CN115737795B - 一种鸡滑液囊支原体活疫苗及其效力检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡滑液囊支原体活疫苗及其效力检验方法。其中鸡滑液囊支原体活疫苗使用鸡滑液囊支原体弱毒菌株BOR21株经培养后，加入冻干保护剂后分装冻干而成，用于预防鸡滑液囊支原体感染。本发明生产用菌种为鸡滑液囊支原体弱毒疫苗BOR21株，检验用菌种为鸡滑液囊支原体强毒BHQ03株，免疫方法采用的是颈部皮下或肌肉注射的接种途径，效力检验方法中包含了一种本动物翅下静脉注射的攻毒方式及发病评价方法，试验结果一致性更好，并能以最直接的方式测定该疫苗免疫保护效力。本发明提供的鸡滑液囊支原体活疫苗国内尚没有同类活疫苗的注册和生产，产品的市场需求巨大，具有良好的应用前景。

Description

一种鸡滑液囊支原体活疫苗及其效力检验方法

技术领域

本发明属于兽医疫苗技术领域，具体涉及一种鸡滑液囊支原体活疫苗及其效力检验方法。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)是一种能引起幼龄鸡和火鸡的鸡滑液囊支原体病的病原，该病的主要特征包括：精神萎靡、羽毛蓬乱、消瘦，部分还伴有呼吸道疾病、脚掌或关节肿大、滑液囊及肌腱发炎等症。

鸡滑液囊支原体感染遍布全球，任何一个养鸡的国家和地区均无法避免该病的感染，可感染各种日龄的商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，本病一年四季均可发生。鸡滑液囊支原体感染发病的一般多见于4～16周龄的鸡，发病率通常在5％～20％，发病鸡中有5～20％出现关节或脚掌肿胀，死亡率约1％～10％，大多数表现为生长发育迟缓，淘汰率增高。成年鸡多表现为隐性感染，感染率可达100％，通常不表现任何症状，但会导致饲料转化率下降、产蛋量下降等。一旦在鸡群中感染，根除很困难。

该病既能通过鸡蛋进行垂直传播，还可通过直接或间接接触进行水平传播，引起鸡发病的病原主要以垂直传播的病原引起，还是由水平传播的病原引起或者二者兼有目前还没有定论。

临床上预防鸡滑液囊支原体感染的方式有两种，一种方式是使用抗菌药物，可以一定程度上控制发病，但其不能根除鸡体内的鸡滑液囊支原体。另一种方式是疫苗免疫，当前国内可使用的相关疫苗有两种，一种是我国注册批准疫苗鸡滑液支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)【(2020年)新兽药字3号】，由青岛易邦生物工程有限公司注册生产，使用方法为21日龄以上鸡，颈部皮下免疫0.5ml/只，本动物效力检验方法为：免疫后14日脚掌注射强毒菌株，14日后观察脚掌是否发生肿胀，确定是否保护。另一种是由澳大利亚生物资源公司进口注册的鸡滑液支原体活疫苗(MS-H株)【(2017年)外兽药字33号】，其效力检验直接使用疫苗中的活菌数替代，未提供本动物免疫攻毒的效力评价方法。

从当前使用以上两种支原体疫苗的反映来看，认为支原体病的灭活疫苗能有效产生一定水平的抗体，但对于细菌性疾病而言，灭活疫苗产生的体液免疫对机体预防相应病原感染的作用有限，免疫效力的本动物评价，采用脚掌攻毒的方式是否能真实反映免疫保护效力，毕竟临床上仔鸡感染鸡滑液囊支原体发病病例是以消瘦、精神萎靡为主，只有不到20％的病例会出现脚掌或关节肿胀。而MS-H株活疫苗的效力检验只采用了活菌计数的方式，无法真实直观反映其实际保护效力；其免疫途径采用的是点眼0.03ml/羽份，模拟的是田间自然感染途径，理论上对自然感染的田间野毒菌株有一定的抵抗作用，很难对经垂直传播的内源性病原起到免疫保护作用。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种鸡滑液囊支原体活疫苗及其效力检验方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种鸡滑液囊支原体活疫苗，其使用鸡滑液囊支原体弱毒菌株BOR21株经培养后，加入冻干保护剂后分装冻干而成，用于预防鸡滑液囊支原体感染。

进一步地，鸡滑液囊支原体疫苗株BOR21株的驯化为：选择菌株BHQ03株作为驯化致弱的祖代菌株，采用先低温33℃培养3代后，再高温39℃培养3代后，再进行单菌落克隆，经毒力和免疫原性测定筛选出毒力低、免疫原性好的菌株；再将该菌株进行低温驯化—高温驯化—单菌落(或克隆株)—安全性筛选—效力筛选，如此经过4轮循环驯化筛选后，得到安全性和免疫效力稳定的鸡滑液囊支原体弱毒菌株，命名为BOR21株。

提供一种鸡滑液囊支原体活疫苗的制备方法，包括以下步骤：MQ-6培养基的配制、鸡滑液囊支原体疫苗株BOR21株一级种子的繁殖、二级种子的繁殖、生产用种子的制备、制苗用菌液的制备、冻干分装，制成成品。

进一步地，一级种子的繁殖具体包括以下步骤：取鸡滑液囊支原体BOR21疫苗株冻干菌种，用MQ-6培养基溶解后，以10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下培养48～72h，当培养物颜色变黄，pH值为6.8，再以10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下培养24～36h，纯粹检验和效力检验合格后，将培养物分装置-65℃以下冻存，作为一级种子。

进一步地，二级种子的繁殖具体包括以下步骤：取一级种子，以5％～10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下震荡培养24～36h，当培养物颜色变黄pH值下降到6.8，收获菌液，扩大培养，经纯粹检验合格后作为二级种子，2～8℃保存不超过7日。

进一步地，生产用种子的制备具体包括以下步骤：将二级种子按5％～10％的比例接种装有MQ-6培养基的生物反应器中，在37±1℃发酵培养18～24h，搅拌转速100rpm，当培养物颜色变黄且pH值下降到6.8，收获菌液，作为生产用种子，2～8℃保存不超过7日。

进一步地，制苗用菌液的制备具体包括以下步骤：将生产用种子按5％～10％的比例接种装有MQ-6培养基的生物反应器中，在37±1℃发酵培养18～24h，搅拌转速100rpm，当培养物颜色变黄且pH值下降到6.8，将pH维持在6.9±0.1，按培养物总体积10％的MQ-6培养基进行补料1次，继续培养6h后收获培养物，获得菌液。

提供一种鸡滑液囊支原体活疫苗的效力检验方法，包括以下步骤：取7～14日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.025ml，免疫后14日，连同对照SPF鸡10只，使用鸡滑液囊支原体BHQ03株强毒菌株新鲜培养物，使用生理盐水将培养物稀释至1×10⁷CCU₅₀/ml，对每只SPF鸡进行翅下静脉攻毒，0.1ml/只，观察14日，对照组应不少于7/10发病或死亡，实验组应不少于7/10保护。

进一步地，鸡经翅下静脉感染鸡滑液囊支原体强毒，攻毒剂量为1×10⁶CCU₅₀活菌/只，14日后发病的评价方式：(1)“羽毛蓬乱、精神沉郁”或“体重低于攻毒时体重的110％”，判为“+”；(2)“羽毛蓬乱、精神沉郁”并且“体重低于攻毒时体重的110％”，判为“++”；(3)卧地不起，判为“+++”；(4)死亡，判为“++++”；达到“++”及以上即可判为发病。

本发明的有益效果为：

1.本发明制备用菌种为鸡滑液囊支原体弱毒疫苗BOR21株，检验用菌种为鸡滑液囊支原体强毒BHQ03株，免疫方法采用的是颈部皮下或肌肉注射的接种途径。效力检验可以使用SPF鸡免疫攻毒的方式，也可使用活菌滴度测定的方式。免疫攻毒方式主要用于方便客户对疫苗进行临床评价，疫苗销售推广时方便。活菌滴度测定的方式，主要方便生产企业的低成本快速检验。两种方式具有很好的一致性，采用其中一种即可。

2.本发明在鸡滑液囊支原体弱毒疫苗株的驯化筛选上，采用先低温33℃培养3代后，再高温39℃培养3代后，再进行单菌落克隆，经毒力和免疫原性测定筛选出毒力低、免疫原性好的菌株；再该菌株进行低温驯化—高温驯化—单菌落—安全性筛选—效力筛选，然后再低温/高温驯化，得到当前的鸡滑液囊支原体弱毒疫苗BOR21株。

3.使用以上驯化的弱毒株制造的鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)具有良好的安全性，采用10倍的使用剂量接种7～14日龄SPF鸡10只，观察14日，安检鸡均可10/10健活，无任何与疫苗接种的不良反应。

4.该疫苗具有良好的免疫保护效力，使用剂量接种7～14日龄SPF鸡10只，14日后，连同对照组10只同日龄SPF鸡使用鸡滑液囊支原体BHQ03强毒株进行攻毒，免疫观察14日，对照组不少于7/10发病或死亡，免疫组可达到7/10以上保护。

5.本发明的鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)采用颈部皮下或肌肉注射的免疫方法，能快速使鸡产生良好的细胞免疫和体液免疫，无论对内源性的垂直传播病原，还是外源性的水平传播病原均具有良好的免疫保护力；颈部皮下或肌肉面积大，接种操作更加方便；免疫剂量小，仅需0.02～0.03ml/羽份，对生产企业而言，单剂量的生产成本也大幅降低，大大扩展企业的利润空间和直接经济效益。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

鸡滑液囊支原体疫苗株BOR21株的驯化：

第一步 候选强毒菌株的筛选，通过对本实验室保存的全部16株鸡滑液囊支原体田间分离菌株进行毒力测定，选择其中毒力最强的分离株BHQ03作为驯化致弱的祖代菌株。BHQ03分类命名为鸡滑液囊支原体，已于2022年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC No.45284。

第二步 菌株的致弱，采用了传统的改变培育温度的方式进行致弱，但有所不同的是采用先低温33℃培养3代后，再高温39℃培养3代后，再进行单菌落克隆，经毒力和免疫原性测定筛选出毒力低、免疫原性好的菌株；再将该菌株进行低温驯化—高温驯化—单菌落—安全性筛选—效力筛选，再低温/高温驯化，如此经过4轮循环驯化筛选后，得到安全性好、免疫效力高的鸡滑液囊支原体弱毒菌株，命名为BOR21株，作为本发明鸡滑液囊支原体活疫苗的生产用菌株。BOR21分类命名为鸡滑液囊支原体，已于2022年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC No.45283。

实施例2

鸡滑液囊支原体活疫苗生产：

1.生产用种子的制备

1.1MQ-6培养基配制：称取或量取适量的胰蛋白胨、葡萄糖、水解乳蛋白(Difco)、25％酵母浸出液、青霉素、半胱氨酸、辅酶I、酚红溶于500ml注射用水中，使用2mol/L NaOH调pH值至7.8～7.9，补加注射用水至总体积900ml，使用0.2μm滤器过滤除菌，即为MQ-6基础液，分装后置2～8℃保存备用。取MQ-6培养基基础液900ml，加入100ml猪血清和马血清。用1mol/L NaOH溶液调pH值至7.6～7.8，共计1000ml，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果为无菌生长，2～8℃保存。

1.2一级种子的繁殖：取鸡滑液囊支原体BOR21疫苗株冻干菌种，用MQ-6培养基溶解后，以10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下培养48～72h，当培养物颜色变黄，pH值为6.8，再以10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下培养24～36h，纯粹检验和效力检验合格后，将培养物分装置-65℃以下冻存，作为一级种子。

1.3二级种子的繁殖：取一级种子，以5％～10％的比例接种MQ-6培养基，置37±1℃下震荡培养24～36h，当培养物颜色变黄pH值下降到6.8，收获菌液，扩大培养，经纯粹检验合格后作为二级种子，2～8℃保存不超过7日。

1.4生产用种子的制备：将二级种子按5％～10％的比例接种装有MQ-6培养基的生物反应器中，在37±1℃发酵培养18～24h，搅拌转速100rpm，当培养物颜色变黄且pH值下降到6.8，收获菌液，作为生产用种子，2～8℃保存不超过7日。

2.制苗用菌液的制备

2.1菌液培养：将生产用种子按5％～10％的比例接种装有MQ-6培养基的生物反应器中，在37±1℃发酵培养18～24h，搅拌转速100rpm，当培养物颜色变黄且pH值下降到6.8，将pH维持在6.9±0.1，按培养物总体积10％的MQ-6培养基进行补料1次，继续培养6h后收获培养物，获得菌液，共获得菌液抗原8000ml。

2.2半成品检验

2.2.1纯粹检验：按照现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，纯粹。

2.2.2活菌计数：用MQ-6培养基对培养物按照实施例4的方法进行CCU₅₀测定，活菌数结果为1.5×10⁹CCU₅₀/ml。

2.3配苗及分装：将发酵后的支原体菌液500ml按5:1的比例加入冻干保护剂，充分混匀。

2.4冻干：按2ml/瓶进行定量分装，冷冻干燥后，压盖、贴签、包装后即为成品，共计287瓶。

3.将以上生产的鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)成品，按照质量标准要求进行性状、纯粹检验、安全检验、效力检验、真空度测定、剩余水分测定等项目检验的检验，结果各项指标均符合规定。

实施例3

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的成品检验质量标准

1性状：海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2纯粹检验：按照现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，即取5瓶疫苗各加入稀释液充分溶解恢复体积后，分别接种到MQ-6培养基中，培养3日，均应纯粹生长。

3安全检验：将疫苗稀释成恢复原体积后，即0.25ml含10羽份，分别颈部皮下或肌肉接种7～14日龄SPF鸡10只，0.25ml/只，观察14日，安检鸡应10/10健活，无任何与疫苗接种的不良反应。否则，应重检一次。

4效力检验：以下2种方法任选其一。

方法1：将疫苗恢复原体积后，进行CCU₅₀测定，冻干疫苗活菌数应≥1×10⁸CCU₅₀/ml。

方法2：取7～14日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.025ml。免疫后14日，连同对照SPF鸡10只，使用鸡滑液囊支原体BHQ03株强毒菌株新鲜培养物，使用生理盐水将培养物稀释至1×10⁷CCU₅₀/ml，对每只SPF鸡进行翅下静脉攻毒，0.1ml/只。观察14日，对照组应不少于7/10发病或死亡，免疫组应不少于7/10保护。

5真空度测定：按照现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

6剩余水分测定：按照现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的成品需按照以上质量标准进行以上全部项目的检验，均应符合规定要求。

实施例4

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的效力试验

对1批鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)按照实施例3的质量标准中效力检验进行试验。疫苗批次：20220527，装量：2ml/瓶，共计287瓶，随机抽取3瓶用于效力检验。

取3瓶20220527批鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)分别加入生理盐水，恢复原体积后，溶解后充分混合，用于效力检验。

按照效力检验的方法1进行活菌滴度CCU₅₀的测定，测定方法为：取10支含有1.8ml禽支原体专用液体MQ-6培养基的小试管，取以上溶解好的疫苗液0.2ml，接入第1支试管，混匀后再取0.2ml加入到第2支试管，如此进行10倍系列稀释至10^-10；再分别从10^-6、10^-7、10^-8、10^-9管中各取0.2ml接种到含1.8ml培养基的小管中，每个稀释度接种6支小管，共计24支小管，置37±1℃静置培养。14日后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥0.5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU₅₀)。

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)CCU₅₀测定的结果

CCU₅₀计算方法如下：

log CCU₅₀＝高于50％变色的稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数；

以上表为例，高于50％变色的稀释度为-7，

log CCU₅₀＝-7+0.5×(-1)＝-7.5；

即CCU₅₀＝10^-7.5/0.2ml，将其转换成每毫升含CCU₅₀数为:5×3.16×10⁷＝15.8×10⁷CCU₅₀/ml，即1.58×10⁸CCU₅₀/ml。

按照上述效力检验方法进行检验，结果疫苗的活菌数为1.58×10⁸CCU₅₀/ml，高于1.0×10⁸CCU₅₀/ml，符合质量标准要求，结果符合规定。

按照效力检验的方法2进行免疫攻毒的评价方式，将3瓶20220527批鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)溶解、混匀后的疫苗液用于SPF鸡的免疫。取10日龄SPF鸡20只，其中10只作为疫苗免疫组，颈部皮下或肌肉注射混合后的疫苗0.025ml。免疫后14日，连同对照SPF鸡10只使用鸡滑液囊支原体BHQ03株强毒菌株新鲜培养物，使用生理盐水将培养物稀释至1×10⁷CCU₅₀/ml，对每只SPF鸡进行翅下静脉攻毒，0.1ml/只。观察14日，结果如下表：

注：MS发病的评价方式：(1)“羽毛蓬乱、精神沉郁”或“体重低于攻毒时体重的110％”，判为“+”；(2)“羽毛蓬乱、精神沉郁”并且“体重低于攻毒时体重的110％”，判为“++”；(3)“卧地不起”，判为“+++”；(4)“死亡”，判为“++++”。达到“++”及以上即可判为发病。

以上结果显示，攻毒对照组10/10发病，免疫组8/10保护，效力检验结果符合规定。

实施例5

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的安全检验。

对一批鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)按照实施例3的质量标准中安全检验方法进行试验。疫苗批次：20220527，装量：2ml/瓶，每瓶80羽份，共计287瓶，随机抽取3瓶用于安全检验。

取10只7日龄SPF鸡，用生理盐水将3瓶疫苗稀释恢复体积后，混合均匀，分别颈部皮下或肌肉接种，0.25ml/只。观察14日，结果为10/10健活，无任何与疫苗接种有关的不良反应，安全检验结果符合规定。

实施例6

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的性状、纯粹检验、真空度测定结果。

取5瓶疫苗进行观察，均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，分别加2ml稀释液后迅速溶解，性状检验结果为符合规定。

按照现行《中国兽药典》附录中纯粹检验规定的要求，取5瓶疫苗各加入2ml稀释液充分溶解后，分别接种到MQ-6培养基中，培养3日，结果均为纯粹生长，结果符合规定。

按照现行《中国兽药典》附录中真空度测定的要求，取5瓶样品，使用高频火花真空测定器对冻干制品进行真空度测定，测定时，将高频电火花真空测定器之相容器内无制品的部位，5/5出现辉光，符合规定。

实施例7

鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)的剩余水分测定。

按照现行《中国兽药典》附录进行测定，采用真空烘干法，测定前，先将洗净干燥的称量瓶置150℃干燥箱烘干2h，放入有适宜干燥剂的干燥器中冷却后称重。迅速打开真空良好的疫苗瓶，将制品倒入称量瓶内盖好，在天平上称重。每批做4个样品，每个样品的重量为100～300mg，称后立即将称量瓶置于有适宜干燥剂的真空干燥箱中，打开瓶盖，关闭真空干燥箱后，抽真空至2.67kPa(20mmHg)以下，加热至60～70℃，干燥3小时。然后通入经过适宜干燥剂吸水的干燥空气，待真空干燥箱温度稍下降后，打开箱门，迅速盖好称量瓶的盖，取出所有称量瓶，移入含有适宜干燥剂的干燥器中，冷却至室温，称重，放回真空干燥箱继续干燥1小时，两次干燥至恒重，减失的重量即为含水量。4个样品的每个样品剩余水分分别为2.86％、3.03％、2.89％、2.77％，平均不超过4％，结果符合规定。

至此，已完成对的全部检验项目，结果均为符合规定，由此可判定：批号为20220527的鸡滑液囊支原体活疫苗(BOR21株)按照其成品检验质量标准进行检验，结果符合规定。

于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.一种鸡滑液囊支原体活疫苗，其特征在于，其使用鸡滑液囊支原体弱毒菌株BOR21株经培养后，加入冻干保护剂后分装冻干而成，用于预防鸡滑液囊支原体感染；BOR21株的保藏编号为CGMCC No.45283。