CN102037006A

CN102037006A - 抗细菌组合物

Info

Publication number: CN102037006A
Application number: CN2009801023027A
Authority: CN
Inventors: S·帕金森; L-H·佩雷兹
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-01-15
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2011-04-27
Also published as: EP2242763A1; KR20100116612A; JP2011509966A; AU2009204842A1; EA201001138A1; WO2009090168A1; PE20091334A1; AR070177A1; CA2711972A1; TW200936155A; BRPI0906517A2; CL2009000065A1; MX2010007727A; US20100286027A1

Abstract

本发明公开用作抗微生物剂的分离蛋白质，其包含多个LRR(富亮氨酸重复序列)结构域，每个LRR结构域独立地包含式(I)的氨基酸序列：(F1LxxLxL(xxZ)_YF2)，其中：F1和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；x可以是任何氨基酸；L可以是Leu、Ile、Val或Phe；Z可以是NxL或CxxL；N是Asn、Thr、Ser或Cys；C是Cys或Ser；且Y＝0或1。

Description

抗细菌组合物

1.发明领域

本发明涉及治疗或预防病原细菌感染的抗细菌组合物和方法。更具体来说，本发明涉及用于治疗或预防细菌感染和与其相关的疾病的抗细菌药物组合物。本发明的其它方面、目的和优势从下面的描述来看是显而易见的。

2.发明背景

肠上皮围圈住肠腔中的细菌，从而允许宿主收获其自身无法合成的原核生物代谢产物，同时保护宿主免遭感染。由于上皮细胞经常暴露于胃肠道的微生物群，其也是很多病原体的主要进入点。为了防止宿主感染，上皮细胞表达各种模式识别受体(PRR)如Nod2来提供抵御入侵的第一道防线。PRR是先天免疫系统的基本组分。它们识别存在于细菌、卵菌、线虫、真菌、病毒和昆虫中的保守基序，并在宿主中触发对入侵微生物直接的可测且靶向的反应(Ting JPY和Davis BK，2005)。

包括Nod、Nalp和植物R蛋白家族在内的许多PRR的一个共有元件是富亮氨酸重复序列(LRR)结构域。该保守富亮氨酸重复序列为LRR结构域的马蹄铁图样形状提供了结构支架，而PRR侧翼区是变化多样的多肽片段，赋予对共同微生物基序的识别(Matsushima N.等人，2005)。LRR结构域存在于从植物到人类的PRR中，并且对宿主抗病原体的抗性是必不可少的。某些含LRR蛋白的缺失或自发突变造成宿主对感染的易感性(Dangl JL和Jones JDG，2001)。无颚鱼类利用LRR结构域作为支架基于不同LRR肽序列的重组，发育新的适应性免疫系统(Pancer Z等人，2004，Alder MN等人，2005，Nagawa F等人，2007)。

在人类中，基因研究已在很多LRR中鉴定了与各种疾病(包括传染性或炎症性起源的那些疾病)易感性相关的单核苷酸多态性(SNP)(Matsushima N.等人，2005)。Nod2可能是获得最广泛研究的与疾病相关的含LRR蛋白。其赋予克罗恩病易感性，并且在许多独立的研究中已经证实其与该疾病的联系(Hugot JP等人，2001，Ogura Y等人，2001，Hampe J等人，2007，Libioulle C等人，2007，Raelson JV等人，2007，The Wellcome Trust Case Control Consortium，2007)。Nod2的LRR结构域中的突变赋予克罗恩病易感性，而Nod2的相邻NACHT结构域中的特定突变是Blau综合征(一种少见的常染色体显性紊乱，其特点是早发肉芽肿性关节炎、葡萄膜炎和皮疹伴先天性指屈曲)的遗传原因(Miceli-Richard C等人，2001)。这表明Nod2 LRR结构域的特定分子功能造成对肠病的易感性。

大多数围绕Nod2的研究集中于其响应于推定配体对信号转导途径的激活。与克罗恩病最通常相关的三个Nod2 SNP在其对MDP(细菌蛋白聚糖衣外被的组分)的响应上均存在缺陷，表现出缺少NFkB易位和细胞因子的产生(Barnich N等人，2005)。相反地，克罗恩病的特征在于升高的NFkB-依赖性细胞因子产生。关于克罗恩病相关Nod2 SNP是功能突变的获得还是失去的辩论正在进行(Watanabe T等人，2004，Kobayashi KS等人，2005，Maeda S，2005)。

在利用Nod2敲除小鼠株的研究中也已经突显Nod2在保护宿主免遭细菌感染中的作用(Kobayashi KS等人，2005)。Nod2敲除对由单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起的口腔(但不是全身性)感染更敏感。这是个重要的发现，因为已报道克罗恩病患者显示出其胞内细菌及上皮相关细菌的实质性增加(Swidsinski A等人，2002，Darfeuille-Michaud A，2002，Liu Y等人，1995)。一些报告已经提示Nod2在预防细胞的细菌感染中的作用(Hisamatsu T等人，2003)。这些研究表明克罗恩病相关Nod2 3020insC蛋白在作为防御因子对抗胞内细菌方面的缺陷。同一组的随访研究表明抗沙门氏菌(Salmonella)感染的Nod2-依赖性保护作用依赖于线粒体蛋白grim19(Barnich N等人，2005)。Nod家族的其它成员(Nod1)也已经显示抗胞内细菌的保护功能(Zilbauer M等人，2007，Travassos LH等人，2005)。与Nod2不同，Nod1与grim19没有关系(Barnich N等人，2005)，表明Nod蛋白阻止细胞感染的机理仍有待于确定。

本说明书(包括任何本专利申请的优先权申请文件的说明书)中公开的所有参考文献清楚地且完全地通过引用并入本文。

3.发明概述

本发明至少部分基于含有富亮氨酸重复序列(LRR)基序的蛋白具有直接抗细菌活性的发现。

在本发明的一个方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)式(I)的LRR的分离蛋白质：

(F1LxxLxLxxZF2) (I)

其中

F1和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；

x可以是任何氨基酸、

L可以是Leu、Ile、Val或Phe；

Z可以是NxL或CxxL；

N是Asn、Thr、Ser或Cys；

C是Cys或Ser。

在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上(例如2至50个)串联的式(I)LRR的分离蛋白质。

在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上(例如2至50个)衍生自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串联)的分离蛋白质。

在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)核苷酸结合位点(NBS)-LRR、例如NOD-LRR(例如NOD2-LRR或NOD1-LRR，特别是人NOD2-LRR或人NOD1-LRR)的分离蛋白质。在其它方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)CIITA-LRR、Toll受体-LRR(例如TLR2，4，5，7，8，9-LRR结构域)、NAIP-LRR的分离蛋白质。

在本发明的一个方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)、氨基端效应子结构域和羧基端富亮氨酸重复序列(LRR)结构域的分离蛋白质。

在本发明的另一方面，提供了组合物(特别是具有抗细菌活性的药物组合物)，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的蛋白质，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD、Pyrin、死亡结构域或死亡效应子结构域)和羧基端LRR结构域。

在本发明的另一方面，提供了包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端胱天蛋白酶募集结构域(CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质。

在本发明的另一方面，提供了组合物，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的蛋白质，所述分离蛋白质包含NOD结构域、氨基端CARD结构域和羧基端LRR结构域，或基本上由NOD结构域、氨基端CARD结构域和羧基端LRR结构域组成。

在本发明的又一个方面，提供了组合物，特别是药物组合物，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的NOD蛋白、特别是NOD1和/或NOD2、更特别是人NOD1和/或人NOD2。

在本发明的又一个方面，提供了组合物，特别是药物组合物(例如杀细菌药物组合物)，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR蛋白、特别是哺乳动物TLR蛋白、更特别是人TLR蛋白例如人TLR2和/或人TLR4和/或人TLR5。

在另一方面，提供了抗细菌(例如杀细菌)组合物(特别是药物组合物)，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的NOD2蛋白(特别是人NOD2)。

在本发明的另一方面，提供了包含分离蛋白质和可药用载体的药物组合物，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD结构域)和羧基端LRR结构域。

在本发明的另一方面，提供了药物组合物(特别是杀细菌药物组合物)，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的NOD蛋白(例如人NOD1或人NOD2)、特别是分离的人NOD2和可药用载体。

在本发明的另一方面，提供了治疗或预防病原体感染(特别是细菌感染)的方法，所述方法包括提供包含分离蛋白质的组合物，所述分离蛋白质包含(或基本上组成是，或组成是)NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD结构域)和羧基端LRR结构域。

在本发明的另一方面，提供了治疗或预防病原体感染(例如细菌感染)的方法，所述方法包括提供包含分离的NOD蛋白、例如分离的人NOD1和/或人NOD2的组合物。

在本发明的另一方面，提供了治疗或预防人类患者的病原体感染、特别是细菌感染的方法，所述方法包括向所述患者施用(药物组合物，其包括)治疗有效量的分离NOD蛋白、特别是分离人NOD1和/或人NOD2。

在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质在医药、特别是人类医药中的用途。

在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD)和羧基端LRR的分离蛋白质(例如分离人NOD2)在制备用于治疗或预防病原体感染、特别是细菌感染、更特别是革兰氏阳性菌感染的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了包含NOD结构域、氨基端死亡折叠结构域(例如CARD)和羧基端LRR结构域的分离蛋白质在制备用于治疗克罗恩病、炎性肠病、败血病的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了分离NOD蛋白(例如人NOD1或人NOD2)在制备用于治疗克罗恩病、炎性肠病的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了包含蛋白和可药用载体的杀细菌药物组合物，所述蛋白包含(或基本上组成是，或组成是)LRR结构域(例如作为其唯一活性成分)。在一个实施方案中，LRR结构域是人NOD-LRR，例如人NOD1-LRR或人NOD2-LRR。在其它实施方案中，LRR结构域是TLR-LRR结构域例如人TLR-LRR，例如TLR2-LRR、TLR4-LRR、TLR5-LRR、TLR7-LRR、TLR8-LRR、TLR9-LRR。

本发明还包括该蛋白和/或本发明的蛋白杀细菌、特别是革兰氏阳性菌的用途。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗和/或预防非人哺乳动物的病原细菌感染的分离的非人哺乳动物LRR蛋白(例如NOD或TLR蛋白)，其中该LRR蛋白源自该非人哺乳动物。

在本发明的另一方面，提供了鉴定杀细菌蛋白的方法，所述方法包括将细菌、特别是哺乳动物例如人的病理性细菌，与分离的LRR蛋白相接触，如果该蛋白表现出杀细菌活性则鉴定所述蛋白。在一些实施方案中，细菌是需氧的；在其它实施方案中，是厌氧的；在另外的其它实施方案中，细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌。

4.附图简述

图1：结肠上皮中Nod2表达的免疫组织化学测定。图A：大鼠和人结肠的福尔马林固定的石蜡包埋块用亲和纯化的兔抗-Nod2抗体(AB5；左)或作为阴性对照的兔IgG(右)探测。紫色显示DAPI染色。图B：将大鼠结肠直接提取至SDS-PAGE样品缓冲液中，并使用AB5通过蛋白质印迹来分析。鉴定到与Nod2相关的约100kDa的单个蛋白。

图2：在用大肠杆菌孵育SW480肠上皮细胞之后进行Nod2的免疫定位。以10000∶1的MOI，将SW480细胞与或不与大肠杆菌孵育4小时。固定细胞，并用抗-Nod2(绿色)、鬼笔环肽(红色)和DAPI(紫色)染色。与大肠杆菌孵育之后，Nod2从细胞溶胶转移至细胞质中的点状结构。

图3：在肠上皮细胞中大肠杆菌和Nod2的免疫定位。以10000∶1的MOI，用大肠杆菌将Caco2肠上皮细胞的汇合单层孵育2小时。固定细胞，并使用共聚焦显微镜使用抗-Nod2(AB5)和抗-LPS抗体通过免疫荧光来分析。

图4：用重组Nod2 LRR结构域孵育之后大肠杆菌的体外聚集。用20μg/ml BSA或纯化的重组Nod2 LRR结构域将1ml PBS中的大肠杆菌(10⁶)孵育12小时。将培养物的等份试样接种在带盖玻片的载玻片上，并使用63X物镜通过光学显微镜分析。

图5：表达Nod2的293细胞的肺炎链球菌感染。自相同染色体基因座稳定表达氯霉素乙酰转移酶(对照)、Nod2或克罗恩病相关Nod2突变体(Nod2-3020insC)的293细胞用肺炎链球菌(ATCC 49619)感染，10∶1的MOI。将经庆大霉素保护的细菌铺在巧克力琼脂上，观察每个细胞系的胞内细菌数目。

图6：加入金黄色葡萄球菌之前，用200μg/ml所示细菌组分预孵育纯化的Nod2 LRR结构域(Nod2：30μg/ml)。加入BSA作为蛋白对照。使用商品化蛋白聚糖提取物(sPGN：可溶性蛋白聚糖，iPGN：不溶性蛋白聚糖)、脂磷壁酸(LTA：脂磷壁酸粗提取物，upLTA：超纯脂磷壁酸提取物)或加热灭活的金黄色葡萄球菌(HKSA)。对照指示仅BSA存在时细菌的生长。

图7：Nod2 LRR抗细菌靶(大肠杆菌)的纯化。将大肠杆菌(ATCC)在LB肉汤中生长过夜，沉淀，并通过弗氏细胞压碎器(French press)提取细菌沉淀。进行竞争试验，监控相对于金黄色葡萄球菌(ATCC 29233)的Nod2 LRR结构域活性。在每个步骤，将级分的体积补至等体积，将样品加至抗细菌分析试验。最终在去污剂(NP40)不溶性级分中发现抑制性级分。用盐酸胍提取该级分，通过凝胶过滤分离，收集级分，评价Nod2 LRR活性对金黄色葡萄球菌的抑制。级分5(F5)含有抑制LRR活性(通过对蛋白酶K的敏感性确定)的蛋白。

图8：Nod2抗细菌靶的LRR亲和纯化以及质谱法鉴定。图A：图7中用盐酸胍提取的去污剂不溶性大肠杆菌级分进行凝胶过滤而得的级分5，加样到Nod2 LRR结构域亲和柱上。通过NaCl梯度洗脱结合的蛋白。图B：考马斯亮蓝染色的凝胶，显示在Nod2 LRR结构域亲和纯化之前的级分5(F5)以及来自亲和柱的盐洗脱级分(E)。图C：在图B所示的提取条带中的质谱蛋白质鉴定。

图9：来自大肠杆菌的野生型和3020insC LRR结构域亲和纯化的去污剂不溶性蛋白的分离。通过弗氏细胞压碎器分级分离大肠杆菌，离心，用盐酸胍提取沉淀。将溶解的沉淀分成两份，每个级分分别在Nod2LRR(WT)或Nod2 3020insC LRR(3020)亲和柱上分离。用盐洗脱结合在两柱上的蛋白，用冰冷丙酮或TCA/丙酮沉淀，并通过SDS PAGE凝胶电泳分离。选择、切割并处理凝胶的各区域，以用于蛋白的质谱鉴定(如表4、表5所示)。

图10：TLR2和Nalp3 LRR结构域抑制单核细胞增生性李斯特菌生存力(由ATP-偶联的发光分析试验显示)。用渐增浓度的所示重组LRR结构域在37℃孵育单核细胞增生性李斯特菌(5×10⁵个细菌/100μl)6小时，并通过发光分析(BacTiter-Glo：Promega)评价ATP水平。所示的值是相对于在缺少LRR结构域下进行孵育的对照(100％)的值。结果代表TLR2和Nalp3的两个实验。

图11：纯化的Nod2 LRR结构域的杀细菌作用在携带克罗恩病相关Nod2 3020insC突变的蛋白中是缺陷的。所示结果代表若干实验。图A和B：Nod2 LRR结构域影响大肠杆菌(图A)和枯草芽孢杆菌(图B)的膜极性。以所示的浓度将蛋白加入5×10⁵个细菌的100μL生长培养基中，并在37℃孵育2小时。在该过程结束前15分钟，将50μl 10μg/ml DiBAC4溶液加至每个孔中。用750μl冰冷PBS/孔将板洗涤两次。通过流式细胞术测定吸取染料的去极化细菌的百分比。图C：来自一系列模式识别受体的LRR结构域影响枯草芽孢杆菌膜极性。如针对图A和B所描述的，用所示LRR结构域处理细菌，定量其对该细菌的膜极性的影响。图D：通过琼脂扩散分析试验证实，Nod1和Nod2而不是Nod2 3020insC LRR结构域显示抗细菌活性。琼脂板接种所示细菌的菌苔。用无菌玻璃吸管在琼脂中穿出约0.5cm直径孔，将所示蛋白(BSA蛋白对照或所示LRR结构域)或抗生素(氨苄西林或卡那霉素)以在无菌PBS中的0.5mg/ml浓度加至各孔。

图12：Nod2 SNP(全长)抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌和粪肠球菌的生存力(由ATP-偶联的发光分析显示)。该活性在携带克罗恩病相关Nod2 3020insC和G908R突变的蛋白中是缺陷的。

图13：于35℃、37℃和39℃在细菌胁迫的条件下测试了Nod2对金黄色葡萄球菌生存力(通过ATP-偶联的发光分析试验显示)的影响。Nod2的抗细菌活性随细菌胁迫而增加。

图14：渐增浓度的Nod2抑制枯草芽孢杆菌(图A)和金黄色葡萄球菌(图B)的生长。所示的值是相对于在缺少LRR结构域下进行孵育的对照(100％)的值。

图15：NAIP抑制嗜麦芽窄食单孢菌(S.maltophilia)的生长(图A)。Nod1抑制大肠杆菌生长(图B)，单核细胞增生性李斯特菌生长被Nod1、Nod2、Nod2 3020insC和CIAS1抑制(图C)。

图16：Nod2抑制金黄色葡萄球菌的生长。这种抑制不受共施用MDP、LPS或PGN的影响。

5.发明详述

依据本发明，因此提供了用作抗微生物剂的分离蛋白质，其包含多个LRR(富亮氨酸重复序列)结构域。在例如下文所描述的本发明的使用中，已经发现这些蛋白可有效杀死多种细菌且具有与已知抗生素相当的效力。

在本发明优选的实施方案中，有LRR在蛋白的C端。已经发现这可增加该蛋白的抗微生物活性。

进一步优选，每个LRR结构域独立地包含式(I)的氨基酸序列或者基本上由式(I)的氨基酸序列组成：

(F1LxxLxL(xxZ)_YF2) (I)

其中：

F1和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；

x可以是任何氨基酸；

L可以是Leu、Ile、Val或Phe；

Z可以是NxL或CxxL；

N是Asn、Thr、Ser或Cys；

C是Cys或Ser；且

Y＝0或1。

富亮氨酸重复序列(LRR)通常是形成α/β马蹄形褶(horseshoe folds)的蛋白结构基序。每个LRR通常由重复的20-30个氨基酸的段组成，所述氨基酸段异乎寻常地富含亮氨酸残基，尽管这些残基可被其它疏水残基取代。每个重复单元可具有β链-转角-α螺旋结构，以致于由多个此LRR组成的组装区具有马蹄形或弧形，具有内部平行β折叠和外部螺旋阵列(helix array)。β折叠的一面和螺旋阵列的一侧暴露于溶剂，因此，典型地亲水残基占优势。螺旋与折叠之间的区域通常形成疏水核，通常与亮氨酸残基紧密地在空间上压在一起。在本发明的备选实施方案中，其它疏水氨基酸残基例如异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸或半胱氨酸可取代亮氨酸残基。

一般而言，在本发明的蛋白中，所有LRR结构域均形成单个连续结构，采用弧形或马蹄形。弧或马蹄的内部凹面可主要由平行β-链组成，而外部凸面可包括多种二级结构，例如α-螺旋、3₁₀-螺旋、聚脯氨酸II螺旋或β-转角的串联排列。在本发明的实施方案中，凹面上的β-链与凸面的主要螺旋的元件通过短环或β-转角连接。

本发明的蛋白包含足够LRR以具有抗微生物活性，并且本发明的蛋白适宜地包括3至20个LRR结构域。本发明的具体实施方案包含至少3个LRR、至少5个LRR或至少7个LRR。在本发明的其它实施方案中，该蛋白可包含至少4个、至少6个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19或至少20个LRR结构域。

在形成本发明的实施方案的一类蛋白中，存在高比例的亮氨酸残基。因此，每个LRR中至少2个L残基是Leu，或每个LRR中至少3个L残基是Leu。在某些实施方案中，基本上所有的L残基均是Leu。本发明的蛋白进一步优选是水溶性的。

本发明蛋白的一个具体的亚类包含5个或5个以上的LRR(富亮氨酸重复序列)结构域，其用作抗细菌剂，其中该蛋白的C端是LRR结构域，并且每个LRR结构域包含式(I)的氨基酸序列：

(F1LxxLxL(xxZ)_YF2) (I)

其中：

F1和F2独立地是1至30个残基的连续氨基酸序列；

x可以是任何氨基酸；

L可以是Leu、Ile、Val或Phe；

Z可以是NxL或CxxL；

N是Asn、Thr、Ser或Cys；

C是Cys或Ser；且

Y＝0或1。

在蛋白的该亚类中，每个LRR中至少2个L残基优选为Leu。

本文所用的术语“分离的”是指本发明的蛋白和多核苷酸，根据具体情况而定，存在于不同于其天然环境的物理环境中。例如，分离的蛋白或多核苷酸，相对于其天然存在的复杂的细胞环境，可以是基本上分离的(例如纯化的)。然而，应注意到，尽管本发明的蛋白可以在本文中描述成“分离的”，但是这并不意味着该蛋白必须天然存在。

术语“源自”和“源于”指所讨论的蛋白或多核苷酸时，不管其物理起源。因此，举例来说，“源自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串联的)”是指具有如下一级氨基酸序列的LRR，所述一级氨基酸序列与存在于天然含LRR蛋白中的相同但不必纯化自该天然来源。

术语“死亡折叠结构域(death fold domain)”是指一个结构域家族，其特征在于六个紧压在一起的α螺旋，所述α螺旋在程序性细胞死亡(细胞凋亡)中起显著的作用。该家族的成员包括胱天蛋白酶募集结构域(CARD)、热蛋白结构域(PYD)、死亡结构域(DD)和死亡效应子结构域(DED)。对于该家族的更多信息，读者尤其可以参考Lahm A等人(2003)；Cell dead and Differentiation，10，10-12以及其中所引用的参考文献。

术语“LRR”或“LRR基序”及其语法变异是指式(I)的富亮氨酸重复序列基序。

术语“LRR结构域”是指包含(或基本上组成是，或组成是)两个或两个以上(多达约50个)，通常串联的，式(I)LRR的蛋白质结构域。

术语“NOD蛋白”是指含有中央核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)、氨基端CARD结构域和羧基端LRR结构域的蛋白。读者尤其可以参考Inohara N.等人(2005)，Annu.Rev.Biochem 74：355-383的第361页的表I，获得有关人NOD家族成员的细节(不必是毫无遗漏的)。

后缀“-LRR”是指该后缀之前的蛋白质的天然LRR结构域，因此，“NOD-LRR”是指存在于天然NOD家族成员中的LRR结构域。

“LRR蛋白”表示蛋白包含至少一个LRR结构域。

“TLR”是指toll样受体家族。Toll-样受体(TLR)是一类单跨膜非催化性受体，其结构性地识别源自微生物的保守分子。参见Mitchell JA(2007)，J Endocrinol 193(3)；323-30，其全部内容通过引用并入本文并且尤其可以被读者参考。

“蛋白”包括多肽。

“人NOD2”是指SEQ ID NO：1的蛋白。

“人NOD1”是指SEQ ID NO：2的蛋白。

“人NOD2-LRR”是指SEQ ID NO：3的蛋白。

“人NOD1-LRR”是指SEQ ID NO：4的蛋白。

“人CIITA-LRR”是指SEQ ID NO：5的蛋白。

“人TLR2-LRR”是指SEQ ID NO：6的蛋白。

“人Nalp3-LRR”是指SEQ ID NO：7的蛋白。

“抗细菌药物组合物”是指在施用至个体之前尤其具有抗细菌活性的药物组合物。

5.1蛋白质

本发明至少部分基于令人惊讶的发现：含有LRR基序(式(I))的蛋白质具有抗细菌(特别是杀细菌)活性。尽管我们证明了包含LRR结构域和其它结构域(例如NOD家族蛋白质中见到的结构域)的天然蛋白质具有显著的抗细菌活性，但是我们也证明LRR结构域自身具有抗细菌活性。

在一些实施方案中，该分离蛋白质包含2至100个、更特别是2至50个、例如2至45个串联排列的式(I)的LRR基序。

在典型的实施方案中，该LRR基序为15至50个残基长，例如20至30个残基长。因此，在一些实施方案中，该分离蛋白质包含2至100个(例如2至50个)串联排列的式(I)的LRR基序，每个基序由15至50个连续氨基酸残基(例如20至30个残基)组成。

在一些实施方案中，蛋白质是人工的，其具有不存在于自然界中的排列。在这些实施方案中，蛋白质可包含中央核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)、羧基端LRR结构域(包含例如人为数量的LRR结构域，优选串联排列)和氨基端效应子结构域。该效应子结构域例如可以促进杀死(例如通过细胞凋亡)靶细胞，例如病原细菌。该效应子结构域的实例是死亡折叠结构域，例如CARD、热蛋白质、死亡结构域和死亡效应子结构域。

在本发明的其它方面，提供了分离的蛋白质，其包含源自天然蛋白质的LRR结构域。在本发明的这个方面的一些实施方案中，该分离蛋白质是包含LRR结构域的天然蛋白质(本文有时称为“LRR蛋白质”)。该天然LRR蛋白质可以是“RI-样”、“CC”、“细菌的”、“SDS22-样”、“植物特异性”、“典型的”或“TpLRR”，参见Kajava A.V.(1998)，J.Mol.Biol.277，519-527和Ohyanagi T等人(1997)，FASEB J 11：A949，这两篇文献全部内容通过引用并入本文并且尤其可以被读者参考。该天然蛋白质的实例是动物源性蛋白质并且包括NOD家族的成员，特别是人类(或其它灵长类动物)NOD蛋白质(例如人NOD1或人NOD2)。其它成员包括Toll-样受体(TLR)家族并且包括TLR 2，4，5，7，8和9，特别是其人类和其它哺乳动物直系同源物。其它进一步的实例包括成员CIITA和NAIP。

在一些实施方案中，分离蛋白质选自：SEQ ID NO：1、2、3或4。

在本发明的其它方面，提供了分离的LRR结构域，即，由分离的LRR结构域组成的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是分离的LRR结构域。

在本发明的其它方面，提供了分离的LRR蛋白质，条件是该LRR蛋白质不是包含N端富亮氨酸重复序列、一个或多个富亮氨酸重复序列、C端富亮氨酸重复序列以及包含α螺旋的连接肽的分离多肽。

5.2多核苷酸

在本发明的其它方面，提供了编码本发明蛋白质的分离多核苷酸(例如RNA或cDNA)。此多核苷酸可用于制备本发明的分离蛋白质的方法中，例如用于制备包含本发明的分离蛋白质的药物(例如药物组合物)。在其它方面，编码本发明蛋白质的多核苷酸可掺入载体例如质粒、病毒、微型染色体、转座子等中，作为治疗性或预防性免疫原性组合物(例如疫苗、例如DNA疫苗)的一部分，以增加宿主对病原体例如病原细菌的防御。

因此，在本发明的一个方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其编码包含(或基本上组成是，或组成是)式(I)的LRR的蛋白质。

在本发明的另一方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其编码包含LRR结构域的蛋白质。在这个方面的一些实施方案中，提供了编码天然LRR结构域例如NOD LRR结构域、特别是人NOD LRR结构域例如SEQ ID NO：2或3的蛋白质的分离多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供了分离多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其编码LRR蛋白质、特别是动物源性天然LRR蛋白质例如NOD蛋白质、更特别是人类或其它灵长类动物NOD蛋白质。其中的实例包括编码人NOD 1或人NOD2的分离多核苷酸。其它实例包括编码Toll样受体(TLR)例如TLR2，7，8或9和CIITA或NAIP的分离多核苷酸。

5.3制备方法

本发明的某些方面涉及制备本发明的分离蛋白质和蛋白质、特别是第5.1节中提及的那些蛋白质的方法。

本发明的分离蛋白质和蛋白质通常可使用本领域技术人员众所周知的重组细胞培养技术来制备。将编码该蛋白质的多核苷酸分离并插入到复制型载体例如质粒，以用于进一步克隆(扩增)或表达。一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(例如Lonza Biologies公司出售的)，特别在宿主细胞是CHO或NSO时(参见下文)。使用常规操作(例如寡核苷酸探针)可以方便地对编码多核苷酸或蛋白质的多核苷酸进行分离和测序。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型的实施方案。一般来说，此类载体还包括信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，与多核苷酸可操作地连接以便促进表达。

5.3.1信号序列

本发明的蛋白质可被制备成带有异源信号序列的、在成熟蛋白质的N末端具有特异性切割位点的融合蛋白质。该信号序列应为宿主细胞所识别和加工。对于原核宿主细胞，该信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定性肠毒素II的前导序列(leader)。对于酵母分泌，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列，[α]因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列，参见例如WO90/13646。在哺乳动物细胞系统中，病毒分泌性前导序列例如单纯疱疹gD信号和天然免疫球蛋白信号序列是可获得的。通常，该信号序列与编码本发明抗体的DNA在阅读框内连接。

5.3.2复制起点

复制起点是本领域众所周知的，其中pBR322适于大多数革兰氏阴性菌、2μ质粒适于大多数酵母、各种病毒起点，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV适于大多数哺乳动物细胞。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分，但是SV40包含早期启动子，所以可以被使用。

5.3.3选择标记

典型的选择基因编码这样的蛋白质，其：(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄西林、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，或(b)弥补营养缺陷或提供复合培养基中没有的营养素。选择方案可包括停滞宿主细胞的生长。已用编码本发明的治疗性抗体的基因成功地转化的细胞，由于例如选择标记所赋予的药物抗性而存活。另一个实例是所谓的DHFR选择标记，其中在存在氨甲蝶呤下培养转化体。在典型的实施方案中，在存在渐增量的氨甲蝶呤下培养细胞以扩增感兴趣的外源基因的拷贝数。CHO细胞是对于DHFR选择特别有用的细胞系。其它的实例是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologies)。适用于酵母的选择基因是trp1基因，参见Stinchcomb等人Nature 282，38，1979。

5.3.4启动子

用于表达本发明蛋白质和多核苷酸的适宜启动子与编码该抗体的DNA/多核苷酸可操作地连接。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子，例如Tac。适用于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。可诱导的酵母启动子包括醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶。

用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早期基因启动子)、反转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猿猴病毒40。当然，启动子的选择是基于与用于表达的宿主细胞的合适相容性。因此，在一个实施方案中，提供了包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码本发明的轻链V区(VL)、KC区的DNA、以及新霉素与氨苄西林抗性选择标记的第一质粒，以及包含RSV或SV40启动子、编码本发明的重链V区(VH)的DNA、编码[γ1]恒定区的DNA、DHFR和氨苄西林抗性标记的第二质粒。

5.3.5增强子元件

在合适的情况下(例如用于在高等真核生物中表达时)，可以使用在载体中与启动子元件可操作地连接的增强子元件。合适的哺乳动物增强子序列包括来自珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子(在bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠lgG2a基因座(参见WO04/009823)。增强子优选在载体上位于启动子上游。

5.3.6宿主细胞

对于编码本发明分离蛋白质的克隆或表达载体，合适的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Slmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(参见DD 266 710)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。酵母宿主细胞中，还可以考虑酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母(yarrowia)(EP402,226)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)(EP183,070，还参见Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185-192)、假丝酵母(Candida)、里氏木霉(Thchoderma reesia)(EP244,234)、青霉(Penicillin)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

本发明的宿主细胞可以是高等真核细胞。合适的高等真核宿主细胞包括哺乳动物细胞例如COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1、ATCC NO：CCL 61)、DHFR-CHO细胞系例如DG44(参见Urlaub等人(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))，特别是那些适应于悬浮培养的CHO细胞系、小鼠塞尔托利细胞(Sertoli cell)、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞例如NSO(参见US 5,807,715)、Sp2/0，YO。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码分离蛋白质的载体，所述分离蛋白质包含两个或两个以上的式(I)的LRR、LRR结构域或LRR蛋白质。

5.3.7细菌发酵

细菌系统可以用于制备本发明的蛋白质。通常，它们被制备成不溶性周质蛋白质，其可根据本领域技术人员已知方法被提取和再折叠以形成活性蛋白质，参见Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cupit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol，29，273-277。

5.3.8细胞培养方法

可以通过本领域技术人员已知的任何方法，培养用编码本发明的蛋白质或其抗原结合片段的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以在转瓶、滚瓶或中空纤维系统中培养，但是对于大规模生产，优选使用搅拌釜反应器，特别是用于悬浮培养。优选，使用例如喷头(sparger)、挡板或低剪切涡轮使搅拌釜适应于通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可以用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，优选该培养基补充有细胞保护剂(例如pluronic F-68)，以帮助避免由通气操作造成的细胞损伤。根据宿主细胞的特点，对于贴壁依赖性细胞系，使用微载体作为生长基底，或可以对细胞进行悬浮培养(典型的情况)适应化。宿主细胞、特别是无脊椎动物宿主细胞的培养可以使用多种操作模式例如补料-分批、重复的分批工艺(参见Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103-109)、延长的分批工艺或灌流培养。虽然可以在含有血清例如胎牛血清(FCS)的培养基中培养重组转化的哺乳动物宿主细胞，但是，优选地在合成的无血清培养基(例如在Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163中公开的培养基)或市售可得的培养基例如ProCHO-CDM或UltraCHO(TM)(Cambrex NJ，USA)中培养此类宿主细胞，如果需要，可以在培养基中补充能源例如葡萄糖和合成的生长因子例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能要求对那些细胞进行在无血清条件下生长的适应化。一种适应化方法是在含有血清的培养基中培养此宿主细胞，然后反复地将80％的培养基换成无血清培养基，以使宿主细胞学习适应无血清条件(参见例如Scharfenberg K等人(1995)动物细胞技术：面向21世纪的发展(Animal Cell technology：Developments towards the 21st century)(Beuvery E.G.等人编辑)，第19-623页，KluwerAcademic publishers)。

可以使用多种技术回收和纯化分泌到培养基中的本发明蛋白质，从而提供适合于所需用途的纯化程度。例如，本发明的治疗性蛋白质用于治疗人类患者的用途通常要求至少95％纯度、更常见地要求98％或99％或更高的纯度(与粗培养基相比)。首先，通常利用离心去除培养基中的细胞碎片，随后使用例如微滤、超滤和/或深层过滤进行上清液的澄清化步骤。还可以使用多种其它技术，例如透析和凝胶电泳和层析技术，例如羟基磷灰石(HA)层析、亲和层析(任选地涉及亲和标签体系如多组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC，参见US 5,429,746)。通常，还可以使用各种去除病毒的步骤(例如，纳米过滤，使用例如DV-20滤器进行)。经过各种这些步骤，可以提供纯化制品，其包含至少35mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)的本发明的分离蛋白质，从而构成本发明的一个实施方案。适宜地，此类制品基本上不含聚集形式的本发明的蛋白质。

5.4.药物组合物

在某些实施方案中，将本发明的分离蛋白质和多核苷酸掺入药物组合物中，以用于治疗和/或预防病原细菌感染。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗和/或预防对人具有致病性的细菌的感染。在其它实施方案中，药物组合物用于治疗和/或预防对非人动物具有致病性的细菌的感染，例如兽医用。用于治疗和/或预防特定病原细菌感染的实施方案在下面更详细地描述。读者可以想到：第3节、第5.1节和第5.2节中描述的每种和所有蛋白质或多核苷酸方面或实施方案旨在单独地且具体地在此处考虑并入药物组合物中。

通常地，本发明的药物组合物包含(或基本上组成是)治疗有效量的(例如以单位剂量的形式)的本发明分离蛋白质和公认的药学实践所已知且要求的可药用载体。用于药学用途的蛋白质制剂是熟知的，读者尤其可以参考Hovgaard L(2000)“肽和蛋白质的药学制剂发展(Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins)”，CRC Press，ISBN：0748407456；Nail S.等人(2002)“蛋白质制剂的发展和制造(Development and manufacture of protein pharmaceuticals)”，Springer，ISBN：0306467453；McNally E.J.(1999)“蛋白质配制与递送(protein formulation and delivery)(Drugs & the Pharmaceutical Sciences)，Marcel Dekker Ltd，ISBN：0824778839。还参见Oslo等人编辑的雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，1980，Mack Publishing Co.，所述公开物由此通过引用并入本文。可以根据希望治疗的根本性疾病或状态，使本发明的药物组合物适用于通过任何便利或必需的途径施用。因此在一些实施方案中，提供了可静脉内施用的药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的蛋白质。在其它实施方案中，提供了适用于皮下施用治疗有效量的本发明蛋白质的药物组合物。

通过将具有所需的纯化程度的本发明蛋白质与药理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以将本发明的蛋白质制备用于贮存或施用。此类材料在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。如果本发明的蛋白质是水溶性的，那么它可在缓冲液(优选pH为约7至8)例如磷酸盐或其它有机酸盐中配制。如果蛋白质在水中仅部分可溶，那么可以通过用0.04-0.05％(w/v)量的非离子表面活性剂例如Tween、Pluronics或PEG(例如Tween 80)对蛋白质进行配制，将其制备成微乳，从而增加蛋白质的溶解度。

任选地，可以加入其它成分，例如抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精类；螯合剂例如EDTA；和糖醇例如甘露醇或山梨醇。

用于治疗施用的本发明蛋白质必须是无菌的。可以通过过滤穿过无菌滤膜(例如0.2微米膜)容易地实现无菌。本发明的蛋白质通常以冻干形式，或者如果它具有高度的热和氧化变性稳定性，以水溶液形式贮存。本发明的蛋白质制品的pH通常为约6至8，尽管在某些情况中较高或较低的pH值也可以是合适的。应理解，使用某些前述赋形剂、载体或稳定剂将会导致本发明蛋白质的盐的形成。

如果胃肠外使用本发明的蛋白质，则可以将含有本发明蛋白质的治疗性组合物置于具有无菌取用孔的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的静脉溶液袋或小瓶。

一般来说，当疾病/病症允许时，技术人员应该对本发明的蛋白质进行配制并确定剂量以用于位点特异性递送。这在创伤和溃疡的情况下是方便的。例如，本发明的蛋白质可以掺入凝胶(例如水凝胶)中并施用至创伤或溃疡床。

还可制备持续释放制剂，包括微囊颗粒和可植入品的形成。对于制备持续释放组合物，优选将本发明的蛋白质掺入可生物降解的基质或微囊中。适用于此意图的材料是聚乳酸，尽管可以使用聚-(a-羟基羧酸)的其它聚合物，例如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988A)。其它可生物降解的聚合物包括聚(内酯)类、聚(缩醛)类、聚(原酸酯)类或聚(原碳酸酯)类。这里最初的考虑必须是：载体本身或其降解产物在靶组织中是无毒的，并且不会进一步加重病状。这可通过在靶紊乱的动物模型中，或如果此类模型是得不到的，在正常动物中的常规筛选来确定。很多科学出版物记载此类动物模型。

对于持续释放组合物的实例，参见U.S.专利号3,773,919、EP 58,481A、U.S.专利号3,887,699、EP 158,277A、加拿大专利号1176565、U.Sidman等人，Biopolymers 22，547[1983]和R.Langer等人，Chem.Tech.12，98[1982]。

当局部应用时，本发明的蛋白质适于与其它成分例如载体和/或助剂组合。对此类其它成分的性质没有限定，除了它们必须是可药用的并且对于其预期的施用是有效的，并且不会降低该组合物的活性成分的活性。合适赋形剂的实例包括含有或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或悬液。还可将该组合物充入透皮贴片、硬膏剂和绷带中，优选以液体或半液体形式。

为了获得凝胶制剂，可将配制于液体组合物中的本发明蛋白质与有效量的水溶性多糖或合成聚合物例如聚乙二醇混合，以形成可局部应用的适宜粘度的凝胶。可以使用的多糖包括例如纤维素衍生物，例如醚化纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素和烷基羟烷基纤维素，例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉(fractionated starch)；琼脂；海藻酸和藻酸盐；阿拉伯胶；普鲁兰多糖(pullullan)；琼脂糖；角叉菜胶；右旋糖酐类；糊精类；果聚糖类；菊粉；甘露聚糖类；木聚糖类；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖类；和合成生物聚合物；以及胶类例如黄原胶；瓜尔胶；刺槐豆胶(locust bean gum)；阿拉伯胶；西黄蓍胶；和刺梧桐树胶；及其衍生物和混合物。本文优选的胶凝剂对生物系统惰性、无毒、易于制备且不太松软或粘稠，并且不会使包含于其中的本发明蛋白质不稳定。

优选，多糖是醚化纤维素衍生物，更优选是成分明确的、纯化的并记载于USP中的多糖，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。本文最优选的是甲基纤维素。

用于胶凝的聚乙二醇通常是为获得适宜粘度的低分子量和高分子量聚乙二醇的混合物。例如，当分子量为400-600的聚乙二醇和分子量为1500的聚乙二醇的混合物以适宜比率混合而获得糊剂时，该混合物对此目的是有效的。

用于多糖和聚乙二醇的术语“水溶性的”意指包括胶体溶液和分散液。通常地，纤维素衍生物的溶解度由醚基的取代程度决定，并且本文有用的稳定衍生物应在纤维素链中具有足够量的此类醚基/脱水葡萄糖单元以使衍生物具有水溶性。至少0.35醚基/脱水葡萄糖单元的醚取代程度通常是足够的。此外，该纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例如Li盐、Na盐、K盐或Cs盐。

如果在凝胶中使用甲基纤维素，则优选它包含约2-5％、更优选约3％的凝胶，本发明的蛋白质以约300-1000mg/ml凝胶的量存在。

所使用的剂量取决于上述的各因素。作为一般的建议，配制本发明的蛋白质，并以能在组织中建立有效但并未过分有毒的大于约0.1ng/cc(最高至最大剂量)的水平的剂量递送至靶点或组织。如果可能的话，通过连续输注、持续释放、局部应用或以凭经验而定的频率注射，应保持这种组织内浓度。

特别适合于此本发明实践中所用的本发明蛋白质的临床施用的组合物包括，例如无菌水溶液或无菌可水合粉末例如冻干蛋白质。通常期望在制剂中还包括适宜量(一般以足以使制剂等渗的量)的可药用盐。通常也包括足够量的pH调节剂例如精氨酸碱和磷酸以维持适宜的pH，一般为5.5至7.5。而且，为了提高含水制剂的货架期或稳定性，还可期望包括其它试剂，例如甘油。照这样，使制剂适于胃肠外施用，特别是静脉内施用。

本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可随所展望的特定用途而变化，并且在主治医师/健康护理专业人士的视野内。

因此，在某些实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含分离的NOD蛋白质，特别是分离的人NOD蛋白质，例如人NOD1或人NOD2(例如作为其唯一活性成分)。

在其它实施方案中，提供了药物组合物、特别是抗细菌药物组合物的制备方法，所述方法包括提供分离NOD蛋白质，特别是分离人NOD蛋白质，例如人NOD1和/或人NOD2。

因此，在一些其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含分离NOD-LRR结构域，特别是分离人NOD-LRR结构域，例如人NOD1-LRR或人NOD2-LRR(例如作为其唯一活性成分)。

因此，在一些其它实施方案中，提供了包含蛋白质作为其唯一活性成分的药物组合物(例如抗细菌如杀细菌药物组合物)，所述蛋白质由分离的LRR结构域例如分离的NOD-LRR结构域，特别是分离人NOD-LRR结构域例如人NOD1-LRR或人NOD2-LRR(例如作为其唯一活性成分)，或分离的人TLR-LRR结构域例如TLR2-LRR、TLR4-LRR，TLR5-LRR、TLR9-LRR组成。

在其它实施方案中，提供了药物组合物、特别是抗细菌药物组合物的制备方法，所述方法包括提供分离LRR蛋白质例如分离人LRR蛋白质，例如分离NOD-LRR结构域，特别是分离人NOD-LRR结构域例如人NOD1-LRR和/或人NOD2-LRR。

在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR蛋白质，例如分离的哺乳动物TLR蛋白质，例如人TLR 4，5。

在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物，其包含(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR-LRR，例如分离的哺乳动物TLR-LRR，例如人TLR4-LRR、人TLR5-LRR、人TLR2-LRR。

在其它实施方案中，提供了抗细菌(例如杀细菌)药物组合物的制备方法，所述方法包括提供(例如作为其唯一活性成分)分离的TLR-LRR，例如分离的哺乳动物TLR-LRR，例如人TLR4-LRR、人TLR5-LRR或人TLR2-LRR。

5.4.1其它组合物和物品

在一些实施方案中，有效量的本发明分离蛋白质(例如上文第3节和5.1中详述)被掺入用于对有需要的表面或物品进行消毒的消毒剂组合物，例如含水消毒剂组合物中。读者可以想到：第3节和第5.1节中所述的所有方面或实施方案可以单独且明确地被考虑用于本节中。此类表面的实例包括通常见于临床环境的那些表面，例如医院病房、手术表面等，以及希望减少与病原细菌接触的其它表面。本发明的消毒剂组合物还可以用于对物品例如医疗物品(例如导管或手术器械)进行消毒，任选与其它良好临床实践中所已知且所要求的灭菌技术联合。本发明的蛋白质还可用于对被病原细菌污染的水进行消毒，本发明包括对被细菌、特别是对人和/或其它哺乳动物有致病性的细菌，污染的水进行消毒的方法，所述方法包含将所述污染水与本发明的蛋白质混合。

在其它实施方案中，还提供了包含(或基本上组成是)本发明蛋白质的创伤和/或手术敷料。

5.5病原细菌

在本发明的某些实施方案中，组合物例如药物组合物可用于治疗和/或预防病原细菌的感染。如前所述，细菌可以对人和/或其它哺乳动物具有致病性。在一些实施方案中，该病原细菌是革兰氏阳性的，在其它实施方案中，该病原细菌是革兰氏阴性的。在其它预期的实施方案中，该病原细菌是对宿主(例如人)具有致病性的厌氧细菌。病原细菌的实例包括：

鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属物种(Actinobacillis spp)、放射菌类(Actinomycetes)、放线菌属(Actinomyces)(例如以色列放线菌(Actinomyces israelii)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、放线菌属物种(Actinomyces spp))、气单胞菌属物种(Aeromonas spp)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas Caviae))、厌氧球菌(Anaerobic Cocci)例如消化链球菌属(Peptostreptococus)、韦荣球菌属(Veillonella)、革兰氏阳性厌氧杆菌(Anaerobic Bacilli)例如动弯杆菌属物种(Mobiluncus spp)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、乳杆菌属(Lactobacillus)、真细菌属(Eubacterium)、双岐杆菌属物种(Bifidobacterium spp)、革兰氏阴性厌氧杆菌例如拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃菌属物种(Prevotella spp)、紫单胞菌属(Porphyromonas spp)、梭杆菌属(Fusobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearthermophilus))、拟杆菌属物种(Bacteroides spp)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、博德特菌属物种(Bordetella spp)(例如百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica))、疏螺旋体属物种(Borrelia spp)(例如回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属物种(Brucella spp)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melintensis)、猪布氏杆菌(Brucella suis)伯霍尔德杆菌属物种(Burkholderia spp)(例如类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia))、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp)(例如弗氏柠檬酸杆菌属(Citrobacter freundii)、多变柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus))、梭菌属物种(Clostridium spp)(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、棒杆菌属物种(Corynebacterium spp)(例如白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)、解脲棒杆菌(Corynebacterium urealyticum))、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、聚团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae))、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli)、尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli))、克雷伯菌属物种(Klebsiella spp)(例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、变形菌属物种(Proteus spp)(例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris))、普罗威登斯菌属物种(Providencia spp)(例如产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii))、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerauis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属物种(Serratia spp)(粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)、液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志贺菌属物种(shigella spp)(例如痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei))、耶尔森菌属物种(Yersinia spp)(例如小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、假结核病耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis))、肠球菌属物种(Enterococcus spp)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium))、Erysipelothrix rhusopathiae、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、嗜血杆菌属物种(Haemophilus spp)(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus dureyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、副溶血性嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus))、螺杆菌属物种(Helicobacter spp)(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、芬纳尔螺杆菌(Helicobacter fennelliae))、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、奴卡菌属物种(Nocardia spp)(例如星状诺卡尔菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)、奈瑟球菌属物种(Neisseria spp)(例如淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Nesseria meningitides))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、特别是抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)和抗万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA))、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus))、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、链球菌属物种(Streptococcus spp)(例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、似马链球菌(Streptococcus equismilis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、咽峡炎链球菌、变形链球菌(Streptococcus mutans)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、米勒链球菌(Streptococcus milleri))、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、密螺旋体属物种(Treponema spp)(例如苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、地方性密螺旋体(Treponema endemicum)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、品他病密螺旋体(Treponema carateum)、弧菌属物种(Vibrio spp)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，包括其致病血清型例如O1和O139)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、最小孤菌(Vibrio minicus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、鸡霍乱弧菌(Vibrio metchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnisii)。

因此，本发明提供了用于治疗和/或预防任何一种上述病原细菌的感染(特别是在人类患者中)的药物组合物(和与其有关的治疗方法)，所述组合物包含(或基本上组成是)第3节和/或第5.1节中所述的任一种蛋白质实施方案。读者可以想到：第3节和第5.1节中所述的蛋白质的所有可能组合都明确且单独地考虑用于治疗和/或预防本节中所述的任一种病原细菌的感染，以及所有这些组合各自形成本发明的独立实施方案。但是特别可以提及的是包含人LRR蛋白质例如人NOD蛋白质(例如人NOD1或人NOD2)或人TLR蛋白质或基本上由其组成的药物组合物，该组合物用于在人中治疗和/或预防正在形成或已经形成对常用药物具有抗性的病原细菌(例如其菌株)例如MRSA和VRSA的感染。

5.6临床疾病

根据本文公开物，对阅读本说明书的本领域技术人员显而易见的是：组合物(特别是药物组合物)可用于治疗和/或预防多种疾病(特别是人类疾病)。因此，可以使用包含和/或基本上组成是上文第3节和第5.1节中的任何蛋白质的药物组合物，治疗和/或预防(特别是在人中)任何一种下述感染性疾病：

炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、食物传播疾病例如食物中毒、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻风病(汉森氏病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、脑膜炎、诺卡菌病、百日咳(Whooping Cough)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、洛基山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、肺结核、兔热病、伤寒、斑疹伤寒、泌尿道感染。

在一些实施方案中，药物组合物可用于治疗和/或预防易感患者例如人(例如在囊性纤维化和/或免疫抑制的人中)的机会性感染。

读者可以想到：上文第3节和第5.1节中所述的蛋白质的所有可能组合均明确且单独地考虑用在治疗和/或预防上文所述的任何一种感染性疾病的组合物例如药物组合物中。

在其它实施方案中，提供了包含如上文第3节和第5.1节中所述的蛋白质的药物组合物在治疗和/或预防细菌可以在其中起病理学作用的疾病中的用途。其实例包括消化性溃疡病和其它胃肠道疾病，例如炎性肠病(IBD)如克罗恩病和溃疡性结肠炎、肠易激综合征(IBS)，以及血液疾病例如败血病。

在其它实施方案中，提供了包含如第3节和第5.1节中所述的蛋白质的药物组合物在治疗炎性疾病或病症中的用途。其实例包括关节炎病症，例如银屑病性关节炎。

6.实施例

通过下文非限定实施例的方式描述本发明。

6.1缩略词列表

缩略词	描述
		CIITA	主要组织相容性复合物II类反式激活因子
GuHCl	盐酸胍
		LRR	富亮氨酸重复序列
MDP	胞壁酰二肽

MIC	最小抑制浓度
		Naip	神经元细胞凋亡抑制蛋白质
Nalp3	含Nacht结构域、富亮氨酸重复序列和PYD的蛋白质3
		NFkB	活化B细胞核因子κ-轻链增强物
Nod1	核苷酸寡聚化结构域1
		Nod2	核苷酸寡聚化结构域2
PFA	多聚甲醛
		PRR	模式识别受体
SNP	单核苷酸多态性
		TLR2	Toll-样受体2
3020insC	Nod2的克罗恩病相关SNP

6.2商品化试剂

6.2.1细菌

下列细菌菌株购自ATCC：单核细胞增生性李斯特菌(ATCC 7644)、枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)、粪肠球菌(ATCC 29212)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、肺炎链球菌(ATCC 49619)、大肠杆菌(ATCC 8739)、大肠杆菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC 13076)、嗜麦芽窄食单胞菌(ATCC 17666)、脆弱拟杆菌(ATCC 25285)、具核梭杆菌(ATCC 29148)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)(临床分离物)、迟缓真杆菌(ATCC 43055)、产气荚膜梭菌(ATCC 13124)、艰难梭菌(临床分离物)、多枝梭菌(ATCC 25582)、厌氧消化链球菌(ATCC 49031)、痤疮丙酸杆菌(ATCC 25746)。

6.2.2其它

蛋白质聚糖、脂磷壁酸和热灭活金黄色葡萄球菌均购自Invivogen。罗丹明缀合的鬼笔环肽来自Sigma。

6.2.3质粒

全长NOD2 cDNA通过装配来自外周血淋巴细胞文库的几个PCR产物而获得，并克隆至pENTR/SD/D-Topo载体(Invitrogen)。编码NOD1的cDNA购自Invitrogen(pENTR221-Nod1)。NOD1和NOD2的LRR结构域利用位于该LRR区域侧翼的引物通过PCR产生，对于NOD1：Nod1LRRFwd：5’-caccatgaacaaggatcacttccagttcacc-3’(SEQ ID NO：8)和Nod1LRRrev：5’-tcagaaacagataatccgcttctcatc-3’(SEQ ID NO：9)。对于NOD2 Nod2LRRFwd：5’-caccatgaccatgccagctgcaccgggtgagg-3’(SEQ IDNO：10)和Nod2LRRrev：5’-tcaaagcaagagtctggtgtccctgcagc-3’(SEQ IDNO：11)。为了产生Nod2的克罗恩病相关3020insC突变体，将脱氧胞嘧啶插入在核苷酸位置3020(NM_022162)。所用的所有cDNA的完整性通过DNA测序证实。将编码全长蛋白质或相应LRR结构域的cDNA转移至下列质粒(Invitrogen)中以用于所述应用：在293细胞中表达(pEF5/FRT/V5-Dest)、细菌表达(pDEST17)、杆状病毒装配(pDEST10)。

6.2.4抗体

所用的商品化一级抗体如下：与Alexa-488、-568或-647缀合的羊、兔和小鼠二级抗体来自Molecular Probes(Leiden，The Netherlands)。IR标记的抗兔或小鼠二级抗体来自Rockland Laboratories(West Grove，PA)。使用从大肠杆菌纯化的重组Nod2 LRR结构域作为免疫原、通过Eurogenetec产生兔抗-NOD2抗体。利用重组LRR柱对血清进行亲和纯化。使用表达重组Nod2或Nod1的细胞系通过蛋白质印迹和免疫荧光显微术来测试抗体特异性。

6.3表达Nod2、Nod2 3020insC、Nod1和其相应LRR结构域的293细胞系

根据制造厂商的建议，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将含有编码Nod2、Nod2 3020insC、Nod1、Nod2 LRR、Nod2 3020insC LRR、Nod1LRR的cDNA的表达质粒(pEF5/FRT/V5-DEST)转染至293Flp-In细胞(Invitrogen)中。在200μg/ml潮霉素中选择稳定的细胞系。各蛋白质的表达经定量PCR和蛋白质印迹确认。

6.3.1免疫荧光

对于免疫染色，使肠上皮细胞在玻璃盖玻片上生长，并在3％多聚甲醛(PFA)中固定20分钟。用在PBS中的0.1％Triton X-100将PFA固定的细胞渗化处理5分钟。都在含有0.2％BSA的PBS中进行抗体孵育。用0.5mg/ml Hoechst(Slgma)对细胞核进行染色，并将盖玻片封在pro-gold试剂(Invitrogen)中。在具有标准物镜和滤波器组的Nikon eclipse显微镜上获取图像。用Adobe Photoshop 6对图像进行处理。

6.3.2蛋白质纯化

使用gateway技术通过LR重组将编码NOD1、NOD2和NOD2-3020的LRR结构域的互补DNA序列(见第6.2.3节中所述)转移至pDEST17(Invitrogen)。LRR结构域在大肠杆菌Rossetta(DE3)细胞(Novagen)中过表达，盐酸胍(6M)溶解，以15000×g离心，通过在Ni-NTA和HiLoad 16/60 Superdex 200大小排阻柱上顺序层析进行纯化。通过考马斯亮蓝染色，显现纯化的蛋白质。通过LR重组，将全长NOD2和NOD2-3020 cDNA从pENTR/SD/D-Topo(Invitrogen)转移至pDEST10，然后转化DH5αBac以产生杆粒。遵照来自Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)的方案以获得重组病毒。为了纯化全长NOD2和NOD2-3020insC，感染20个具有Hi5细胞的T-162 Nunc组织培养瓶72小时。刮下细胞，在冷PBS中洗涤。将细胞沉淀再悬浮于25ml的0.5M KCl、50mM tris、10％甘油、5mM巯基乙醇、1mM MgCl2、0.1％Triton X100、10mM咪唑和蛋白酶抑制剂(完全不含EDTA(Roche))(pH 7.0)中，并在冰上孵育15分钟。将悬液超声处理两次达40秒，在40℃以15000×g离心30分钟。将混合物相继地上样至Ni-NTA柱和HiLoad 16/60 Superdex 200大小排阻柱上。通过考马斯亮蓝染色，显现纯化的蛋白质。

6.4抗细菌分析试验

根据定量各培养物中的ATP，使用BacTiter-Glo^TM微生物细胞生存力测定试验(Promega)，测定培养物中存活细菌细胞的数目。以5×10⁵个细胞/ml(具有所示浓度的蛋白质)，接种细菌。在37℃将培养物孵育4小时，然后将BacTiter-Glo试剂直接加至培养基的细菌细胞中，使用Pherastar(BMG scientific)对发光进行定量。所报告的值是按一式两份进行的至少三个独立实验的结果。使用Excel(Microsoft)计算IC50的标准差。使用标准操作，用需氧或厌氧培养物测定最小抑制浓度的值。简要地说，将5×10⁵个细菌接种至含有所示浓度的LRR结构域或抗生素对照的0.1mlMHB肉汤中。将培养物孵育20-24小时，借助于观察镜通过目视检查评价细菌生长。MIC被确定为完全抑制可见的细菌生长的最低药物浓度。

6.4.1庆大霉素保护试验

表达氯霉素转移酶(对照)、Nod2或Nod2 3020insC的稳定293FlpIn(Invitrogen)细胞系在24孔transwell培养板(1×10⁵/孔)(Corning Incorporated，Corning，NY)上培养。在达到汇合后，以10∶1的MOI，加入肺炎链球菌。在37℃孵育1小时后，用汉克斯溶液洗涤细胞，在0.5mg/mL庆大霉素/汉克斯溶液的存在下培养90分钟以杀死任何胞外细菌。然后通过机械破碎获得细胞裂解物，裂解物用0.5ml MHB肉汤稀释，然后将其涂在巧克力琼脂板上。在37℃将板放置过夜，第二天对集落进行计数。

6.4.2Nod2 LRR相关蛋白质的亲和纯化和质谱法蛋白质鉴定

将大肠杆菌(ATCC 3556、ATCC 1655)接种于MHB肉汤中，使细菌生长至饱和。通过离心收集细菌(2800×g)。使用emulsiflex C5裂解细胞，在4℃通过15000×g离心30分钟分离细菌裂解物。回收细菌沉淀，将其再悬浮于Triton X100(1％于PBS中)中，再次以30000×g离心。用盐酸胍(6M)将残余的沉淀溶解，通过凝胶过滤脱盐。通过快速稀释使蛋白质再折叠，并加样至与所示的重组NOD2-LRR或NOD2-LRR-3020insC结构域共价连接的活化NHS柱上。通过盐梯度将亲和纯化的蛋白质从柱中洗脱，通过SDS-PAGE电泳分离，并通过考马斯亮蓝染色分析。从凝胶中切割经鉴定的蛋白质条带，用DTT还原，用碘乙酰胺烷基化，并在37℃用改良的胰蛋白酶消化过夜。用1μl 100％甲酸酸化肽，然后通过LC-ESI-MS/MS分析。使用与LTQ-FT质谱仪(Thermo Electron，Bremen，Germany)连接的Eksigent/PAL HPLC系统(Axel Semrau GmbH，Germany)进行nano-LC-MS实验。将肽混合物直接加载至该分析性PicoFrit柱(New Objective，Woburn，MA)，使用98％相A(0.1％甲酸水溶液)至75％相B(0.1％甲酸，80％乙腈)的梯度以200nl/min在50分钟内从柱中洗脱。以在MS与MS²之间自动转换的数据依赖性获取模式操作仪器。随后，使用内部Mascot服务器(Matrix science Ltd.，London，UK)在大肠杆菌序列文库中搜索原始文件。选择胰蛋白酶作为该酶(允许两个遗漏切割)，进行搜索。选择羧甲基(C)作为固定修饰，氧化(M)作为可变修饰。用±5ppm的肽质量偏差(mass tolerance)和±0.8Da的片段质量偏差，搜索数据。如果至少两个肽被鉴定具有高于20的评分，则接受该鉴定的蛋白质。

6.5结果

多个独立研究已经确定：Nod2的LRR结构域中的特定SNP是克罗恩病发生的易感性因素。对胃肠道中的共生细菌的强烈免疫反应被认作是该疾病的发病机制中的主要因素。进行下列试验来评价Nod2和克罗恩病相关SNP在宿主对细菌的反应中的功能作用。

6.5.1Nod2在结肠中的体内表达

胃肠道中栖息着约10¹³个细菌，其通过上皮细胞单层与其宿主分隔开。使用抗Nod2 LRR结构域的多克隆抗体，评价了Nod2蛋白质的体内表达(图1)。免疫组织化学分析确定，Nod2主要在结肠上皮中表达。强染色主要见于与肠腔共生菌群直接接触的上皮细胞的顶端表面。此外，在上皮细胞下面可以观察到巨噬细胞和单核细胞样细胞的粘膜下染色。

6.5.2响应细菌的Nod2细胞定位

培养的SW480肠上皮细胞中的Nod2

为了研究Nod2在上皮中的功能，用大肠杆菌孵育SW480肠上皮细胞，Nod2在细胞中的位置通过免疫荧光来确定(图2)。在缺少细菌(SW480对照)下，主要在培养细胞的细胞溶胶中发现Nod2。与大肠杆菌孵育之后，可以在细胞中的长约1μm的点状(通常为椭圆形)的结构中观察到Nod2。在这些独特域中的Nod2观察结果提醒了大肠杆菌本身的形状，因此，进行另外的实验以澄清在这些结构中的Nod2的鉴定。用Caco2肠上皮细胞重复实验。该细胞系更为接近地表现出正常上皮层的表型，因为它们具有紧密连接和形成跨上皮电阻(transepithelial resistance)。用大肠杆菌孵育这些细胞导致点状结构中的Nod2鉴定，所述点状结构与使用和细菌共培养后的SW480细胞观察到的结构类似(图3)。用对大肠杆菌LPS(一种革兰氏阴性菌的外膜组分)具有特异性的抗体对这些细胞进行共染色。在LPS与Nod2之间观察到清楚的共定位，表明鉴定到的Nod2-阳性结构为细菌。

培养细胞的细胞质中的细菌的Nod2阳性染色可以是直接的相互作用或者起因于Nod2和细菌在未鉴定的小泡结构中的共定位。为了检验假说--Nod2与大肠杆菌之间的相互作用是直接的，用大肠杆菌对来自Nod2的纯化重组LRR结构域进行孵育(图4)。大肠杆菌在PBS中的对照培养物表现出细菌个体均一地遍布盖玻片(上图，图4)。而用Nod2 LRR结构域孵育之后，大肠杆菌聚集，并且检测时可以观察到碎片。这支持了该假说，即Nod2 LRR结构域可直接与大肠杆菌相互作用。

6.5.3细菌感染

先前研究已经证实Nod2抗细菌感染的保护效应(Hisamatsu T，2003)。上述的数据表明这种保护效应可能是起因于Nod2 LRR结构域与细菌的直接相互作用。为了验证这种假设，构建表达Nod2或Nod2 3020insC LRR结构域的稳定同类细胞系(congenic cell line)，以控制蛋白质表达水平和其它因素。用肺炎链球菌(已知可积极感染培养的293细胞的病原体)接种培养细胞(Opitz B，2004)。然后可以评价庆大霉素保护的胞内细菌(图5)。从感染的对照细胞观察到细菌的菌苔。在表达Nod2 LRR结构域的细胞中该数母急剧减少。在表达克罗恩病相关Nod2 3020insC LRR结构域的细胞中没有观察到抗肺炎链球菌的明显保护作用。这表明Nod2的信号功能对于保护细胞免受感染不是必要的，因为Card和Nacht结构域在这些细胞系中未表达。而且，Nod2 LRR结构域足以保护细胞免受细菌感染。

6.5.4Nod2和LRR结构域体外的抗细菌活性

所示的数据表明Nod2 LRR结构域直接与细菌结合并保护细胞免受感染。由于据报道LRR结构域不具有任何信号传导能力，所以我们对Nod2LRR结构域是抗微生物多肽的假设进行了研究。用渐增浓度的来自Nod2、克罗恩病相关Nod2 3020insC或Nod1的纯化重组LRR结构域，与一组需氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌孵育，通过监控ATP浓度评价细菌生长(表1)。可以证明LRR结构域的抗微生物活性。几种观察结果表明Nod2和Nod1 LRR结构域对某些细菌具有特异性。Nod2 LRR结构域对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌比Nod1 LRR强至少一个数量级。Nod1 LRR结构域显示出对某些革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌(ATCC8739)和肺炎克雷伯菌)比Nod2具有更高的功效。此外，Nod2 LRR结构域对所有敏感细菌(除单核细胞增生性李斯特菌之外)比Nod2 3020insC LRR结构域通常显著更有效。这表明克罗恩病相关SNP缺乏抗微生物活性，并且考虑到目前的知识状况，这表明这是携带该等位基因的患者中克罗恩病的根本病因。

6.5.5需氧菌

表1.通过细菌ATP含量确定的Nod LRR对抗需氧细菌的抗细菌活性(IC50)

＞100表示检测到活性但＜50％抑制。

6.5.6厌氧细菌

胃肠道中的绝大多数细菌是厌氧的。因此，评价了Nod2 LRR结构域对一组革兰氏阳性和革兰氏阴性厌氧菌的抗微生物活性(表2)。环丙沙星是对所有测试菌株有效的广谱抗生素。以重量(μg/ml)为基础，重组Nod2 LRR结构域对所有菌株的活性可与环丙沙星相媲美。重要的是，当考虑两种化合物的分子量时，以摩尔(mmole/ml)为基础，Nod2 LRR结构域对所有测试细菌比环丙沙星强约25-200倍。

表2.Nod2 LRR对厌氧细菌的最小抑制浓度(MIC)：与环丙沙星相比较(μg/ml)

菌株#

NOD2

环丙沙星

脆弱拟杆菌	NB85001	4	8
				具核梭杆菌	NB86006	8	2
中间普雷沃菌	NB88001	4	1
				迟缓真杆菌	NB94001	8	2
产气荚膜梭菌	NB95001	4	2
				艰难梭菌	NB95002	4	8
多枝梭菌	NB95010	4	8
				厌氧消化链球菌	NB97001	2	1
痤疮丙酸杆菌	NB99001	4	1

Nod2 LRR结构域的分子量为～30000da。盐酸环丙沙星的分子量＝386da。

6.5.7其它LRR结构域

Nod2的抗细菌机理

对于Nod2所建议的唯一推定配体是存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的蛋白聚糖外被中的MDP基序。如果这种相互作用是Nod2 LRR抗微生物作用的起始因子，则用含有此基序的细菌组分对该结构域进行预孵育将预期可以抑制该抗细菌活性。使用Nod2 LRR抗金黄色葡萄球菌的活性建立竞争分析试验。用各种金黄色葡萄球菌膜组分对重组LRR结构域或BSA(对照)进行预孵育，之后加至活金黄色葡萄球菌中，如表1所述评价细菌生存力(图6)。含有MDP基序的金黄色葡萄球菌蛋白质聚糖和脂磷壁酸都不抑制Nod2 LRR结构域的抗细菌作用。只有加热灭活的金黄色葡萄球菌能抑制该Nod2 LRR活性。这表示Nod2抗细菌作用的靶点不依赖它们与细菌蛋白聚糖的相互作用，并表明Nod2的信号功能和抗细菌活性具有不同的细菌靶点。

6.5.8Nod2对革兰氏阴性菌外排泵突变体的活性

对Nod2 LRR结构域的抗微生物活性的靶点进行了研究。该活性显示不依赖于与细菌外膜的结合(图6)。因此，使用大肠杆菌、铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌的外排泵突变体，对Nod2、Nod1和Nod2 3020insC LRR结构域的作用机理进行研究(表3)。外排泵突变体通过将胞内分子从周质间隙泵运跨过外膜而使其浓度降低。两种测试的外排突变体细菌(大肠杆菌和流感嗜血杆菌)显示出对Nod2和Nod1的LRR结构域的敏感性显著增加。这两种细菌对Nod2的克罗恩病相关LRR突变体比对野生型也具有更高的抵抗性。这表明LRR结构域的靶点是胞内的，并且对野生型比对克罗恩病相关Nod2更敏感。

表3.Nod LRR结构域对需氧革兰氏阴性菌的最小抑制浓度(MIC)(μg/ml)。

	菌株#	Nod1	Nod2	3020	四环素
						大肠杆菌	NB27004	＞128	＞128	＞128	4
大肠杆菌	NB27005^＊	32	32	＞128	0.5
						铜绿假单胞菌	NB52019	＞128	＞128	＞128	32
铜绿假单胞菌	NB52020^＊	＞128	＞128	＞128	1
						流感嗜血杆菌	NB65027	＞128	＞128	＞128	0.5
流感嗜血杆菌	NB65027-CDS0021^＊	4	4	64	0.5

^＊表示排出泵(TolC：大肠杆菌、流感嗜血杆菌；mexAB/oprM：铜绿假单胞菌)突变体菌株

6.5.9通过质谱法对Nod2抗细菌靶点的鉴定、部分纯化和潜在鉴定

所给的证据表明，Nod2通过其LRR结构域与胞内细菌靶点结合而具有直接抗细菌活性。此外，克罗恩病相关Nod2突变3020insC缺少该抗微生物活性。进行一系列实验以鉴定介导LRR结构域的抗微生物活性的Nod2细菌靶点。通过弗氏细胞压碎器、去污剂和盐酸胍相继地分级分离大肠杆菌，通过竞争分析来评价以发现抑制Nod2 LRR的杀金黄色葡萄球菌作用的级分(图7)。抑制性级分最初发现于大肠杆菌的去污剂不溶性膜级分中，将该级分盐酸胍中溶解，通过凝胶过滤分级分离。来自凝胶过滤的级分5含有抑制Nod2 LRR抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的蛋白质，这由在用蛋白酶K处理该级分之后检测到的活性而证实。将此级分加载在Nod2 LRR亲和柱上，通过NaCl梯度洗脱相关蛋白质(图8)。通过SDS-PAGE对洗脱的蛋白质进行分离，提取条带，并通过质谱法鉴定蛋白质。主要的洗脱条带(图8，B图，条带H1)含有两种外膜蛋白质(膜孔蛋白)OmpF和OmpC。这些蛋白质存在于革兰氏阴性菌的外膜上，并允许肽进入细菌的周间间隙中(参考文献)。这些膜孔蛋白有可能是Nod2 LRR结构域的第一接触点，并允许其穿透进入革兰氏阴性菌的周质间隙中。考虑到LRR结构域对大肠杆菌外排泵突变体的增强功效(表3)，有可能这些膜孔蛋白本身不是靶点，但是通过充当细菌进入点而参与到抗微生物机理中。此外，革兰氏阳性菌通常不表达膜孔蛋白，但是对Nod LRR结构域仍具有敏感性，表明这不是Nod2抗细菌活性的最终靶点。

为了鉴定推定的胞内靶点，用盐酸胍对来自大肠杆菌的整个去污剂不溶级分进行提取，分成两级分，将级分加载在1)Nod2 LRR结构域亲和柱或2)Nod2 LRR 3020insC结构域亲和柱上。在SDS-PAGE后通过质谱法对与两柱结合的蛋白质进行分析(图9)。在带C3和E3(图9所示的条带)中再次鉴定到这些膜孔蛋白。表4列出了在从Nod2 LRR亲和柱洗脱的条带E3和来自Nod2 LRR 3020insC亲和柱的条带F3中鉴定到的所有蛋白质。值得注意的是，特异地在来自WT LRR柱而不是3020insC LRR柱的洗脱物中鉴定到膜孔蛋白(OmpC和OmpF)。这表明克罗恩病突变体可能没有获得进入胞内细菌区室。表5列出了用WT或3020insC亲和柱特异地鉴定到的所有蛋白质。如上所示，证实OmpC和OmpF与WT LRR亲和柱特异相关。还鉴定了其它特异性蛋白质，其中一些蛋白质被证实对正常大肠杆菌生长是必不可少的。因此，已经鉴定到Nod2 LRR抗微生物靶点的几种推定候选物。

表4.质谱法鉴定OmpC和OmpF在来自去污剂不溶性大肠杆菌级分的WT而非3020insC LRR结构域亲和纯化蛋白质中

E3和F3表示图9所示的切割条带。

表5.与WT或3020insC LRR-结构域特异性相关的大肠杆菌蛋白质的质谱法鉴定

从用GuHCl提取的大肠杆菌的1％triton不溶级分中鉴定到蛋白质。所示条带与图3-9中鉴定的那些条带相关。

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