基因(编码转录激活因子/传感器激酶)株Ty800(Hohmann E L，Oletta C A，Miller S I.1996.Evaluation of a phoP/phoQ-deleted，aroA-deleted live oral Salmonella typhivaccine strain in human volunteers.Vaccine，14(1)：19-24)等等。

理想的弱毒活疫苗应具备下列条件：(1)完全无毒力：株的残余毒性一般不被接受。(2)对后代无害：疫苗所诱导的保护性免疫应能传给下一代，而疫苗本身不应垂直传播。(3)不能回复：防止回复的发生，降低毒力返强的风险。(4)高度免疫原性：活疫苗应能够有效的刺激机体产生特异性免疫反应。(5)对环境不造成污染：疫苗应在体内存留特定的时间，诱导免疫反应后被某种机制清除并不滞留于环境。(6)经济且方便使用：诸如口服、滴鼻、肌肉注射等免疫方法比较简单、方便。沙门氏菌活疫苗可以侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫，并通过自然感染途径如口服或鼻内接种，激发系统和粘膜免疫反应(Curtiss R，III，Doggett T，Nayak A，Srinivasan J.1996.Strategies for the use of live recombinant avirulent bacterialvaccines for mucosal immunization，p.499-511.In H.Kiyono and M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials of mucosal immunology.Academic Press，San Diego，Calif；SirardJ C，Niedergang F，Kraehenbuhl J P.1999.Live attenuated Salmonella：a paradigmof mucosal vaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。这样，弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。已有的构建沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株的基因工程手段仍存在不少缺陷。例如，利用转座子介导的方法存在随机性，只适合于表型发生明显变化子的筛选，而不导致明显表型变化的菌株就不能够通过这些方法获得；传统的利用同源重组导致靶基因方法虽然精确，但获得的菌株最后往往含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种免疫原性更好和安全性更强的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株。

进一步地，本发明的第二个目的在于提供了一种利用伤寒沙门氏菌基因缺失菌株制备的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗。

更进一步地，本发明的第三个目的在于提供一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株在制备伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种不含抗性标记的伤寒沙门氏菌(分类命名：Salmonella typhi)crp基因缺失菌株ΔcrpST-1(简称ΔcrpST-1，下同)，于2011年11月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011373。

所述的不含抗性标记的伤寒沙门氏菌基因缺失了伤寒沙门氏菌的主要毒力调节基因crp，缺失后伤寒沙门氏菌株毒力显著减弱，但仍具有很好免疫原性。

本发明的不含抗性标记伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ΔcrpST-1，其基因工程菌株衍生于伤寒沙门氏菌ST-1(简称ST-1，下同)。其中，ST-1为分离自猪的野生型伤寒沙门氏菌强毒菌株，血清型为9，12，[Vi]:d:-，于2011年11月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2011372。

所述的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ΔcrpST-1，其主要毒力调节基因crp缺失了320bp的DNA片段，导致该细菌不能从哺乳动物中摄取cAMP，生长比较缓慢，且毒力大大降低，因而具有很高的安全性。但经动物试验证实，该基因缺失菌株具有很好的免疫保护力。

本发明的基本构建方法是：利用基因工程技术缺失了伤寒沙门氏菌野生型强毒株ST-1的毒力调节基因crp，从而构建成新的株ΔcrpST-1。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的基因缺失菌株ΔcrpST-1可用于制备针对伤寒沙门氏菌感染的弱毒活疫苗。

本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保护性，且毒力较弱，对免疫猪无任何不良副作用，跟传统该类疫苗相比更安全。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景。另外，本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株保留了针对伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，而且遗传背景清晰，性状稳定，因而具有更好的生物安全性。本发明伤寒沙门氏菌基因缺失菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

序列1是本发明构建伤寒沙门氏菌crp基因缺失株所用的上游同源臂的序列(1048bp)；

序列2是本发明的来源菌株伤寒沙门氏菌野生菌ST-1中缺失的部分crp基因序列(321bp)；

序列3是本发明构建伤寒沙门氏菌crp基因缺失株所用的下游同源臂的序列(1743bp)；

图1为本发明制备的转移质粒pREcrp12的物理图谱；

图2为本发明制备的转移质粒pREcrp12构建的流程图；

图3为本发明所使用的基因同源重组原理示意图；

图4为本发明中不含抗性标记的伤寒沙门氏菌crp基因缺失菌株ΔcrpST-1的PCR检测电泳图谱；

图4A：ΔcrpST-1株PCR鉴定图(Pr5/Pr6)，图中M为DNAmarker(DL 2,000)；1和2为筛选的ΔcrpST-1株(599bp)；3为H₂O对照；4和5为亲本菌株ST-1对照(918bp)；

图4B：ΔcrpST-1株PCR鉴定图(Pr7/Pr6)，图中M为DNAmarker(DL 2,000)；1、2和3为筛选的ΔcrpST-1株(1412bp)；4为H₂O对照；5为pRE112质粒对照；6和7为亲本菌株ST-1对照(1731bp)；

图5为本发明中的不含抗性标记的伤寒沙门氏菌株ΔcrpST-1在加1％麦芽糖的麦康凯琼脂上的菌落形态；

图5中的A和A’分别为亲本菌株ST-1和缺失菌株ΔcrpST-1在LB培养基上的菌落形态；B和B’分别为亲本菌株ST-1(无色)和缺失菌株ΔcrpST-1(无色)在麦康凯琼脂上的菌落形态；C和C’分别为亲本菌株ST-1(红色)和缺失菌株ΔcrpST-1(无色)在含有1％麦芽糖的麦康凯琼脂上的菌落形态；

图6：是本发明中的伤寒沙门氏菌株ΔcrpST-1的生长特性试验结果；

图7：是本发明中一种伤寒沙门氏菌株ΔcrpST-1的遗传稳定性实验结果。

注：是引物Pr5/Pr6对缺失菌株ΔcrpST-1遗传稳定性的PCR鉴定图，图中M：DNA marker(DL 2,000)；1为H₂O对照；2～7为1、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的扩增结果。

具体实施方式

实施例1伤寒沙门氏菌ST-1crp基因缺失菌株的构建

1、引物设计(用于基因克隆和分子检测)

参照文献(郁川，等.猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失菌株的构建及其生物学特性初步研究.畜牧兽医学报，2010，41(5)：587-593)和已报道的伤寒沙门氏菌株Ty2的crp基因序列(GenBank No：AE016847)设计2对引物(pr1/pr2和pr3/pr4，见表1)，从伤寒沙门氏菌强毒株ST-1(ST-1为分离自猪的野生型伤寒沙门氏菌强毒菌株，于2011年11月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011372。)基因组中分别扩增crp基因上下游片段crp1(上臂)和crp2(下臂)，扩增片段大小分别为1048bp和1743bp，上臂两端分别引入Xba I和BamH I酶切位点，下臂两端分别引入Xho I和Kpn I酶切位点。另设计2对引物(pr5/pr6和pr7/pr6，见表1)进行ST-1亲本菌株和crp缺失菌株的鉴定。引物均由上海生物工程有限公司合成。

表1：PCR引物

2、伤寒沙门氏菌ST-1crp基因上下游片段crp1(上臂)与crp2(下臂)的克隆

将冻干的伤寒沙门氏菌ST-1在LB固体(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，15g琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压25min)培养基上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压25min)中，37℃、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)说明书提取基因组为PCR模板。

crp1和crp2扩增反应均在25μL的体系中进行，反应体系(PCR相关试剂均购自大连TaKaRa公司)如下：模板DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，2U/μL Taqase 0.5μL，ddH₂O 16μL。

crp1和crp2扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃2min。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为1048bp和1743bp。将得到的目的基因克隆到pMD18-T载体(购自大连TaKaRa公司)，送大连TaKaRa公司进行外源基因序列的测定。

3、转移质粒pREcrp12的构建

用Xba I和BamH I双酶切crp1和pBluescriptSK(+)载体(购自美国Stratagene公司)，回收纯化后用T₄DNAligase(购自大连TaKaRa公司)连接，16℃水浴12h，转化DH5_α感受态细菌(购自大连TaKaRa公司)，37℃在固体LB平板上培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、200r/min振摇培养12h，使用质粒提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)小量制备质粒从而获得质粒pSKcrp1。再用Xho I和Kpn I双酶切crp2与质粒pSKcrp1。回收后用T₄DNAligase连接，转化DH5α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、200r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pSKcrp12。用Xba I和Kpn I双酶切转移质粒pSKcrp12与自杀性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Miller，V.L.，Mekalanos J.J.1988.Anovel suicide vector and its use in construction on insertion mutations：osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibriocholerae requires toxR.J.Bacteriol.170：2575-2583)，回收“crp1+crp2”片段和质粒pRE112，用T₄ DNAligase连接，16℃水浴12h，电转化(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔DW著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)大肠杆菌χ7213(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards，R.A.，L.H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelicexchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene207：149-157)构建重组菌株χ7213(pREcrp12)，37℃培养12h挑菌到液体LB培养基，37℃、200r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得pRE crp12转移质粒，其物理图谱见图1。酶切鉴定结果证实构建的转移质粒pRE crp12是正确的。pRE crp12中的“crp1+crp2”DNA片段含有缺失了320bp的crp基因片段。转移质粒pREcrp12构建流程如图2所示。

4、伤寒沙门氏菌ST-1crp基因缺失菌株ΔcrpST-1的构建

本发明所使用的基因同源重组原理如图3所示。以χ7213(pREcrp12)为供体菌，ST-1为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，蒸馏水加至1000mL，经121℃高压灭菌30min)洗两遍，调整菌浓度至OD₆₀₀为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维滤膜贴于固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，无菌PBS洗两遍，涂布含氯霉素(Cm，终浓度30μg/mL)的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性(Cm^r)接合子，提取基因组，用引物pr5/pr6(见表1)扩增鉴定(见图4A)。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感(Cm^s)菌落。提取基因组，再次用引物pr5/pr6扩增鉴定，crp缺失菌株进一步用引物pr7/pr6(见表1)鉴定(见图4B)。结果表明，所构建的ST-1crp基因缺失菌株ΔcrpST-1是正确的。

实施例2伤寒沙门氏菌ST-1crp基因缺失菌株ST-1的鉴定及生物学特性

1、基因缺失菌株ΔcrpST-1的表型鉴定

将基因缺失菌株ΔcrpST-1与亲本菌株ST-1划线接种固体LB平板，然后转接葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、卫矛醇、尿素等碳源及H₂S等生化鉴定管(购自杭州天和公司)进行生化反应。按血清因子(购自中国兽药监察所)说明书并进行O和H抗原鉴定。结果表明基因缺失菌株ΔcrpST-1的生化特性与亲本菌株ST-1并不完全一致。亲本菌株ST-1能够利用麦芽糖，在加麦芽糖的麦康凯琼脂上呈红色菌落(见图5C)，而crp基因缺失后，不能利用麦芽糖，因此在加麦芽糖的麦康凯琼脂上仍呈无色菌落(见图5C’)。与亲本菌ST-1不同，基因缺失菌株ΔcrpST-1不再能利用麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖与木糖，但其它碳源的利用情况及表型一致。基因缺失菌株ΔcrpST-1的血清型为9，12，[Vi]:d:-，与亲本菌株ST-1一致，符合伤寒沙门氏菌的典型抗原特征。

2、基因缺失菌株ΔcrpST-1的生长特性分析

基因缺失菌株ΔcrpST-1在LB平板37℃培养16h，菌落其直径约为1.1mm，较亲本菌株ST-1(2.1mm)显著减小。亲本菌株ST-1与基因缺失菌株ΔcrpST-1从10⁶CFU/mL开始培养，每1h取样，并进行活菌计数。结果显示，基因缺失菌株ST-1生长速度显著慢于亲本菌株ST-1(见图6)，其平均世代间隔(Mean generation time)为39.1min，较亲本菌株(26.4min)延长12.7min。

3、基因缺失菌株ΔcrpST-1的遗传稳定性

将本发明制备的基因缺失菌株ΔcrpST-1在固体LB平板上划线培养，挑取单菌落到液体LB培养基中，37℃、200r/min培养16h，按体积1∶1000的比例转接到LB液体培养基中培养16h，再次按体积1∶1000的比例转接到LB液体培养基中，连续进行50次转接。另划线接种于含有1％麦芽糖的麦康凯琼脂，观察菌落颜色。结果表明菌落不能变红，仍符合crp基因缺失的表型特征。同时用引物pr5/pr6和pr7/pr6(见表1)进行PCR扩增，基因缺失菌株ΔcrpST-1中的crp缺失基因遗传情况见图7。图7表明，缺失菌株的1、10、20、30、40和50代模板的扩增的结果均无可见差别，表明本发明制备的基因缺失菌株ΔcrpST-1能够稳定遗传缺失320bp的crp基因片段。

实施例3伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗

将获得的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ΔcrpST-1进行鉴定，每代接种于含有1％麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上观察菌落颜色，并利用伤寒沙门氏菌的crp基因进行PCR检测鉴定缺失细菌的遗传稳定性。经50次传代后发现缺失菌株ΔcrpST-1在含有1％麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上菌落不能变红，仍符合crp基因缺失的表型特征；且PCR鉴定crp基因仍然缺失了320bp，遗传性稳定。该伤寒沙门氏菌基因缺失菌株ΔcrpST-1在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到3.0×10⁹CFU/mL。按细菌液∶明胶保护剂(体积∶体积)为7∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36h后压盖，用10％铝胶生理盐溶解并进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

实施例4伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗ΔcrpST-1的安全性评价

1、本发明的基因缺失菌株ΔcrpST-1的毒力测定

为测定构建的基因缺失菌株ΔcrpST-1对BALB/c小鼠的毒力，将44只BALB/c小鼠平均分为11组。第1～5组小鼠进行口服接种基因缺失菌株ΔcrpST-1，每小组每只分别注射5.2×10⁶、5.2×10⁵、5.2×10⁴、5.2×10³和5.2×10²CFU；第6～10组进行口服接种亲本菌ST-1，每小组每只分别注射4.0×10⁹、4.0×10⁸、4.0×10⁷、4.0×10⁶和4.0×10⁵CFU。记录死亡情况并按照Reed andMuench法(Reed L J，Muench H.1938.A simple method of estimating fiftypercent endpoints.Am.J.Hyg.27：493-497)进行计算小鼠半数致死剂量(50％lethal dose，LD₅₀)。评价基因缺失菌株ΔcrpST-1与亲本菌株ST-1相比毒力减弱程度，结果见表2。亲本菌株和缺失菌株对小鼠的LD50分别为5.2×10⁴CFU和1.3×10⁸CFU。说明ΔcrpST-1的毒力较亲本菌株ST-1降低了2.5×10³倍。这表明本发明的基因缺失菌株ΔcrpST-1与亲本菌株ST-1相比其毒力明显降低。

表2本发明的基因缺失疫苗菌株与亲本菌株毒力比较试验

2、本发明的基因缺失菌株ΔcrpST-1对仔猪的安全性评价

选择20～25日龄、沙门氏菌阴性的仔猪10头，分为2组，每组5头。将本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗按每头猪2mL(含4.2×10⁹CFU活菌数)的剂量通过耳静脉接种第一组5头仔猪，接种后12～48h仔猪出现轻度的一过性的发热、体温升高反应，48h后均恢复正常，在此期间注射本发明制备的基因缺失疫苗的仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，接种后14天均可检测到沙门氏菌抗体。按同样的方法将2mL亲本菌株ST-1(含3.0×10⁹CFU活菌数)接种第二组5头仔猪，接种仔猪出现发热、精神不振，食欲减退或废绝，四肢末端及腹部发绀等临床症状；接种2天后开始死亡，7天内全部死亡；对该组5头仔猪进行病理剖检发现均具有典型的急性仔猪副伤寒的病理变化。本发明制备的基因缺失菌株ΔcrpST-1按每头猪2mL(含4.2×10⁹CFU活菌数)的剂量通过耳静脉接种妊娠母猪10头，所有妊娠母猪的精神食欲正常，未见异常变化，接种后14天均可检测到沙门氏菌抗体；和未接种的妊娠母猪比较，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等。这两个试验证实本发明制备的基因缺失菌株ΔcrpST-1对断奶仔猪和妊娠母猪均是安全的。

实施例5本发明的基因缺失菌株ΔcrpST-1在小鼠体内的免疫效力检测

1、小鼠的免疫程序

使用5～6周龄的BALB/c小鼠作为免疫效力评价，根据试验要求分为2组，分别为本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组和空白对照组。免疫途径为口服接种0.2mL(含4.0×10⁸CFU活菌量)细菌液和LB培养基，14天后加强免疫1次。分别于免疫前0天、首免后14天和28天检测沙门氏菌血清抗体(标准ELISA方法，参照Zhao Z，Xue Y，Wu B，Tang X，Hu R，Xu Y，GuoA，Chen H.2008.Subcutaneous vaccination with attenuated Salmonella entericaserovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin andpertactin antigens protects mice against fatal infections with both S.entericaserovar Choleraesuis and Bordetella bronchiseptica.Infect Immun.76(5)：2157-63.)。

2、免疫小鼠体液免疫抗体水平检测

小鼠免疫前采血，第二、三次采血分别在首免后14、28天进行，每组选取5只经尾静脉负压采血，分离血清，分别检测抗沙门氏菌血清抗体，取平均值。结果见表3。从表3中可以看出，首免后第14天本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组小鼠的沙门氏菌抗体为1∶32，二免后14天(即首免后28天)，本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组小鼠的沙门氏菌抗体效价分别升至在1∶512。而同步进行的LB对照均为阴性(＜1∶10)。上述试验结果表明本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌的体液免疫应答。

表3本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫小鼠血滴抗体检测(ELISA法)

3、ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫BALB/c小鼠的保护性试验

将5～6周龄沙门氏菌阴性BALB/c小鼠30只，平均分为2组，即本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗和LB对照组。本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组和对照组以0.2mL(活菌含量4.2×10⁸CFU)培养液通过口服接种BALB/c小鼠；LB对照组每只口服0.2mL LB培养基。14天后加强免疫1次。

二免后第14天(首免后28天)，从各组小鼠随机选取10只，均使用10×LD₅₀(口服途径LD₅₀，含有5.2×10⁵CFU)伤寒沙门氏菌强毒株ST-1对小鼠口服攻毒，观察30天。LB对照组小鼠攻毒后8h开始呈现精神沉郁、不食、扎堆；第3天开始出现死亡，死亡高峰出现在第5天，到第8天全部死亡。本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组攻毒后没有出现明显的发病症状，没有死亡情况发生。这说明本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫小鼠能够抵御10×LD₅₀伤寒沙门氏菌强度株ST-1的攻击。攻毒后保护率情况见表4所不。

表4本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗对伤寒沙门氏菌ST-1强毒株攻击BALB/c小白鼠的保护性评价

实施例6本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗在仔猪体内的免疫效力检测

1、猪的免疫程序：

选择20～25日龄、沙门氏菌阴性的仔猪10头，试验分2组，第1组为LB对照组，编号1～5，第2组为本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组，编号6～10。LB对照组每头猪注射2mL LB培养基，本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组每只猪通过颈部浅层肌肉注射方法接种2mL培养物(活菌含量4.2×10⁹CFU)。在免疫后14天和28天各采血一次，分别用ELISA方法检测沙门氏菌血清抗体(标准ELISA方法，方法同实施例5，参照Zhao Z，et al.2008.Subcutaneous vaccination with attenuated Salmonella enterica serovarCholeraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin andpertactin antigens protects mice against fatal infections with both S.entericaserovar Choleraesuis and Bordetella bronchiseptica.Infect Immun.76(5)：2157-63.)。试验分组、免疫途径和免疫剂量详细情况见表6。

2、免疫仔猪ELISA抗体水平检测

分别在免疫后14天和28天对每组中5头猪进行前腔静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法分别检测沙门氏菌血清平均抗体水平，结果见表5。免疫后14天本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组平均抗体效价为1∶80，免疫后28天，本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组平均抗体效价升至在1∶640。而同步进行的LB对照均为阴性(＜1∶10)。上述结果表明本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫仔猪后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌特异性抗体的体液免疫应答。

表5本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫仔猪血滴抗体检测(ELISA法)

3、本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗免疫仔猪的保护性试验：

免疫后30天，对2组共10头仔猪进行攻毒，每头猪耳静脉注射致死剂量的ST-1强毒株菌液(2mL，含有3.0×10⁹CFU活菌)进行攻毒，观察30天。LB对照组仔猪攻毒后表现为体温升高至41～42℃，精神不振，伏卧，食欲减退或废绝，呼吸困难，步行摇晃，呕吐与腹泻，四肢末端及腹部发绀，攻毒2天后开始死亡，10天内全部死亡。本发明的ΔcrpST-1基因缺失疫苗组仔猪攻毒后无明显发病症状，全部存活。这说明ΔcrpST-1基因缺失疫苗具有保护免疫仔猪抵抗伤寒沙门氏菌感染的能力，使其能够抵御致死剂量伤寒沙门氏菌强度株ST-1的攻击。攻毒后保护率情况见表6所示。

表6本发明制备的ΔcrpST-1基因缺失疫苗对伤寒沙门氏菌ST-1野生型强毒株攻击仔猪的保护性

本发明实施例的试验结果显示，本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗(ΔcrpST-1)免疫仔猪后能激发机体产生高效价针对沙门氏菌的特异性抗体，对小鼠和仔猪的毒性很低，安全性好。在免疫保护力试验中，免疫猪能抵抗致死剂量伤寒沙门氏菌强毒株的攻击。另外，本发明的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗(ΔcrpST-1)遗传背景清楚，不含抗性标记，性状稳定，完全符合兽用疫苗的生物安全性要求。

序列表

序列1

序列2

序列3

Claims (6)

1.一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，其特征在于：该菌株是伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)ΔcrpST-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011373。

2.根据权利要求1所述的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株，其特征在于：该菌株的缺失了环化腺苷酸(cAMP)受体蛋白基因crp中320bp的DNA片段。

3.一种由权利要求1所述的伤寒沙门氏菌基因缺失菌株在制备伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗的应用。

4.一种由伤寒沙门氏菌基因缺失菌株制备的缺失菌株制备的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗。

5.根据权利要求4所述的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗，其特征在于：所述的伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗为伤寒沙门氏菌基因缺失弱毒活疫苗。

6.一种伤寒沙门氏菌基因缺失菌株在制备伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用。

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