CN109331178A - 一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法 - Google Patents

一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，分离出原始菌株SC26；b、分别经紫外、亚硝基胍诱变原始菌株SC26，获得各自最佳诱变条件，最佳诱变条件下细菌死亡率为80～90%左右，然后以各自最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株SC2261；c、将减弱的诱变菌株SC261扩大培养，制备沙门氏菌减毒疫苗。发明提供的鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，取发病区当地菌株，免疫原性针对性强，临床效果好，相当于专场专项疫苗。

Description

一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于动物细菌减毒疫苗领域，具体涉及一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科成员，超过2500个血清型，在自然界分布广泛，几乎所有动物都能发生感染，因为血清型众多，不同动物的感染谱不一样，这给沙门氏菌病的防控带来了很大困难。
要成功摆脱沙门氏菌的困扰，需从整条生产链上各个环节实施防控，即所谓从农场到餐桌，当中主要涉及到饲料工业、养殖场和屠宰加工三个环节，降低畜禽的沙门氏菌感染率被认为是减少畜禽产品沙门氏菌污染的重要措施，除了控制饲料与水源的污染、维持良好的卫生环境、防止老鼠、野鸟传播等基本的卫生和生物安全措施外，使用疫苗可以有效地降低畜禽的沙门氏菌感染率，特别是在沙门氏菌流行率高养殖地区，因为疫苗在一定程度上可以阻止或减少沙门氏菌在肠道定殖，从而降低粪便的排毒量或蛋壳的污染率，还可以降低沙门氏菌在生殖组织的定殖以减少垂直传播，某些血清型如鸡白痢沙门氏菌和马流产沙门氏菌，很容易感染生殖道并在生殖道定殖。
虽然灭活苗和活疫苗都能够减少动物沙门氏菌的感染率和降低其排毒量，但大量研究表明活疫苗比灭活苗能更有效抵御沙门氏菌的感染，原因在于活疫苗可以同时激活体液免疫和细胞免疫，且能够更好诱导Th1反应，这对胞内菌的免疫清除起重要的作用，同时由于沙门氏菌主要通过消化道侵入机体，这对阻止沙门氏菌入侵肠道起到重要作用。由于活疫苗有其它疫苗无可比拟的优势，长期以来，研究者致力于研制安全有效而又遗传稳定的沙门氏菌弱毒株，探索出各种人工致弱的方法，研制出多种安全有效的沙门氏菌弱毒菌株，由于血清型众多，交叉免疫效果不强，故当地采集病原诱变减毒疫苗，制备减毒疫苗能安全有效的防治养殖场沙门氏菌病。
发明内容
针对上述防治禽类特别是鸭养殖场沙门氏菌感染的问题，本发明的目的是提供能够很好预防养殖场沙门氏菌感染的减毒疫苗的制备方法。
本发明的技术方案具体为：
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，分离出原始菌株；
b、分别经紫外、亚硝基胍诱变原始菌株，获得各自最佳诱变条件，最佳诱变条件下细菌死亡率为80～90%左右，然后以各自最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，制备沙门氏菌减毒疫苗。
所述步骤b具体步骤为，
（1）取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养18-24h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐,表面光滑,半透明,小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，保存备用；
（2）最佳诱变条件的筛选，将步骤（1）中得到的1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为10-30cm的垂直高度下搅拌照射10-30s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.5-0.7 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用15-30 min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行复合诱变，诱变后的诱变菌株保存备用。
所述步骤c具体步骤为，
（1）将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养8-12h，细菌计数后，用生理盐水配制成1×1010 - 5×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液，备用；
（2）灭活脱脂乳制备，将脱脂奶粉10-15g加入100ml去离子水中，充分混合，100℃-110℃灭菌15-30min，冷却后备用；
（3）取步骤（1）得到的减毒毒株菌液3-5份，与灭菌脱脂乳5-7份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
相对于现有技术，本发明具有的优点和效果如下，
（1）本发明提供的鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，取发病区当地菌株，免疫原性针对性强，临床效果好，相当于专场专项疫苗。
（2）鸭沙门氏菌减毒毒株制备条件简单，经测试35代不反强，致病性弱。
（3）鸭沙门氏菌减毒疫苗制备工艺简单，且临床效果好，适合大量生产，一些大型养殖场自己可以制备，减轻养殖场的养殖成本。
具体实施方式
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，分离出原始菌株；
b、分别经紫外、亚硝基胍诱变原始菌株，获得各自最佳诱变条件，最佳诱变条件下细菌死亡率为80～90%左右，然后以各自最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，制备沙门氏菌减毒疫苗。
所述步骤b具体步骤为，
（1）取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养18-24h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐,表面光滑,半透明,小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，保存备用；
（2）最佳诱变条件的筛选，将步骤（1）中得到的1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为10-30cm的垂直高度下搅拌照射10-30s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.5-0.7 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用15-30 min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行复合诱变，诱变后的诱变菌株保存备用。
原始菌株对一周龄雏鸭的半数致死量LD50为7.4×107，而诱变菌株对一周龄雏鸭的LD50为3.9×108，是原始菌株的5.2倍，表明诱变菌株的毒力下降至原始菌株的1/5。
所述步骤c具体步骤为，
（1）将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养8-12h，细菌计数后，用生理盐水配制成1×1010 - 5×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液，备用；
（2）灭活脱脂乳制备，将脱脂奶粉10-15g加入100ml去离子水中，充分混合，100℃-110℃灭菌15-30min，冷却后备用；
（3）取步骤（1）得到的减毒毒株菌液3-5份，与灭菌脱脂乳5-7份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。临床使用每瓶500羽，饮水或肌肉注射。
实施例1
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养18h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成1×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为10的垂直高度下搅拌照射10s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.5 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用15min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养8h，细菌计数后，用生理盐水配制成1×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉10g加入100ml去离子水中，充分混合，100℃灭菌15min，冷却得到灭菌脱脂乳；取减毒毒株菌液3份，与灭菌脱脂乳5份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
实施例2
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养24h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为30cm的垂直高度下搅拌照射30s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.7 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用30min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养12h，细菌计数后，用生理盐水配制成5×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉15g加入100ml去离子水中，充分混合， 110℃灭菌30min，冷却得到灭菌脱脂乳；取减毒毒株菌液5份，与灭菌脱脂乳7份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
实施例3
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养21h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成3×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为20cm的垂直高度下搅拌照射20s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.6 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用22min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养10h，细菌计数后，用生理盐水配制成3×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉13g加入100ml去离子水中，充分混合，105℃灭菌22min，冷却得到灭菌脱脂乳；取减毒毒株菌液4份，与灭菌脱脂乳6份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
实施例4
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养20h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成1×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为20cm的垂直高度下搅拌照射15s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.5 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用30min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养8h，细菌计数后，用生理盐水配制成1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉15g加入100ml去离子水中，充分混合，105℃灭菌30min，冷却后得到灭菌脱脂乳；取1010 CFU/ml的减毒毒株菌液3份，与灭菌脱脂乳6份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
实施例5
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养22h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成4×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为25cm的垂直高度下搅拌照射25s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.7 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用20min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养12h，细菌计数后，用生理盐水配制成4×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉12g加入100ml去离子水中，充分混合，100℃灭菌20min，冷却后得到灭菌脱脂乳；取4×1010 CFU/ml的减毒毒株菌液5份，与灭菌脱脂乳7份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
实施例6
一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，分离出原始菌株；
b、接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养24h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成3×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为15cm的垂直高度下搅拌照射10s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.6 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用15min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株，诱变后的诱变菌株保存备用；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养10h，细菌计数后，用生理盐水配制成1010 CFU/ml的减毒毒株菌液；将脱脂奶粉14g加入100ml去离子水中，充分混合，110℃灭菌5min，冷却后得到灭菌脱脂乳；取1010 CFU/ml的减毒毒株菌液4份，与灭菌脱脂乳5份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
血清抗体检测
（1）选取2周龄雄性雏鸭24只，平均分为3组，一组用本发明制备的减毒疫苗免疫，一组用PBS免疫，另一组空白对照组。口服或肌注免疫，免疫剂量为0.2mL/只，初次免疫两周后进行加强免疫1次，具体操作同第一次免疫。
（2）血清抗体ELISA检测，以及琼脂扩散检测，用沙门氏菌减毒疫苗免疫过的一组血清抗体明显高于阴性对照组和空白组。
攻毒保护实验
（1）选取2周龄雄性雏鸭30只，平均分为3组，一组用本发明制备的减毒疫苗免疫，一组用PBS免疫，另一组空白对照组。口服或肌注免疫，免疫剂量为0.2mL/只。
（2）免疫后的15天左右，用沙门氏菌攻毒，剂量5×108 cfu每只0.5ml，攻毒后连续观察7天，记录死亡以及采食发病情况。
各组临床疗效结果
A组为实验组，大多数精神良好，采食稍降，4天后死亡一只。B组阴性对照、C空白对照攻毒后精神沉郁，采食明显下降，2-3天死亡居多。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
a、从易感染沙门氏菌的养鸭场内选取感染沙门氏菌的病变鸭子，分离出原始菌株；
b、分别经紫外、亚硝基胍诱变原始菌株，获得各自最佳诱变条件，最佳诱变条件下细菌死亡率为80～90%左右，然后以各自最佳诱变条件进行紫外—亚硝基胍复合诱变，得到减弱的诱变菌株；
c、将减弱的诱变菌株扩大培养，制备沙门氏菌减毒疫苗。
2.如权利要求1所述的鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤b具体步骤为，
（1）取感染沙门氏菌的病变鸭子，解剖取病变组织，接种普通LB固体培养基，37℃培养箱中培养18-24h，挑取LB固体培养基长出的圆形边缘整齐,表面光滑,半透明,小凸起的菌落，分别接种于沙门氏菌显色培养基和DHL沙门氏菌鉴定培养基，选择在沙门氏菌显色培养基上显淡紫色、同时在DHL沙门氏菌鉴定培养基上显黑色的菌株，传代纯化后，扩大培养，细菌计数后用生理盐水配制成1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液，保存备用；
（2）最佳诱变条件的筛选，将步骤（1）中得到的1×108 - 5×108 CFU/ml的原始菌株菌悬液经波长为254 nm的紫外线在距离为10-30cm的垂直高度下搅拌照射10-30s后，加入亚硝基胍使其最终浓度达0.5-0.7 mg/ml并于37℃、100 r/min的摇床中作用15-30 min，使原始菌死亡率达80～90%，以此作为最佳诱变条件进行复合诱变，诱变后的诱变菌株保存备用。
3.如权利要求1所述的鸭沙门氏菌减毒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤c具体步骤为，
（1）将诱变菌株接种LB液体培养基，37℃摇床培养8-12h，细菌计数后，用生理盐水配制成1×1010 - 5×1010CFU/ml的减毒毒株菌液，备用；
（2）灭活脱脂乳制备，将脱脂奶粉10-15g加入100ml去离子水中，充分混合，100℃-110℃灭菌15-30min，冷却后备用；
（3）取步骤（1）得到的减毒毒株菌液3-5份，与灭菌脱脂乳5-7份充分混合，分装于灭菌5ml西林瓶中，冻干。
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