KR20100116612A

KR20100116612A - 항균 조성물

Info

Publication number: KR20100116612A
Application number: KR1020107017977A
Authority: KR
Inventors: 스콧 파킨슨; 로랑-에르베 페레즈
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2008-01-15
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2010-11-01
Also published as: US20100286027A1; AR070177A1; JP2011509966A; EP2242763A1; EA201001138A1; WO2009090168A1; PE20091334A1; BRPI0906517A2; AU2009204842A1; CN102037006A; TW200936155A; CA2711972A1; MX2010007727A; CL2009000065A1

Abstract

항미생물제로서 사용하기 위한 단리된 단백질이 다수의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하고, 이때 각각의 LRR 도메인은 독립적으로 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 I]

[식 중, F1 및 F2는 독립적으로 잔기 1개 내지 30개의 연속 아미노산 서열이고; x는 임의의 아미노산일 수 있고; L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고; Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고; N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고; C는 Cys 또는 Ser이며; Y = 0 또는 1이다].

Description

항균 조성물{ANTI-BACTERIAL COMPOSITIONS}

1. 기술 분야

본 발명은 항균 조성물 및 병원성 세균 감염의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 세균 감염 및 이와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 항균 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 양상, 목적 및 장점이 하기의 설명으로부터 명백할 것이다.

2. 배경기술

장 상피는 창자 내강을 둘러막아서, 숙주가 스스로 합성할 수 없는 원핵생물 대사물을 수확하도록 허용하는 한편 감염으로부터 숙주를 보호한다. 위장관의 미생물무리에 대한 지속적인 노출로 인해, 상피 세포는 또한 다수의 병원체에 대한 주요 진입 지점이다. 숙주의 감염을 방지하기 위해, 상피 세포는 Nod2와 같은 다양한 패턴 인식 수용체 (PRR)를 발현하여, 침범에 대한 1차 방어선을 제공한다. PRR은 선천 면역계의 필수 성분이다. 이는 세균, 난균, 선충, 진균, 바이러스 및 곤충에서 발견되는 보존된 모티프를 인식하고, 침범 미생물에 대해 숙주에서의 즉각적인 정확하고 표적화된 응답을 유발한다. ([Ting JPY and Davis BK, 2005]).

Nod, Nalp 및 식물 R 단백질 패밀리가 포함되는 다수의 PRR의 공통적인 요소는 류신-풍부 반복 (LRR) 도메인이다. 보존된 류신-풍부 반복부가 LRR 도메인의 아이콘적 편자 형상에 대한 구조적인 발판을 제공하는 한편, PRR 플랭킹(flanking) 영역은 공통적인 미생물 모티프의 인식을 부여하는 다양한 폴리펩티드 절편이다 ([Matsushima N. et al., 2005]). LRR 도메인은 식물에서 인간까지의 PRR에서 발견되고, 병원체에 대한 숙주의 저항에 필수적이다. 특정 LRR-함유 단백질의 결실 또는 자발적인 돌연변이는 감염에 대한 숙주의 감수성을 부여한다 ([Dangl JL and Jones JDG, 2001]). 무악류 물고기에서, 개별적인 LRR 펩티드 서열들의 재조합을 기초로 신규 적응 면역계를 개발하기 위한 발판으로서 LRR 도메인이 이용되었다 ([Pancer Z et al., 2004], [Alder MN et al., 2005], [Nagawa F et al., 2007]).

인간에서, 감염성 또는 염증성 기원의 것들이 포함되는 다양한 질환에 대한 감수성과 관련된 다수의 LRR에서의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 유전학 연구에서 확인되었다 ([Matsushima N., et al., 2005)]. Nod2는 아마도 가장 광범위하게 연구된 질환-관련 LRR-함유 단백질이다. 이는 크론병에 대한 감수성을 부여하고, 크론병과의 관련이 수많은 독립적인 연구에서 확증되었다 ([Hugot JP et al., 2001], [Ogura Y et al., 2001], [Hampe J et al., 2007], [Libioulle C et al., 2007], [Raelson JV et al., 2007], [The Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007]). LRR 도메인에서의 Nod2 돌연변이는 크론병에 대한 감수성을 부여하는 한편, Nod2의 인접한 NACHT 도메인에서의 특정 돌연변이는 조기 발병 육아종성 관절염, 포도막염, 및 피부 발진 + 굴지증을 특징으로 하는 희귀성 보통염색체 우성 장애인 블로(Blau) 증후군의 유전적 원인이다 ([Miceli-Richard C et al., 2001]). 이는 Nod2 LRR 도메인에 대한 특이적인 분자적 기능이 장 질환에 대한 감수성을 부여한다는 것을 시사한다.

Nod2에 관한 대부분의 연구는 추정 리간드에 응답한 이의 신호 전달 경로 활성화에 집중되었다. 크론병과 가장 일반적으로 관련된 3개의 Nod2 SNP 모두 MDP (세균 프로테오글리칸 코트의 성분)에 대한 응답이 부족하고, NFkB 전위 및 사이토카인 생산의 결여를 나타낸다 ([Barnich N et al., 2005]). 반면에, 크론병은 상승된 NFkB-의존적 사이토카인 생산을 특징으로 한다. 크론병-관련 Nod2 SNP가 기능 돌연변이의 취득인지 또는 상실인지 여부에 관한 논쟁이 진행 중이다 ([Watanabe T et al., 2004], [Kobayashi KS et al., 2005], [Maeda S, 2005]).

세균에 의한 감염에 대해 숙주를 보호하는 것에서의 Nod2의 역할이 Nod2 녹아웃(knockout) 마우스 품종을 사용하는 연구에서 또한 강조되었다 ([Kobayashi KS et al., 2005]). Nod2 녹아웃 마우스는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에 의한 경구 감염 (전신 감염은 아님)에 대해 더욱 감수성이었다. 크론병 환자는 세포내 및 상피-관련 세균에서의 실질적인 증가를 나타내는 것으로 보고되었기 때문에, 이는 중요한 관찰이다 ([Swidsinski A et al., 2002], [Darfeuille-Michaud A, 2002], [Liu Y et al., 1995]). 일부 보고에서는, 세포의 세균 감염을 방지하는 것에서의 Nod2의 역할이 제안되었다 ([Hisamatsu T et al., 2003]). 이러한 연구들은 세포내 세균에 대한 방어 인자로서 기능하는 크론병-관련 Nod2 3020insC 단백질의 결핍을 가리켰다. 동일한 군에 의한 추적 연구는 살모넬라(Salmonella) 감염에 대한 Nod2-의존적 보호를 위한 미토콘드리아 단백질 grim19에 대한 의존성을 가리켰다 ([Barnich N et al., 2005]). Nod 패밀리의 또다른 구성원 (Nod1)이 세포내 세균에 대한 보호적 기능을 또한 나타냈다 ([Zilbauer M et al., 2007], [Travassos LH et al., 2005]). Nod2와 대조적으로, Nod1은 grim19와 회합하지 않고 ([Barnich N et al., 2005]), 이는 Nod 단백질이 세균에 의한 감염을 방지하는 메커니즘이 여전히 결정되지 않았음을 시사한다.

본 명세서에 개시된 모든 참고문헌은, 본 출원이 우선권으로 청구하는 모든 명세서를 포함하여, 거명에 의해 본원에 명확하게, 그리고 전체적으로 포함된다.

3. 발명의 개요

본 발명은, 적어도 부분적으로, 류신 풍부 반복 (LRR) 모티프를 함유하는 단백질에 직접적인 항균 활성이 있다는 발견을 기초로 한다.

본 발명의 한 양상에서, 화학식 I의 LRR을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는, 또는 이것으로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다:

[화학식 I]

[식 중,

F1 및 F2는 독립적으로 잔기 1개 내지 30개의 연속 아미노산 서열이고;

x는 임의의 아미노산일 수 있고;

L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;

Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;

N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;

C는 Cys 또는 Ser이다].

본 발명의 또다른 양상에서, 일렬로 2개 이상 (예를 들어, 2개 내지 50개 사이)의 화학식 I의 LRR을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 천연 발생 LRR 함유 단백질로부터 유래된 2개 이상 (예를 들어, 2개 내지 50개 사이)의 화학식 I의 LRR (예를 들어, 일렬)을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 뉴클레오티드 결합 부위 (NBS)-LRR, 예컨대 NOD-LRR (예를 들어, NOD2-LRR 또는 NOD1-LRR, 특히 인간 NOD2-LRR 또는 인간 NOD1-LRR)을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는, 또는 이것으로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다. 또다른 양상에서, CIITA-LRR, Toll 수용체-LRR (예컨대 TLR2,4,5,7,8,9-LRR 도메인), NAIP-LRR을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는, 또는 이것으로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다.

본 발명의 한 양상에서, 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 (NOD), 아미노 말단 이펙터 도메인 및 카르복실 말단 류신 풍부 반복 (LRR) 도메인을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드(fold) 도메인 (예컨대 CARD, 피린(Pyrin), 사망 도메인 또는 사망 이펙터 도메인) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질을 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 조성물 (특히 항균 활성이 있는 제약 조성물)이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 카스페이스 동원 도메인 (CARD) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 CARD 도메인 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하거나 이들로 본질적으로 구성되는 단리된 단백질을 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단리된 NOD 단백질, 특히 NOD1 및/또는 NOD2, 더욱 특히 인간 NOD1 및/또는 인간 NOD2를 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 조성물, 특히 제약 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단리된 TLR 단백질, 특히 포유류 TLR 단백질, 더욱 특히 인간 TLR 단백질 예컨대 인간 TLR2 및/또는 인간 TLR4 및/또는 인간 TLR5를 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 조성물, 특히 제약 조성물 (예컨대 살균 제약 조성물)이 제공된다.

또다른 양상에서, 단리된 NOD2 단백질 (특히 인간 NOD2)을 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 항균 (예를 들어 살균) 조성물 (특히 제약 조성물)이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드 도메인 (예컨대 CARD 도메인) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, (예를 들어 조성물의 단독 활성 성분으로서의) 단리된 NOD 단백질 (예컨대 인간 NOD1 또는 인간 NOD2), 특히 단리된 인간 NOD2 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물 (특히 살균 제약 조성물)이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드 도메인 (예컨대 CARD 도메인) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단리된 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 병원체 감염 (특히 세균 감염)을 치료 또는 예방하는/하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단리된 NOD 단백질, 예컨대 단리된 인간 NOD1 및/또는 인간 NOD2를 포함하는 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 병원체 감염 (특히 세균 감염)을 치료 또는 예방하는/하기 위한 방법이 제공된다..

본 발명의 또다른 양상에서, 치료적 유효량의 단리된 NOD 단백질, 특히 단리된 인간 NOD1 및/또는 인간 NOD2 (이를 포함하는 제약 조성물)를 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 병원체 감염, 특히 세균 감염을 치료 또는 예방하는/하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드 도메인 (예컨대 CARD) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 단리된 단백질의 의약, 특히 인간 의약에서의 용도가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드 도메인 (예컨대 CARD) 및 카르복실 말단 LRR을 포함하는 단리된 단백질 (예컨대 단리된 인간 NOD2)의 병원체 감염, 특히 세균 감염, 더욱 특히 그람(gram) 양성 세균 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제작에서의 용도가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, NOD 도메인, 아미노 말단 사망 폴드 도메인 (예컨대 CARD) 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 포함하는 단리된 단백질의 크론병, 염증성 장 질환, 패혈증의 치료를 위한 약제의 제작에서의 용도가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단리된 NOD 단백질 (예컨대 인간 NOD1 또는 인간 NOD2)의 크론병, 염증성 장 질환의 치료를 위한 약제의 제작에서의 용도가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 제약상 허용되는 담체와 함께 LRR 도메인을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는, 또는 이것으로 구성되는) 단백질을 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 살균 제약 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, LRR 도메인은 인간 NOD-LRR 예컨대 인간 NOD1-LRR 또는 인간 NOD2-LRR이다. 또다른 실시양태에서, LRR 도메인은 TLR-LRR 도메인 예컨대 인간 TLR-LRR, 예를 들어 TLR2-LRR, TLR4-LRR, TLR5-LRR, TLR7-LRR, TLR8-LRR, TLR9-LRR이다.

세균, 특히 그람 양성 세균을 살균하기 위한 본 발명의 단백질 및/또는 단백질의 용도가 또한 구현된다.

또다른 실시양태에서, LRR 단백질이 유래된 비-인간 포유동물에서 병원성 세균 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 단리된 비-인간 포유류 LRR 단백질 (예컨대 NOD 또는 TLR 단백질)이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 세균, 특히 포유동물 예컨대 인간에게 병리학적인 세균을 단리된 LRR 단백질과 접촉시키는 단계 및 단백질이 살균 활성을 나타내는 경우 살균 단백질이 확인되는 단계를 포함하는, 살균 단백질을 확인하는/하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는 세균이 호기성이고, 또다른 실시양태에서는 혐기성이며, 추가적인 또다른 실시양태에서는 세균이 그람 양성 또는 그람 음성이다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1: 결장 상피에서의 Nod2 발현의 면역조직화학적 측정. 패널 a: 래트 및 및 인간 결장의 포르말린으로 고정되고 파라핀에 매립된 절편에 친화력-정제된 토끼 항-Nod2 항체 (AB5; 왼쪽) 또는 음성 대조군으로서의 토끼 IgG (오른쪽)를 프로빙(probing)하였다. DAPI 염색이 자주색으로 지시된다. 패널 b: 래트 결장을 SDS-PAGE 샘플 완충제 내로 직접 추출하고, AB5를 사용하여 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 분석하였다. Nod2와 상관되는 약 100 kDa의 단일 단백질이 확인되었다.
도 2: SW480 장 상피 세포를 대장균과 함께 인큐베이션한 후의 Nod2의 면역국소화(Immunolocalization). SW480 세포를 MOI 10000:1의 대장균과 함께 또는 대장균 없이 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 항-Nod2 (녹색), 팔로이딘 (적색) 및 DAPI (자주색)로 염색하였다. 대장균과의 인큐베이션 후 Nod2가 사이토솔에서 세포질 내의 반점 구조물로 이동하였다.
도 3: 장 상피 세포에서의 Nod2와 대장균의 면역국소화. Caco2 장 상피 세포의 전면성장 단층을 MOI 10000:1의 대장균과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 공초점 현미경을 사용하여 항-Nod2 (AB5) 및 항-LPS 항체로의 면역형광에 의해 분석하였다.
도 4: 재조합 Nod2 LRR 도메인과의 인큐베이션 후 시험관 내에서의 대장균의 응집. 1 ㎖의 PBS 내의 대장균 (10⁶개)을 20 ㎍/㎖ BSA 또는 정제된 재조합 Nod2 LRR 도메인과 함께 12시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물의 분취량을 커버슬립 슬라이드 상에 접종하고, 63× 대물렌즈를 사용하여 광 현미경에 의해 분석하였다.
도 5: Nod2-발현 293 세포의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 감염. 동일한 염색체 유전자좌로부터 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이스 (대조군), Nod2 또는 크론병-관련 Nod2 돌연변이체 (Nod2-3020 insC)를 안정적으로 발현하는 293 세포를 MOI 10:1로 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (ATCC 49619)로 감염시켰다. 젠타마이신-보호 세균을 초콜릿 한천 상에 플레이팅하여, 각각의 세포주 내의 세포내 세균의 개수를 관찰하였다.
도 6: 정제된 Nod2 LRR 도메인 (Nod2: 30 ㎍/㎖)을 200 ㎍/㎖의 지시된 세균 성분과 함께 예비 인큐베이션한 후, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 첨가하였다. BSA가 단백질 대조군으로서 첨가되었다. 시판되는 프로테오글리칸 추출물 (sPGN: 가용성 프로테오글리칸, iPGN: 불용성 프로테오글리칸), 리포테이코산 (LTA: 미정제 리포테이코산 추출물, upLTA: 초고순도 리포테이코산 추출물), 또는 가열 살균(heat-killed) 스타필로코쿠스 아우레우스 (HKSA)가 사용되었다. 대조군은 오직 BSA의 존재 하에서의 세균 성장을 가리킨다.
도 7: Nod2 LRR 항균 표적 (대장균)의 정제. 대장균 (ATCC)을 하룻밤 동안 LB 브로쓰(broth)에서 성장시키고, 펠렛으로 만들고, 세균 펠렛을 프렌치 프레스에 의해 추출하였다. 경쟁 분석법을 수행하여, 스타필로코쿠스 아우레우스 (ATCC 29233)에 대한 Nod2 LRR 도메인 활성을 모니터링하였다. 각각의 단계에서, 분획 부피를 동일한 부피로 만들고, 샘플을 항균 분석법에 첨가하였다. 세제 (NP40)-불용성 분획에서 최종적으로 억제 분획이 발견되었다. 이러한 분획을 구아니디늄 HCl로 추출하고, 젤 여과로 분리하고, 개별적인 분획들을 수집하고, 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 Nod2 LRR 활성의 억제에 대해 평가하였다. 분획 5 (F5)가 프로티네이스 K에 대한 감수성에 의해 결정된 바와 같이 LRR 활성을 억제한 단백질(들)을 함유하였다.
도 8: Nod2 항균 표적의 LRR 친화성 정제 및 질량 분광법에 의한 확인. 패널 a: 도 2의 구아니디늄 HCl로 추출된 세제-불용성 대장균 분획의 젤 여과로부터의 분획 5를 Nod2 LRR 도메인 친화력 칼럼 상에 로딩하였다. 결합된 단백질이 NaCl 구배에 의해 용출되었다. 패널 b: Nod2 LRR 도메인 친화성 정제 전의 분획 5 (F5) 및 친화력 칼럼으로부터의 염-용출 분획 (E)의 쿠마시(Coomassie)-염색 젤. 패널 c: 패널 b에 지시된 바와 같은 추출된 밴드들에서의 질량 분광계 단백질 확인.
도 9: 대장균으로부터의 야생형 및 3020insC LRR 도메인 친화력에 의해 정제된 세제-불용성 단백질의 분리. 대장균을 프렌치 프레스에 의해 분획화하고, 원심분리하고, 펠렛을 구아니디늄 HCl로 추출하였다. 가용화된 펠렛을 2개로 나누고, 각각의 분획을 Nod2 LRR (WT) 또는 Nod2 3020insC LRR (3020) 친화력 칼럼 상에서 분리하였다. 어느 한쪽 칼럼 상에 회합된 단백질을 염으로 용출하고, 저온 아세톤 또는 TCA/아세톤으로 침전시키고, SDS PAGE 젤 전기영동에 의해 분리하였다. 젤의 개별적인 영역들을 선택하고, 절단하고, 단백질의 질량 분광계 확인을 위해 프로세싱하였다 (표 4, 표 5에 지시된 바와 같음).
도 10: TLR2 및 Nalp3 LRR 도메인이 ATP-커플링 발광 분석법에 의해 실연된 바와 같이 리스테리아 모노사이토게네스 생육력을 억제한다. 리스테리아 모노사이토게네스 (5×10⁵개의 세균/100 ㎕)를 증가되는 농도의 지시된 재조합 LRR 도메인과 함께 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, ATP 수준을 발광 분석법 (BacTiter-Glo: 프로메가(Promega))에 의해 평가하였다. 제시된 값들은 LRR 도메인의 부재 하에 인큐베이션된 대조군 (100％)에 대해 상대적이다. 결과들은 TLR2 및 Nalp3에 대한 2회의 실험을 나타낸다.
도 11: 정제된 Nod2 LRR 도메인에 의한 살균이 크론병과 관련된 Nod2 3020insC 돌연변이를 보유하는 단백질에서 부족하다. 결과들은 모두 수회의 실험을 나타낸다. 패널 a 및 b: Nod2 LRR 도메인이 대장균 (패널 a) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (패널 b)의 막 극성에 영향을 미친다. 단백질을 지시된 농도로 100 ㎕ 성장 배지 내의 5×10⁵개의 세균에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 과정 종료 15분 전에, 50 ㎕의 10 ㎍/㎖ DiBAC4 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 750 ㎕ 빙냉 PBS/웰로 2회 세정하였다. 염료를 흡수한 탈분극된 세균의 백분율을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 패널 c: 바실루스 서브틸리스 막 극성이 다양한 패턴 인식 수용체들로부터의 LRR 도메인에 의해 영향을 받는다. 패널 a 및 b에 기술된 바와 같이 지시된 LRR 도메인으로 세균들을 처리하고, 세균의 막 극성에 대한 이들의 효과를 정량하였다. 패널 d: 한천 확산 분석법에 의해 Nod1 및 Nod2의 항균 활성이 실연되지만, Nod2 3020insC LRR 도메인은 그렇지 않음. 한천 플레이트에 지시된 세균의 잔디를 접종하였다. 무균성 유리 파이펫으로 한천 내에 약 0.5 ㎝ 직경의 구멍을 뚫고, 지시된 단백질 (BSA 단백질 대조군 또는 지시된 LRR 도메인) 또는 항생제 (앰피실린 또는 카나마이신)를 무균성 PBS 내의 0.5 ㎎/㎖의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다.
도 12: Nod2 SNP (전장)가 ATP-커플링 발광 분석법에 의해 실연되는 바와 같이 바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 생육력을 억제한다. 크론병-관련 Nod2 3020insC 및 G908R 돌연변이를 보유하는 단백질에서는 이러한 활성이 부족하다.
도 13: ATP-커플링 발광 분석법에 의해 실연된 스타필로코쿠스 아우레우스 생육력에 대한 Nod2의 효과를 35℃, 37℃ 및 39℃에서의 세균 스트레스의 조건 하에 테스트하였다. Nod2의 항균 활성이 세균 스트레스와 함께 증가되었다.
도 14: 증가하는 농도의 Nod2가 바실루스 서브틸리스 (패널 a) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (패널 b)의 성장을 억제한다. 제시된 값들은 LRR 도메인의 부재 하에 인큐베이션된 대조군 (100％)에 대해 상대적이다.
도 15: NAIP가 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) (패널 a)의 성장을 억제하였다. Nod1이 대장균 성장을 억제하였고 (패널 b), 리스테리아 모노사이토게네스 성장이 Nod1, Nod2, Nod2 3020insC 및 CIAS1에 의해 억제되었다 (패널 c).
도 16: Nod2가 스타필로코쿠스 아우레우스의 성장을 억제하였다. 이러한 억제는 MDP, LPS, 또는 PGN의 공동-투여에 영향을 받지 않았다.

5. 발명의 상세한 설명

본 발명에 따라, 항미생물제로서 사용하기 위한, 다수의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하는 단리된 단백질이 따라서 제공된다. 하기에 예를 들어 기재된 바와 같은 본 발명의 용도에서, 이러한 단백질들이 광범위한 세균을 살균하는데 효과적이고, 효능 면에서 공지된 항생제에 필적한다는 것이 발견되었다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단백질의 C-말단에 LRR이 존재한다. 이는 단백질의 항미생물 활성을 증가시키는 것으로 발견되었다.

각각의 LRR 도메인이 독립적으로 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 본질적으로 구성되는 것이 추가로 바람직하다:

[화학식 I]

[식 중,

x는 임의의 아미노산일 수 있고;

L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;

Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;

N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;

C는 Cys 또는 Ser이며;

Y = 0 또는 1이다].

일반적으로, 류신 풍부 반복부 (LRR)는 α/β 편자 폴드를 형성하는 단백질 구조 모티프이다. 각각의 LRR은 반복되는 아미노산 20-30개의 신장물로 전형적으로 구성되고, 이러한 신장물은 류신 잔기가 유별나게 풍부하지만, 이는 또다른 소수성 잔기로 치환될 수 있다. 각각의 반복 단위는 베타 가닥-회전-알파 나선 구조를 가질 수 있어, 다수의 이같은 LRR로 구성된 조립된 섹션은 내부의 평행한 베타 시트 및 외부의 나선 어레이가 있는 편자 또는 호 형상을 지닌다. 베타 시트의 한 표면 및 나선 어레이의 한 측면이 용매에 노출되고, 따라서 전형적으로 친수성 잔기가 우세하다. 나선과 시트 사이의 영역은 소수성 코어(core)를 일반적으로 형성하고, 전형적으로 류신 잔기들로 공간적으로 조밀하게 채워진다. 본 발명의 별법적인 실시양태에서, 또다른 소수성 아미노산 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 또는 시스테인이 류신 잔기를 치환할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 단백질에서, 모든 LRR 도메인이 단일 연속 구조물을 형성하고, 호 또는 편자 형상을 채택한다. 호 또는 편자의 내부의 오목한 표면은 평행한 β-가닥들로 주로 구성될 수 있는 반면, 외부의 볼록한 표면은 다수의 2차 구조물 예컨대 α-나선, 3₁₀-나선, 폴리프롤린 II 나선, 또는 β-회전의 일렬 배열을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시양태들에서, 오목한 표면 상의 β-가닥들 및 볼록한 표면의 주로 나선형인 요소들이 짧은 루프 또는 β-회전에 의해 연결된다.

본 발명의 단백질은 충분한 LRR을 포함하여 항미생물 활성을 지니고, 적절하게는 본 발명의 단백질은 3개 내지 20개의 LRR 도메인을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태는 3개 이상의 LRR, 5개 이상의 LRR 또는 7개 이상의 LRR을 포함한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 단백질은 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상 또는 20개 이상의 LRR 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태를 형성하는 단백질들의 클래스에서, 높은 비율의 류신 잔기가 존재한다. 따라서, 각각의 LRR 내의 2개 이상의 L 잔기가 Leu이거나, 또는 각각의 LRR 내의 3개 이상의 L 잔기가 Leu이다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 모든 L 잔기가 Leu이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 단백질은 수용성이다.

본 발명의 단백질들의 특정 하위 클래스는 항균제로서의 사용을 위해 5개 이상의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하고, 이때 단백질의 C-말단은 LRR 도메인이고, 각각의 LRR 도메인은 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다:

[화학식 I]

[식 중,

x는 임의의 아미노산일 수 있고;

L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;

Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;

N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;

C는 Cys 또는 Ser이며;

Y = 0 또는 1이다].

이러한 하위 클래스의 단백질에서, 바람직하게는 각각의 LRR 내의 2개 이상의 L 잔기가 Leu이다.

본원에서 사용된 용어 "단리된"은 자신이 천연에서 발생하는 물리적 환경과 상이한 물리적 환경 내에 존재하는 본 발명의 단백질 및 폴리뉴클레오티드 (경우에 따라서)를 지칭한다. 예를 들어, 단리된 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 자신이 천연적으로 발생하는 복잡한 세포 환경에 관하여 실질적으로 단리 (예를 들어, 정제)될 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질이 본원에서 "단리된" 것으로 기술될 수 있지만, 이는 이러한 단백질이 천연에서 존재하여야 함을 의미하지 않는다는 것을 주지하여야 한다.

용어 "~로부터 유래된" 및 "유래된다"는 물리적인 기원과 관계없이 당해 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "천연 발생 LRR 함유 단백질로부터 유래된 화학식 I의 LRR (예를 들어, 일렬)"은 천연 발생 LRR 함유 단백질에서 발견되는 것과 동일한 1차 아미노산 서열을 갖지만, 이러한 천연 발생 공급원으로부터 반드시 정제되지는 않은 LRR을 지칭한다.

용어 "사망 폴드 도메인"은 계획된(programmed) 세포 사망 (세포자멸사)에서 현저한 역할을 하는 6개의 조밀하게 채워진 α 나선을 특징으로 하는 도메인들의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리의 구성원에는 카스페이스 동원 도메인 (CARD), 피린 도메인 (PYD), 사망 도메인 (DD) 및 사망 이펙터 도메인 (DED)이 포함된다. 이러한 패밀리에 대한 추가적인 정보를 위해서, [Lahm A et al (2003); Cell death and Differentiation, 10, 10-12] 및 이에 인용된 참고문헌을 특히 참조한다.

용어 "LRR" 또는 "LRR 모티프" 및 이의 문법적인 변형물은 화학식 I의 류신 풍부 반복 모티프를 지칭한다.

용어 "LRR 도메인"은 2개 이상 (약 50개까지)의 화학식 I의 LRR (전형적으로는 일렬)을 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 이들로 구성되는) 단백질 도메인을 지칭한다.

용어 "NOD 단백질"은 중앙의 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 (NOD), 아미노 말단 CARD 도메인 및 카르복실 말단 LRR 도메인을 함유하는 단백질을 지칭한다. 인간 NOD 패밀리의 구성원 (반드시 철저하지는 않음)의 상세사항에 대해, [Inohara N. et al (2005), Annu.Rev.Biochem 74:355-383]의 361면의 표 I을 특히 참조한다.

접미사 "-LRR"은 선행 단백질의 천연 발생 LRR 도메인을 지칭하고, 따라서 "NOD-LRR"은 NOD 패밀리의 천연 발생 구성원에서 발견되는 LRR 도메인을 지칭한다.

"LRR 단백질"은 1개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 단백질을 의미한다.

"TLR"은 toll-유사 수용체 패밀리를 지칭한다. toll-유사 수용체 (TLR)는 미생물로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하는, 막에 1회 스패닝(spanning)된 비-촉매적 수용체이다. 전체 내용이 거명에 의해 포함된 [Mitchell JA (2007), J Endocrinol 193(3); 323-30]를 특히 참조한다.

"단백질은" 폴리펩티드를 포함한다.

"인간 NOD2"는 서열 1의 단백질을 지칭한다.

"인간 NOD1"은 서열 2의 단백질을 지칭한다.

"인간 NOD2-LRR"은 서열 3의 단백질을 지칭한다.

"인간 NOD1-LRR"은 서열 4의 단백질을 지칭한다.

"인간 CIITA-LRR"은 서열 5의 단백질을 지칭한다

"인간 TLR2-LRR은 서열 6의 단백질을 지칭한다.

"인간 Nalp3-LRR"은 서열 7의 단백질을 지칭한다.

"항균 제약 조성물"은 대상 내로의 투여 전에 항균 활성을 특히 지니는 제약 조성물을 지칭한다.

5.1 단백질

본 발명은, 적어도 부분적으로, LRR 모티프 (화학식 I)를 함유하는 단백질에 항균 (특히 살균) 활성이 있다는 뜻밖의 관찰을 기초로 한다. LRR 도메인을 또다른 도메인과 함께 포함하는 천연 발생 단백질 (예컨대 NOD 패밀리의 단백질들에서 나타남)에 상당한 항균 활성이 있음이 본 발명가들에 의해 실연되지만, LRR 도메인이 혼자서 항균 활성을 지닌다는 것이 본 발명가들에 의해 또한 실연된다 .

일부 실시양태에서, 단리된 단백질은 2개 내지 100개 사이의 일렬로 배열된 화학식 I의 LRR 모티프, 더욱 특히 2개 내지 50개 사이, 예를 들어 2개 내지 45개 사이를 포함한다.

전형적인 실시양태에서, LRR 모티프는 잔기 15개 내지 50개 사이의 길이, 예를 들어 잔기 20개 내지 30개 사이의 길이이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단리된 단백질은 2개 내지 100개 사이의 일렬로 배열된 화학식 I의 LRR 모티프 (예를 들어, 2개 내지 50개 사이)를 포함하고, 이때 각각의 모티프는 15개 내지 50개 사이의 연속 아미노산 잔기 (예를 들어, 20개 내지 30개의 잔기)로 구성된다.

일부 실시양태에서, 단백질은 인공적이고, 즉 천연에서 발견되지 않는 배열을 갖는다. 이러한 실시양태에서, 단백질은 중앙의 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 (NOD), 카르복실 말단 LRR 도메인 (인위적인 개수의 LRR 도메인 (바람직하게는 일렬로 배열됨)을 예를 들어 포함함) 및 아미노 말단 이펙터 도메인을 포함할 수 있다. 이펙터 도메인은, 예를 들어, 표적 세포 예컨대 병원성 세균의 사멸 (예를 들어, 세포자멸사에 의한 사멸)을 촉진할 수 있다. 이같은 이펙터 도메인의 예는 사망 폴드 도메인 예컨대 CARD, 피린, 사망 도메인 및 사망 이펙터 도메인이다.

본 발명의 또다른 양상에서, 천연 발생 단백질로부터 유래된 LRR 도메인을 포함하는 단리된 단백질이 제공된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 실시양태에서, 단리된 단백질은 LRR 도메인을 포함하는 천연 발생 단백질 (본원에서 "LRR 단백질"로 종종 지칭됨)이다. 천연 발생 LRR 단백질은 "RI-유사", "CC", "세균", "SDS22-유사", "식물 특이적", "전형적" 또는 "TpLRR" 단백질일 수 있다 ([Kajava A.V. (1998), J.Mol.Biol. 277, 519-527] 및 [Ohyanagi T et al (1997), FASEB J 11:A949] (양쪽 모두 전문이 본원에 포함됨)를 특히 참조). 이같은 천연 발생 단백질의 예는 동물에서 유래된 단백질이고, NOD 패밀리의 구성원, 특히 인간 (또는 기타 영장류) NOD 단백질 (예컨대 인간 NOD1 또는 인간 NOD2)이 이에 포함된다. 또다른 예에는 Toll-유사 수용체 (TLR) 패밀리가 포함되고, TLR 2, 4, 5, 7, 8 및 9, 특히 이의 인간 및 기타 포유류 오르토로그(orthologue)가 포함된다. 또다른 추가적인 예로는 CIITA 및 NAIP의 구성원이 포함된다.

일부 실시양태에서, 단리된 단백질은 서열 1, 2, 3, 또는 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단리된 LRR 도메인, 즉 단리된 LRR 도메인으로 구성되는 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단리된 LRR 도메인일 수 있다.

본 발명의 또다른 양상에서, LRR 단백질이 N-말단 류신 풍부 반복부, 하나 이상의 류신 풍부 반복부, C-말단 류신 풍부 반복부, 및 알파 나선을 포함하는 연결 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 아니라는 조건으로, 단리된 LRR 단백질이 제공된다.

5.2 폴리뉴클레오티드

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명의 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (예컨대 RNA 또는 cDNA)가 제공된다. 이같은 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 단리된 단백질의 제작을 위한 공정에서, 예를 들어, 본 발명의 단리된 단백질을 포함하는 약제 (예컨대 제약 조성물)의 제작에서 사용될 수 있다. 또다른 양상에서, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 병원체 예컨대 병원성 세균에 대한 숙주 방어를 증대시키기 위한 치료용 또는 예방용 면역원성 조성물 (예컨대 백신, 예를 들어, DNA 백신)의 일부로서 벡터 예컨대 플라스미드, 바이러스, 미니염색체, 트랜스포존(transposon) 등 내로 혼입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 양상에서, 화학식 I의 LRR을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는, 또는 이것으로 구성되는) 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 예컨대 DNA (예를 들어 cDNA) 또는 RNA가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, LRR 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 예컨대 DNA (예를 들어 cDNA) 또는 RNA가 제공된다. 이러한 양상의 일부 실시양태에서, 천연 발생 LRR 도메인 예컨대 NOD LRR 도메인, 특히 인간 NOD LRR 도메인 예컨대 서열 2 또는 3의 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, LRR 단백질, 특히 동물에서 유래된 천연 발생 LRR 단백질 예컨대 NOD 단백질, 더욱 특히 인간 또는 기타 영장류 NOD 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 예컨대 DNA (예를 들어 cDNA) 또는 RNA가 제공된다. 이의 예로는 인간 NOD1 또는 인간 NOD2를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 또다른 예로는 Toll-유사 수용체 (TLR), 예를 들어, TLR2, 7, 8 또는 9 및 CIITA 또는 NAIP를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

5.3 생산 방법

본 발명의 특정 양상은 본 발명의 단리된 단백질 및 단백질, 특히 섹션 5.1에 언급된 것들의 생산 방법에 관한 것이다.

당업자에게 주지된 재조합 세포 배양 기술을 사용하여 본 발명의 단리된 단백질 및 단백질이 전형적으로 생산된다. 단리된 단백질 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가적인 클로닝 (증폭) 또는 발현을 위한 플라스미드와 같은 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 한 유용한 발현 시스템은 글루타메이트 신쎄테이스 시스템 (예컨대 론자 바이올로지스(Lonza Biologies) 판매)이고, 특히 숙주 세포가 CHO 또는 NSO인 경우이다 (하기 참조). 통상적인 절차 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 쉽게 단리 및 서열확인된다. 사용될 수 있는 벡터에는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 미니염섹체가 포함되고, 이들 중 플라스미드가 전형적인 실시양태이다. 일반적으로, 이같은 벡터는 발현을 용이하게 하도록 이러한 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 추가로 포함한다.

5.3.1 신호 서열

본 발명의 단백질은 성숙형 단백질의 N 말단에 특이적 절단 부위가 있는 이종 신호 서열이 있는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱되어야 한다. 원핵생물 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 알칼리성 포스파테이스, 페니실리네이스, 또는 열-안정형 장독소 II 리더(leader)일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 효모 인버테이스 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파테이스일 수 있다. 예를 들어, WO90/13646 참조. 포유류 세포 시스템에서, 바이러스 분비 리더 예컨대 단순 헤르페스 gD 신호 및 천연 면역글로불린 신호 서열이 이용가능하다. 전형적으로, 신호 서열은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임(reading frame) 내에서 결찰된다.

5.3.2 복제 기원

대부분의 그람-음성 세균에 적절한 pBR322, 대부분의 효모에 대한 2μ 플라스미드 및 대부분의 포유류 세포에 대한 다양한 바이러스 기원 예컨대 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV로 복제 기원이 당업계에 주지되어 있다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유류 발현 벡터에는 필요하지 않지만, SV40은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.

5.3.3 선별 마커

전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나 (b) 영양요구 결핍을 보완하거나 복합 배지에서 입수가능하지 않은 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 선별 계획은 숙주 세포의 성장을 정지시키는 단계를 수반할 수 있다. 본 발명의 치료 항체를 코딩하는 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 예를 들어 선별 마커에 의해 부여된 약물 저항성으로 인해 생존한다. 또다른 예는 소위 DHFR 선별 마커이고, 이때 형질전환체가 메토트렉세이트의 존재 하에 배양된다. 전형적인 실시양태에서, 증가되는 양의 메토트렉세이트의 존재 하에 세포가 배양되어, 외인성 관심 유전자의 카피수가 증폭된다. CHO 세포가 DHFR 선별용으로 특히 유용한 세포주이다. 추가적인 예는 글루타메이트 신쎄테이스 발현 시스템 (Lonza Biologies)이다. 효모에서 사용하기 위한 적절한 선별 유전자는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al., Nature 282, 38, 1979] 참조).

5.3.4 프로모터

본 발명의 단백질 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 적절한 프로모터가 항체를 코딩하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 원핵생물 숙주용 프로모터에는 phoA 프로모터, 베타-락타메이스 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파테이스, 트립토판 및 하이브리드 프로모터 예컨대 Tac이 포함된다. 효모 세포에서의 발현에 적절한 프로모터에는 3-포스포글리세레이트 카이네이스 또는 기타 해당 효소, 예를 들어, 에놀레이스, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데하이드로제네이스, 헥소카이네이스, 피루베이트 디카르복실레이스, 포스포프룩토카이네이스, 글루코스 6 포스페이트 아이소머레이스, 3-포스포글리세레이트 뮤테이스 및 글루코카이네이스가 포함된다. 유도성 효모 프로모터에는 알코올 데하이드로제네이스 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파테이스, 메탈로티오네인, 및 질소 대사 또는 말토스/갈락토스 이용을 담당하는 효소가 포함된다.

포유류 세포 시스템에서의 발현을 위한 프로모터에는 바이러스 프로모터 예컨대 폴리오마, 계두 및 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (특히 극초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 원숭이 바이러스 40이 포함된다. 물론, 프로모터의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 적절한 상용성을 기초로 한다. 따라서, 한 실시양태에서, RSV 및/또는 SV40 및/또는 CMV 프로모터, 본 발명의 경쇄 V 영역 (VL)을 코딩하는 DNA, KC 영역을 네오마이신 및 앰피실린 저항성 선별 마커와 함께 포함하는 제1 플라스미드, 및 RSV 또는 SV40 프로모터, 본 발명의 중쇄 V 영역 (VH)을 코딩하는 DNA, γ1 불변 영역을 코딩하는 DNA, DHFR 및 암피실린 저항성 마커를 포함하는 제2 플라스미드가 제공된다.

5.3.5 인핸서 요소

적절한 경우에, 예를 들어, 고등 진핵생물에서의 발현을 위해, 벡터 내의 프로모터 성분에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소가 사용될 수 있다. 적절한 포유류 인핸서 서열에는 글로빈, 엘라스테이스, 알부민, 태아단백질 및 인슐린으로부터의 인핸서 요소가 포함된다. 별법적으로, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서 예컨대 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 배큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 유전자좌를 사용할 수 있다 (WO04/009823 참조). 바람직하게는, 인핸서는 프로모터에 대해 상류인 부위에서 벡터 상에 위치한다.

5.3.6 숙주 세포

본 발명의 단리된 단백질을 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 적절한 원핵 세포에는 유박테리아(eubacteria), 예를 들어 장내세균(enterobacteriaceae) 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어 대장균 (예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스(Bacillus) 예컨대 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실루스 리케니포르미스(B. licheniformis) (DD 266 710 참조), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 효모 숙주 세포 중에서, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) (예를 들어 ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로위아(yarrowia) (EP402,226), 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris) (EP183,070, 또한 [Peng et al., J. Biotechnol. 108(2004) 185-192] 참조), 칸디다(Candida), 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP244,234), 페니실린, 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger)가 또한 고려된다.

본 발명의 숙주 세포는 고등 진핵생물 세포일 수 있다. 적절한 고등 진핵생물 숙주 세포에는 포유류 세포 예컨대 COS-1 (ATCC 번호 CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 293, 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC 번호 CRL 10314), 293 (ATCC 번호 CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어 CHO-K1, ATCC 번호 CCL 61, DHFR-CHO 세포주, 예를 들어 DG44 ([Urlaub et al, (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556] 참조)), 특히 현탁 배양용으로 개조된 CHO 세포주, 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개 신장 세포 (ATCC CCL 34), 인간 폐 세포 (ATCC CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포, 예를 들어 NSO (US 5,807,715 참조), Sp2/0, YO가 포함된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 2개 이상의 화학식 I의 LRR을 포함하는 단리된 단백질, LRR 도메인 또는 LRR 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 안정적으로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.

5.3.7 세균 발효

세균 시스템을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 단백질은 불용성 원형질막주위공간 단백질로 생산되고, 이는 당업자에게 공지된 방법에 따라 추출되어 활성 단백질을 형성하도록 리폴딩(refolding)될 수 있다 ([Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20] 및 [Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277] 참조).

5.3.8 세포 배양 방법

본 발명의 단백질 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 배양할 수 있다. 스피너(spinner) 플라스크, 롤러(roller) 병 또는 중공 섬유 시스템에서 숙주 세포를 배양할 수 있지만, 대규모 생산을 위해, 교반 탱크 반응기가 특히 현탁 배양용으로 사용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 살포기, 배플(baffle) 또는 저전단 임펠러(impeller)를 예를 들어 사용하는 통기를 위해 교반 탱커가 개조된다. 버블 칼럼(bubble column) 및 에어리프트(airlift) 반응기의 경우, 공기 또는 산소 버블로의 직접적인 통기가 사용될 수 있다. 숙주 세포가 무혈청 배양 배지에서 배양되는 경우, 통기 공정으로 인한 세포 손상을 방지하는 것을 돕기 위해 세포 보호제 예컨대 플루로닉(pluronic) F-68이 배지에 보충되는 것이 바람직하다. 숙주 세포 특성에 따라, 미세담체가 부착 의존적 세포주에 대한 성장 기판으로 사용될 수 있거나, 또는 세포가 현탁 배양 (전형적임)에 대해 개조될 수 있다. 숙주 세포, 특히 무척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 공정 방식 예컨대 페드(fed)-뱃치(batch), 반복형 뱃치 프로세싱 ([Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109] 참조), 확장형 뱃치 프로세스 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합에 의해 형질전환된 포유류 숙주 세포가 혈청 함유 배지 예컨대 소 태아 혈청 (FCS)에서 배양될 수 있지만, 필요하다면 에너지 공급원 예컨대 글루코스 및 합성 성장 인자 예컨대 재조합 인슐린이 보충된, 합성 무혈청 배지 예컨대 [Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 개시된 것, 또는 시판 배지 예컨대 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA)에서 이같은 숙주 세포가 배양되는 것이 바람직하다. 숙주 세포의 무혈청 배양은 이러한 세포가 무혈청 조건에서 성장하도록 개조되는 것을 필요로 할 수 있다. 한 개조 접근법은 이같은 숙주 세포를 혈청 함유 배지에서 배양하고, 반복적으로 배양 배지의 80％를 무혈청 배지로 교환하여, 숙주 세포가 무혈청 조건에서 적응하도록 학습시키는 것이다 (예를 들어 [Scharfenberg K et al (1995), Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.G. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers] 참조).

배지 내로 분비된 본 발명의 단백질을 의도된 용도에 적절한 정제 정도를 제공하도록 다양한 기술을 사용하여 회수 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 인간 환자의 치료를 위한 본 발명의 치료적 단백질은 전형적으로 적어도 95％의 순도, 더욱 전형적으로는 98％ 또는 99％ 또는 이를 초과하는 순도를 요구한다 (미정제 배양 배지와 비교하여). 첫번째 예에서, 원심분리에 이어서, 미세여과, 초원심분리 및/또는 심층 여과를 예를 들어 사용하는 상등액의 정화 단계를 사용하여, 배양 배지로부터의 세포 잔해물이 전형적으로 제거된다. 또다른 다양한 기술 예컨대 투석 및 젤 전기영동 및 크로마토그래피 기술 예컨대 하이드록시 아파타이트 (HA), 친화력 크로마토그래피 (임의적으로, 폴리히스티딘과 같은 친화력 태그부착 시스템을 수반함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, US 5,429,746 참조)가 이용가능하다. 전형적으로, 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 사용된다 (예를 들어, DV-20 필터를 예를 들어 사용하는 나노여과). 이러한 다양한 단계 후에, 적어도 35 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어 100 ㎎/㎖ 이상의 본 발명의 단리된 단백질을 포함하는 정제된 제제가 제공되고, 따라서 본 발명의 실시양태를 형성한다. 적절하게는, 이같은 제제에는 응집된 형태의 본 발명의 단백질이 실질적으로 없다.

5.4. 제약 조성물

특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질 및 폴리뉴클레오티드가 병원성 세균 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 제약 조성물 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 인간에게 병원성인 세균에 의한 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다. 또다른 실시양태에서, 제약 조성물은 비-인간 동물에게 병원성인 세균 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 것이고, 예를 들어 수의사가 사용하기 위한 것이다. 특정 병원성 세균에 의한 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 실시양태들이 하기에서 더욱 상세하게 언급된다. 독자는 섹션 3, 섹션 5.1 및 섹션 5.2에 기재된 각각의 모든 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 양상 또는 실시양태가 제약 조성물 내로 혼입되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 본원에서 고려되는 것이 의도된다고 생각할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 제약 조성물은 허용된 제약학적 관례에 의해 공지되어 있고 요구되는 제약상 허용되는 담체와 함께 치료적 유효량 (예를 들어, 단위 투약량)의 본 발명의 단리된 단백질을 포함한다 (또는 이것으로 본질적으로 구성된다). 제약 용도를 위한 단백질의 제형은 잘 이해되어 있고, [Hovgaard L (2000) "Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins", CRC Press, ISBN: 0748407456]; [Nail S. et al (2002) "Development and manufacture of protein pharmaceuticals", Springer, ISBN: 0306467453]; [McNally E.J. (1999) "Protein formulation and delivery (Drugs & the Pharmaceutical Sciences), Marcel Dekker Ltd, ISBN: 0824778839]를 특히 참조한다. 거명에 의해 개시내용이 본원에 포함된 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., ed. Oslo et al.]을 또한 참조한다. 본 발명의 제약 조성물을 조성물이 치료하기를 원하는 기본적인 질환 또는 용태에 따라 임의의 편리한 또는 필요한 경로에 의한 투여에 적절하게 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 단백질을 포함하는 정맥내로 투여가능한 제약 조성물이 제공된다. 또다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 단백질의 피하 투여에 적절한 제약 조성물이 제공된다.

원하는 정도의 순도를 지니는 본 발명의 단백질을 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관 또는 투여용으로 본 발명의 단백질이 제조된다. 이같은 물질은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이다. 본 발명의 단백질이 수용성인 경우, 완충제 예컨대 포스페이트 또는 기타 유기산 염 (바람직하게는 pH 약 7 내지 8) 내에서 제형할 수 있다. 단백질이 부분적으로만 수용성인 경우, 이의 용해도를 증가시키기 위해 이를 0.04-0.05％ (w/v) 양의 비이온성 계면활성제 예컨대 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics), 또는 PEG, 예를 들어, 트윈 80과 함께 제형함으로써 마이크로에멀션으로 제조할 수 있다.

임의적으로, 또다른 성분 예컨대 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌; 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 및 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨이 첨가될 수 있다.

치료적 투여에 사용될 본 발명의 단백질은 무균성이어야 한다. 무균성 여과막 (예를 들어, 0.2 ㎛ 막)을 통한 여과에 의해 무균성이 쉽게 달성된다. 본 발명의 단백질은 통상적으로 동결건조 형태로 또는 열 및 산화 변성에 대해 고도로 안정적인 경우에는 수용액으로 보관될 것이다. 본 발명의 단백질 제제의 pH는 전형적으로 약 6 내지 8일 것이지만, 더 높거나 더 낮은 pH 값 또한 특정 예에서 적합할 수 있다. 상기 부형제, 담체 또는 안정화제 중 일부의 사용은 본 발명의 단백질의 염의 형성을 초래할 것임이 이해될 것이다.

본 발명의 단백질이 비경구적으로 사용되는 경우, 일반적으로 본 발명의 단백질을 함유하는 치료 조성물은 무균성 접근 포트(port)가 있는 용기, 예를 들어, 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.

일반적으로, 질환/장애가 허용하는 경우, 부위-특이적 전달용으로 본 발명의 단백질을 제형하여 투약하여야 한다. 이는 상처 및 궤양의 경우에 편리하다. 예를 들어, 본 발명의 단백질이 젤 (예를 들어, 하이드로젤) 내로 혼입되어, 상처 또는 궤양 층 내로 투여될 수 있다.

지속 방출 제형이 또한 제조될 수 있고, 이는 마이크로캡슐 입자 및 이식가능 물품의 형성을 포함한다. 지속 방출 조성물을 제조하기 위해, 바람직하게는 본 발명의 단백질이 생물분해성 매트릭스 또는 마이크로캡슐 내로 혼입된다. 이러한 목적에 적절한 물질은 폴리락티드이지만, 폴리-(a-하이드록시카르복실산), 예컨대 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산 (EP 133,988A)의 또다른 중합체가 사용될 수 있다. 또다른 생물분해성 중합체에는 폴리(락톤), 폴리(아세탈), 폴리(오르토에스테르), 또는 폴리(오르토카르보네이트)가 포함된다. 이때의 최초 농도는 담체 자체 또는 이의 분해 생성물이 표적 조직에서 비독성이어야 하고 용태를 더 악화시키지 않을 농도여야 한다. 이는 표적 장애의 동물 모델 또는 이같은 모델이 입수불가능한 경우에는 정상적인 동물에서의 일상적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 수많은 과학 간행물에 이같은 동물 모델들이 기록되어 있다.

지속 방출 조성물의 예에 대해, 미국 특허 번호 3,773,919, EP 58,481A, 미국 특허 번호 3,887,699, EP 1 58,277A, 캐나다 특허 번호 1176565, [U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983)], 및 [R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 (1982)] 참조.

국소적으로 적용되는 경우, 본 발명의 단백질이 또다른 성분, 예컨대 담체 및/또는 애주번트와 적절하게 조합된다. 이같은 또다른 성분의 성질은 이들이 제약상 허용가능하여야 하고, 이의 의도되는 투여에 대해 효율적이어야 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 분해할 수 없는 한 제한되지 않는다. 적절한 비히클의 예로는 정제된 콜라겐의 존재 또는 부재 하의 연고, 크림, 젤 또는 현탁액이 포함된다. 또한 조성물은, 바람직하게는 액체 또는 반-액체 형태로, 경피 패치(patch), 고약, 및 붕대 내로 함침될 수 있다.

젤 제형을 수득하기 위해, 액체 제형 내에 제형된 본 발명의 단백질이 국소적으로 적용되기에 적합한 점도의 젤을 형성하도록 유효량의 수용성 다당류 또는 합성 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 혼합될 수 있다. 사용될 수 있는 다당류에는, 예를 들어, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필 셀룰로스가 포함되는 에스테르화 셀룰로스 유도체와 같은 셀룰로스 유도체; 전분 및 분별 전분; 한천; 알긴산 및 알기네이트; 아라비아 검(gum); 풀루란; 아가로스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프룩탄; 이눌린; 만난; 자일란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체중합체; 뿐만 아니라 검 예컨대 잔탄 검; 구아 검; 로커스트 빈 검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검; 및 이들의 유도체 및 혼합물이 포함된다. 본원에서의 바람직한 젤화제는 생물학적 시스템에 대해 불활성이고, 비-독성이며, 제조하기 간단하고, 지나치게 흐르거나 점성이지 않으며, 젤 내에 보유되는 본 발명의 단백질을 불안정하게 하지 않을 젤화제이다.

바람직하게는, 다당류는 에테르화 셀룰로스 유도체이고, 더욱 바람직하게는 잘 정의되어 있고, 정제되었으며, USP에 열거된 것들, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 하이드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 메틸셀룰로스가 본원에서 가장 바람직하다.

젤화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적합한 점도를 수득하기 위한 저분자량 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜들의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량이 400-600인 폴리에틸렌 글리콜과 분자량이 1500인 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이 페이스트를 수득하기 위한 적합한 비율로 혼합되는 경우 이러한 목적에 효과적일 것이다.

다당류 및 폴리에틸렌 글리콜에 적용되는 경우의 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하도록 의도된다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르 기의 치환도에 의해 결정되고, 본원에서 유용한 안정화 유도체는 유도체를 수용성이게 하기 위해 셀룰로스 사슬 내의 무수글루코스 단위 당 충분한 양의 에테르 기를 지녀야 한다. 무수글루코스 단위 당 0.35개 이상의 에테르 기의 에테르 치환도가 일반적으로 충분하다. 추가적으로, 셀룰로스 유도체는 알칼리금속 염, 예를 들어, Li, Na, K, 또는 Cs 염의 형태일 수 있다.

메틸셀룰로스가 젤에서 사용되는 경우, 바람직하게는 이는 약 2-5％, 더욱 바람직하게는 약 3％의 젤을 포함하고, 본 발명의 단백질은 젤 1 ㎖ 당 약 300-1000 ㎎의 양으로 존재한다.

사용될 투여량은 상기 기술된 요인들에 좌우된다. 일반적인 계획으로서, 본 발명의 단백질은 약 0.1 ng/cc을 초과하는 수준 내지 효율적이지만 과도하게 독성이지 않은 최대 용량까지를 조직 내에서 수립할 수 있는 투여량으로 제형되어 표적 부위 또는 조직에 전달된다. 가능하다면 연속 주입, 지속 방출, 국소 적용, 또는 실험적으로 결정된 빈도의 주사에 의해 이러한 조직내 농도가 유지되어야 한다.

본 발명의 실행에서 사용되는 본 발명의 단백질의 임상 투여에 특히 적절한 조성물에는, 예를 들어, 무균성 수용액, 또는 무균성의 수화가능 분말 예컨대 동결건조 단백질이 포함된다. 적합한 양의 제약상 허용되는 염을, 일반적으로 제형이 등장성이게 하는데 충분한 양으로, 제형 내에 추가로 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. pH 조절제 예컨대 아르기닌 기재, 및 인산이 적합한 pH, 일반적으로 5.5 내지 7.5를 유지하는데 충분한 양으로 또한 전형적으로 포함된다. 더욱이, 수성 제형의 저장 기간 또는 안정성의 개선을 위해, 글리세롤과 같은 추가적인 작용제를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 제형이 비경구 투여, 특히 정맥내 투여에 적합하게 된다.

본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구현되는 특정 용도에 따라 변할 수 있고, 주치의/건강관리 전문가의 범위 내에 속한다.

따라서, 일부 실시양태에서, 단리된 NOD 단백질, 특히 단리된 인간 NOD 단백질 예컨대 인간 NOD1 또는 인간 NOD2를 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 항균 (예를 들어 살균) 제약 조성물이 제공된다.

또다른 실시양태에서, 단리된 NOD 단백질, 특히 단리된 인간 NOD 단백질 예컨대 인간 NOD1 및/또는 인간 NOD2를 제공하는 단계를 포함하는, 제약 조성물, 특히 항균 제약 조성물의 제작 방법이 제공된다.

따라서, 일부 또다른 실시양태에서, 단리된 NOD-LRR 도메인, 특히 단리된 인간 NOD-LRR 도메인 예컨대 인간 NOD1-LRR 또는 인간 NOD2-LRR을 (예를 들어, 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 항균 (예를 들어 살균) 제약 조성물이 제공된다.

따라서, 일부 또다른 실시양태에서, 단리된 LRR 도메인 예컨대 단리된 NOD-LRR 도메인, 특히 단리된 인간 NOD-LRR 도메인 예컨대 인간 NOD1-LRR 또는 인간 NOD2-LRR (예를 들어 조성물의 단독 활성 성분으로서) 또는 단리된 인간 TLR-LRR 도메인 예컨대 TLR2-LRR, TLR4-LRR, TLR5-LRR, TLR9-LRR으로 구성된 단백질을 조성물의 단독 활성 성분으로서 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 항균 예컨대 살균 제약 조성물)이 제공된다.

또다른 실시양태에서, 단리된 LRR 단백질 예컨대 단리된 인간 LRR 단백질 예컨대 단리된 NOD-LRR 도메인, 특히 단리된 인간 NOD-LRR 도메인 예컨대 인간 NOD1-LRR 및/또는 인간 NOD2-LRR을 제공하는 단계를 포함하는 제약 조성물, 특히 항균 제약 조성물의 제작 방법이 제공된다.

또다른 실시양태에서, 단리된 TLR 단백질, 예를 들어 단리된 포유류 TLR 단백질 예컨대 인간 TLR 4, 5를 (예를 들어 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 항균 (예를 들어, 살균) 제약 조성물이 제공된다.

또다른 실시양태에서, 단리된 TLR-LRR, 예를 들어, 단리된 포유류 TLR-LRR 예컨대 인간 TLR4-LRR, 인간 TLR5-LRR, 인간 TLR2-LRR을 (예를 들어 조성물의 단독 활성 성분으로서) 포함하는 항균 (예를 들어 살균) 제약 조성물이 제공된다.

또다른 실시양태에서, 단리된 TLR-LRR, 예를 들어, 단리된 포유류 TLR-LRR 예컨대 인간 TLR4-LRR, 인간 TLR5-LRR 또는 인간 TLR2-LRR을 (예를 들어 조성물의 단독 활성 성분으로서) 제공하는 단계를 포함하는, 항균 (예를 들어 살균) 제약 조성물의 제작 방법이 제공된다.

5.4.1 기타 조성물 및 제조품

일부 실시양태에서, 소독을 필요로 하는 표면 또는 물품을 소독하기 위한 소독제 조성물 예컨대 수성 소독제 조성물 내로 혼입된 유효량의 본 발명의 단리된 단백질 (예컨대 상기 섹션 3 및 5.1에서 상술된 것)이 제공된다. 독자는 본 명세서의 섹션 3 및 5.1에 기재된 모든 양상 및 실시양태가 본 섹션에서 유용한 것으로 개별적으로, 그리고 명확하게 고려된다고 생각할 수 있다. 이같은 표면의 예로는 임상 환경에서 일반적으로 발견되는 것들 예컨대 병동, 외과 표면 등, 및 병원성 세균에의 노출을 감소시키는 것이 바람직한 기타 표면이 포함된다. 본 발명의 소독제 조성물은, 공지되어 있고 양호한 임상 실무에 의해 요구되는 기타 멸균 기술과 임의적으로 조합되어, 의료용 물품 예를 들어 카테터 또는 수술용 기구를 소독하는데 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 병원성 세균으로 오염된 물을 소독하는데 또한 사용될 수 있고, 본 발명은 세균, 특히 인간 및/또는 기타 포유동물에게 병원성인 세균으로 오염된 물을 소독하는 방법으로, 이러한 오염된 물을 본 발명의 단백질과 부가혼합하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 단백질을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는) 상처 및/또는 수술 드레싱이 또한 제공된다.

5.5 병원성 세균

본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 예컨대 제약 조성물은 병원성 세균에 의한 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 주지된 바와 같이, 세균은 인간 및/또는 기타 포유동물에게 병원성일 수 있다. 병원성 세균은 일부 실시양태에서는 그람 양성이고, 또다른 실시양태에서는 그람 음성이다. 또다른 구현되는 실시양태에서, 병원성 세균은 숙주 (예를 들어, 인간)에게 병원성인 혐기성 세균이다. 병원성 세균의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 아시네토박테르 바우마니이(Acinetobacter baumanii), 악티노바실리스(Actinobacillis) 종, 악티노마이세테스(Actinomycetes), 악티노마이세스(Actinomyces) (예를 들어 악티노마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 나에슬룬디이(Actinomyces naeslundii), 악티노마이세스 종), 아에로모나스(Aeromonas) 종 (예를 들어, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 아에로모나스 카비아에(Aeromonas Caviae)), 혐기성 구균 예컨대 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococus), 베일로넬라(Veillonella), 그람 양성 혐기성 바실루스 예컨대 모빌룬쿠스(Mobiluncus) 종, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 락토바실루스(Lactobacillus), 유박테리움(Eubacterium), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종, 그람 음성 혐기성 바실루스 예컨대 박테로이데스(Bacteroides), 프레보텔라(Prevotella) 종, 포르피로모나스(Porphyromonas) 종, 푸소박테리움(Fusobacterium) 종, 바실루스 종 (예컨대 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 서브틸리스, 바실루스 스테아르테르모필루스(Bacillus stearthermophilus)), 박테로이데스(Bacteroides) 종 (예컨대 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)), 보르데텔라(Bordetella) 종 (예컨대 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아(Borrelia) 종 (예컨대 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라(Brucella) 종 (예컨대 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜린텐시스(Brucella melintensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis)), 부르크홀데리아(Burkholderia) 종 (예컨대 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)), 캄필로박테르(Campylobacter) 종 (예컨대 캄필로박테르 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박테르 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박테르 라리(Campylobacter lari), 캄필로박테르 페투스(Campylobacter fetus)), 시트로박테르(Citrobacter) 종 (예컨대 시트로박테르 프레운디이(Citrobacter freundii), 시트로박테르 디베르수스(Citrobacter diversus)), 클로스트리디움(Clostridium) 종 (예컨대 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 코리네박테리움(Corynebacterium) 종 (예컨대 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이케움(Corynebacterium jeikeum), 코리네박테리움 우레알리티쿰(Corynebacterium urealyticum)), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 엔테로박테르 종 (예컨대 엔테로박테르 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박테르 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박테르 클로아카에(Enterobacter cloacae)), 대장균 (예컨대 장독소생성 대장균, 장침투성 대장균, 장병원성 대장균, 장출혈성 대장균, 요로병원성 대장균), 클레브시엘라 종 (예컨대 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 프로테우스 종 (예컨대 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)), 프로비덴시아(Providencia) 종 (예컨대 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 프로비덴시아 스투아르티이(Providencia stuartii)), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) (예를 들어, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 타이피무리움), 세라티아 종 (세라티아 마르세스칸스, 세라티아 리퀴파시엔스(Serratia liquifaciens)), 시겔라 종 (예컨대 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii), 시겔라 소네이(Shigella sonnei)), 예르시니아(Yersinia) 종 (예컨대 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종 (예컨대 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium)), 에리시펠로트릭스 루소파티아에(Erysipelothrix rhusopathiae), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 헤모필루스(Haemophilus) 종 (헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 두레이(Haemophilus dureyi), 헤모필루스 아에집티우스((Haemophilus aegyptius), 헤모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 파라헤몰리티쿠스(Haemophilus parahaemolyticus)), 헬리코박테르(Helicobacter) 종 (예컨대 헬리코박테르 파일로리(Helicobacter pylori), 헬리코박테르 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박테르 페넬리아에(Helicobacter fennelliae)), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토게네스, 마이크로코쿠스(Micrococcus) 종, 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 노카르디아(Nocardia) 종 (예컨대 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 노카르디아 브라실리엔시스(Nocardia brasiliensis), 네이세리아(Neisseria) 종 (예컨대 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티데스(Nesseria meningitides)), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonas shigelloides), 슈모모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코쿠스(Rhodococcus) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종 (예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스, 특히 메티실린 저항성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 및 반코마이신(Vancomycin) 저항성 스타필로코쿠스 아우레우스 (VRSA), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus)), 스테노트로포모나스 말토필리아, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종 (예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 안기노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 에퀴스밀리스(Streptococcus equismilis), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 안기노수스((Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 밀레리(Streptococcus milleri)), 스트렙토마이세스 종, 트레포네마(Treponema) 종 (예컨대 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 엔데미쿰(Treponema endemicum), 트레포네마 페르테누에(Treponema pertenue), 트레포네 마카라테움Treponema carateum)), 비브리오(Vibrio) 종 (예컨대 O1 및 O139와 같은 병원성 혈청형이 포함되는 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 미니쿠스(Vibrio minicus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 메치니코비이(Vibrio metchnikovii), 비브리오 담셀라(Vibrio damsela), 비브리오 푸르니시이(Vibrio furnisii)).

따라서, 본 발명은 특히 인간 환자에서 상기 언급된 병원성 세균 중 임의의 하나에 의한 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한, 섹션 3 및/또는 섹션 5.1에 기재된 단백질 실시양태들 중 임의의 것을 포함하는 (또는 이것으로 본질적으로 구성되는) 제약 조성물 (및 이와 관련된 치료 방법)을 제공한다. 독자는 섹션 3 또는 섹션 5.1에 기재된 단백질의 모든 가능한 조합이 본 섹션에 기재된 병원성 세균 중 임의의 것에 의한 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 고려되는 것으로 생각할 수 있고, 모든 이같은 조합 각각은 본 발명의 별도의 실시양태를 형성한다. 그러나, 통상적으로 사용되는 약물에 대한 저항성이 발달 중이거나 발달된 병원성 세균 (예를 들어, 이의 균주), 예를 들어 MRSA 및 VRSA에 의한 인간에서의 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 인간 LRR 단백질 예컨대 인간 NOD 단백질 (예를 들어 인간 NOD1 또는 인간 NOD2) 또는 인간 TLR 단백질을 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 제약 조성물이 구체적으로 언급된다.

5.6 임상 질환

조성물, 특히 제약 조성물이 다수의 질환, 특히 인간 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다는 것이 본원의 개시 내용을 기초로 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 섹션 3 및/또는 섹션 5.1의 단백질 중 임의의 것을 포함하고/하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 제약 조성물이 하기의 감염성 질환 중 임의의 질환, 특히 인간에서의 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다:

탄저병, 세균성 수막염, 보툴리눔독소증, 브루셀라증, 캄필로박테르증, 고양이 할큄병, 콜레라, 디프테리아, 유행성 발진티푸스, 식품 매개 질병 예컨대 식중독, 임질, 고름딱지증, 레기오넬라증, 나병 (한센병), 렙토스피라병, 리스테리아증, 라임병, 유비저, MRSA 감염, 수막염, 노카르디아증, 백일해, 흑사병, 폐렴구균성 폐렴, 앵무새병, Q열, 록키산 홍반열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 이질, 매독, 파상풍, 트라코마, 결핵, 야생토끼병, 장티푸스, 발진티푸스, 요로 감염.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 감수성 환자 예컨대 인간에서의 기회 감염 (예를 들어, 낭성 섬유증 및/또는 면역억제된 인간에서의 감염)을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.

독자는 상기 섹션 3 또는 섹션 5.1의 단백질의 모든 가능한 조합이 상기 기재된 감염성 질환 중 임의의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 예컨대 제약 조성물에서 사용되는 것으로 개별적으로, 그리고 명확하게 고려되는 것으로 생각할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 상기 섹션 3 또는 섹션 5.1에 기재된 단백질을 포함하는 제약 조성물의 세균이 병리학적인 역할을 할 수 있는 질환의 치료 및/또는 예방에서의 용도가 제공된다. 이의 예로는 소화 궤양 질환, 및 기타 위장 질환 예컨대 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 크론병 및 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군 (IBS), 및 혈액 질환 예컨대 패혈증이 포함된다.

또다른 실시양태에서, 섹션 3 또는 섹션 5.1에 기재된 단백질을 포함하는 제약 조성물의 염증성 질환 또는 장애의 치료에서의 용도가 제공된다. 이의 예로는 관절염 장애 예컨대 건선성 관절염이 포함된다.

6. 실시예

하기의 비제한적인 실시예들에 의해 본 발명이 기술된다.

6.1 약어 목록

6.2 시판 시약

6.2.1 세균

하기의 세균 균주들을 ATCC로부터 구입하였다: 리스테리아 모노사이토게네스 (ATCC 7644), 바실루스 서브틸리스 (ATCC 6633), 엔테로코쿠스 파에칼리스 (ATCC 29212), 스타필로코쿠스 아우레우스 (ATCC 29213), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (ATCC 49619), 대장균 (ATCC 8739), 대장균 (ATCC 25922), 클레브시엘라 뉴모니아에 (ATCC 700603), 슈도모나스 아에루기노사 (ATCC 27853), 살모넬라 콜레라에수이스 (ATCC 13076), 스테노트로포모나스 말토필리아 (ATCC 17666), 박테로이데스 프라길리스 (ATCC 25285), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum) (ATCC 29148), 프레보텔라 인테르메디아(Prevotella intermedia) (임상 단리물), 유박테리움 렌툼(Eubacterium lentum) (ATCC 43055), 클로스트리디움 페르프린겐스 (ATCC 13124), 클로스트리디움 디피실레 (임상 단리물), 클로스트리디움 라모숨(Clostridium ramosum) (ATCC 25582), 펩토스트렙토코쿠스 아나에로비우스(Peptostreptococcus anaerobius) (ATCC 49031), 프로피오니박테리움 아크네스 (ATCC 25746).

6.2.2 기타물질

프로테오글리칸, 리포테이코산, 및 가열 살균 스타필로코쿠스 아우레우스는 모두 인비보젠(Invivogen)에서 구입하였다. 로다민-접합 팔로이딘은 시그마(Sigma)에서 구입하였다.

6.2.3 플라스미드

말초혈 림프구 라이브러리로부터의 여러 PCR 생성물을 조립함으로써 전장 NOD2 cDNA를 수득하고, pENTR/SD/D-Topo 벡터 (인비트로젠(Invitrogen)) 내로 클로닝하였다. NOD1을 코딩하는 cDNA를 인비트로젠으로부터 구입하였다 (pENTR221-Nod1). LRR 영역에 플랭킹된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 NOD1 및 NOD2의 LRR 도메인이 생성되었다; NOD1에 대해서는 Nod1LRRFwd: 5'-caccatgaacaaggatcacttccagttcacc-3' (서열 8) 및 Nod1LRRrev: 5'-tcagaaacagataatccgcttctcatc-3' (서열 9). NOD2에 대해서는, Nod2LRRFwd: 5'-caccatgaccatgccagctgcaccgggtgagg-3' (서열 10) 및 Nod2LRRrev: 5'-tcaaagcaagagtctggtgtccctgcagc-3' (서열 11). Nod2의 크론병-관련 3020insC 돌연변이체를 생성시키기 위해, 데옥시사이토신을 뉴클레오티드 위치 3020 (NM_022162) 내로 삽입하였다. 사용된 모든 cDNA의 통합성을 DNA 서열분석에 의해 확증하였다. 전장 단백질 또는 각각의 LRR 도메인을 코딩하는 cDNA를 지시된 용도를 위해 하기의 플라스미드 (인비트로젠) 내로 전달하였다: 293 세포에서의 발현 (pEF5/FRT/V5-Dest), 세균 발현 (pDEST17), 배큘로바이러스 어셈블리(assembly) (pDEST10).

6.2.4 항체

사용된 시판되는 1차 항체는 하기와 같았다: 알렉사(Alexa)-488, -568, 또는 -647에 접합된 양, 토끼, 및 마우스 2차 항체는 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes) (Leiden, The Netherlands)로부터의 것이었다. 토끼 또는 마우스에 대한 IR-표지 2차 항체는 록랜드 래버러토리즈(Rockland Laboratories) (West Grove, PA)로부터의 것이었다. 대장균으로부터 정제된 재조합 Nod2 LRR 도메인을 면역원으로 사용하여 유로제네텍(Eurogenetec)에 의해 토끼 항-NOD2 항체가 생성되었다. 재조합 LRR 칼럼을 사용하여 혈청을 친화력 정제하였다. 재조합 Nod2 또는 Nod1을 발현하는 세포주를 사용하여 웨스턴 블롯 및 면역형광 현미경검사에 의해 항체의 특이성을 테스트하였다.

6.3 Nod2 , Nod2 3020 insC , Nod1 및 이들 각각의 LRR 도메인을 발현하는 293 세포주

제조사의 권고를 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠)을 사용하여 Nod2, Nod2 3020insC, Nod1, Nod2 LRR, Nod2 3020insC LRR, Nod1 LRR을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드 (pEF5/FRT/V5-DEST)를 293 Flp-In 세포 (인비트로젠) 내로 형질감염시켰다. 안정적인 세포주를 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신에서 선별하였다. 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 각각의 단백질의 발현이 확증되었다.

6.3.1 면역형광

면역염색을 위해, 장 상피 세포를 유리 커버슬립 상에서 성장시키고, 3％ 파라포름알데하이드 (PFA)에서 20분 동안 고정시켰다. PFA-고정 세포에 5분 동안 PBS 내의 0.1％ 트리톤(Triton) X-100을 투과시켰다. 모든 항체 인큐베이션은 0.2％ BSA를 함유하는 PBS에서 수행되었다. 핵을 0.5 ㎎/㎖ 훽스트(Hoechst) (시그마)로 염색하고, 커버슬립을 프로-골드(pro-gold) 시약 (인비트로젠) 내에 마운팅하였다. 니콘(Nikon)의 이클립스(eclipse) 현미경에서 표준 대물 렌즈 및 필터 셋트로 영상을 취득하였다. 영상을 어도비(Adobe) 포토샵 6으로 처리하였다.

6.3.2 단백질 정제

NOD1, NOD2 및 NOD2-3020의 LRR 도메인을 코딩하는 상보적인 DNA 서열 (섹션 6.2.3에 기술됨)을 LR 재조합에 의해 게이트웨이(gateway) 기술을 사용하여 pDEST17 (인비트로젠)에 전달하였다. LRR 도메인을 대장균 로제타(Rossetta) (DE3) 세포 (노바젠(Novagen))에서 과발현시키고, 구아니딘-HCl (6M)에 의해 가용화시키고, 15000×g에서 회전시키고, Ni-NTA 및 하이로드(HiLoad) 16/60 수퍼덱스(Superdex) 200 크기-배재 칼럼 상에서의 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화하였다. 전장 NOD2 및 NOD2-3020 cDNA를 LR 재조합에 의해 pENTR/SD/D-Topo (인비트로젠)으로부터 pDEST10으로 옮긴 후, DH5αBac에서 형질전환시켜, 박미드(bacmid)가 생산되었다. 박-투-박(Bac-to-Bac) 배큘로바이러스 발현 시스템 (인비트로젠)으로부터의 프로토콜을 따라서, 재조합 바이러스를 수득하였다. 전장 NOD2 및 NOD2-3020insC의 정제를 위해, Hi5 세포가 있는 T-162 눈크(Nunc) 조직 배양 플라스크 20개를 72시간 동안 감염시켰다. 세포를 긁어 내고, 저온 PBS에서 세정하였다. 세포 펠렛을 25 ㎖의 0.5 M KCl, 50 mM 트리스, 10％ 글리세롤, 5 mM 메르캅토에탄올, 1 mM MgCl2, 0.1％ 트리톤 X100, 10 mM 이미다졸 및 프로티에이스 억제제 (완전형 EDTA-프리(free) (Roche)) (pH 7.0)에 재현탁시키고, 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 현탁액을 40초 동안 2회 초음파처리하고, 30분 동안 15000×g, 4℃에서 원심분리하였다. 혼합물을 순차적으로 Ni-NTA 칼럼 및 하이로드 16/60 수퍼덱스 200 크기-배제 칼럼 상에 로딩하였다. 정제된 단백질을 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화하였다.

6.4 항균 분석법

개별적인 배양물 내의 ATP의 정량을 기초로 배양물 내의 생육성 세균 세포의 개수를 결정하기 위해 박타이터-글로(BacTiter-Glo)™ 미생물 세포 생육력 분석법 (프로메가)가 사용되었다. 세균을 지시된 농도의 단백질과 함께 5×10⁵개의 세포/㎖로 접종하였다. 배양물을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 박타이터-글로 시약을 배지 내의 세균 세포에 직접 첨가하고, 페라스타(Pherastar) (BMG 사이언티픽(scientific))를 사용하여 발광을 정량하였다. 보고된 값들은 3회 이상의 이중으로 수행된 개별적인 실험들의 결과이다. 엑셀 (마이크로소프트(Microsoft))을 사용하여 IC50에 대한 표준 편차를 계산하였다. 표준 절차를 사용하여 호기성 또는 혐기성 배양으로 최소 억제 농도에 대한 값들을 결정하였다. 간략하게, 5×10⁵개의 세균을 지시된 농도의 LRR 도메인 또는 항생제 대조군을 함유하는 0.1 ㎖의 MHB 브로쓰 내로 접종하였다. 배양물을 20-24시간 동안 인큐베이션하고, 조망 거울의 보조로 시각 검사에 의해 세균 성장을 평가하였다. 시각적인 세균 성장을 완전히 억제한 최저 약물 농도로서 MIC가 결정되었다.

6.4.1 젠타마이신 보호 분석법

클로람페니콜 트랜스퍼레이스 (대조군), Nod2 또는 Nod2 3020insC를 발현하는 안정적인 293 FlpIn (인비트로젠) 세포주를 24웰 트랜스웰 배양 플레이트 (코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated) (Corning, NY))에서 배양하였다 (1×10⁵개/웰). 전면성장에 도달한 후, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에를 10:1의 MOI로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 세포를 행크스(Hanks) 용액으로 세정하고, 90분 동안 0.5 ㎎/㎖ 젠타마이신/행크스 용액의 존재 하에 배양하여, 모든 세포외 세균을 죽였다. 그후, 기계적인 파괴에 의해 세포 용해물을 수득하고, 용해물을 0.5 ㎖ MHB 브로쓰로 희석하고, 초콜릿 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에 하룻밤 동안 놓고, 다음날 콜로니를 카운팅하였다.

6.4.2 Nod2 LRR -회합 단백질의 친화력 정제 및 질량 분광법 단백질 확인

대장균 (ATCC 3556, ATCC 1655)을 MHB 브로쓰에 접종하고, 포화에 이를 때까지 세균을 성장시켰다. 세균을 원심분리 (2800×g)에 의해 수확하였다. 세포를 에멀시플렉스(emulsiflex) C5를 사용하여 용해시키고, 15000×g, 4℃에서 30분 동안 원심분리함으로써 세균 용해물을 분리하였다. 세균 펠렛을 회수하고, 트리톤 X100 (PBS 내 1％)에 재현탁시키고, 다시 30000×g에서 회전시켰다. 잔류 펠렛을 구아니딘-HCl (6M)로 가용화시키고, 젤 여과에 의해 탈염시켰다. 급속 희석에 의해 단백질을 리폴딩시키고, 지시된 바와 같은 재조합 NOD2-LRR 또는 NOD2-LRR-3020insC 도메인에 공유결합으로 연결된 활성화된 NHS 칼럼 상에 로딩하였다. 친화력-정제된 단백질들을 염 구배에 의해 칼럼으로부터 용출시키고, SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리하고, 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. 확인된 단백질 밴드를 젤로부터 절단하고, DTT로 환원시키고, 요오도아세트아미드로 알킬화시키고, 변형된 트립신으로 37℃에서 하룻밤 동안 소화시켰다. LC-ESI-MS/MS에 의한 분석 전에 1 ㎕의 100％ 포름산으로 펩티드를 산성화시켰다. LTQ-FT 질량 분광계 (써모 일렉트론(Thermo Electron) (Bremen, Germany))에 연결된 엑시겐트(Eksigent)/PAL HPLC 시스템 (악셀 셈라우(Axel Semrau) GmbH (Sprockhoevel, Germany))을 사용하여 나노-LC-MS 실험을 수행하였다. 펩티드 혼합물을 분석용 피코프릿(PicoFrit) 칼럼 (뉴 오브젝티브(New Objective) (Woburn, MA))에 직접 로딩하고, 200 nl/분으로 50분 동안 98％ 상 A (0.1％ 포름산 수용액) → 75％ 상 B (0.1％ 포름산, 80％ 아세토니트릴)의 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출시켰다. MS와 MS² 사이에서 자동적으로 전환되는 데이터-의존적 취득 방식으로 기구가 조작되었다. 이어서, 미처리(raw) 파일을 인-하우스(in-house) 마스코트(Mascot) 서버 (매트릭스 사이언스 리미티드(Matrix science Ltd.) (London, UK))를 사용하여 대장균 서열 라이브러리에 대해 검색하였다. 2개의 과오 절단을 허용하면서 효소로서 트립신을 선택하여 검색이 수행되었다. 카르복시메틸 (C)이 고정된 변형으로, 산화 (M)가 가변성 변형으로 선택되었다. ± 5 ppm의 펩티드 질량 허용도 및 ± 0.8 Da의 단편 질량 허용도로 데이터를 검색하였다. 2개 이상의 펩티드가 20을 초과하는 점수로 확인되면, 확인된 단백질이 허용되었다.

6.5 결과

수많은 독립적인 연구에서, Nod2의 LRR 도메인에서의 특정 SNP가 크론병의 발달에 대한 감수성 인자라는 것이 결정되었다. 위장관 내의 공생 세균에 대한 활발한 면역 응답은 크론병의 발병에서 주요 인자로 인식된다. 세균에 대한 숙주 응답에서의 Nod2 및 크론병-관련 SNP의 기능적인 역할을 평가하기 위해 하기의 실험들이 수행되었다.

6.5.1 결장에서의 Nod2 의 생체내 발현

위장관은 약 10¹³개의 세균의 거주지이고, 이들은 상피 세포의 단층에 의해 숙주로부터 분리된다. 생체 내에서의 Nod2 단백질의 발현을 Nod2의 LRR 도메인에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 평가하였다 (도 1). 면역조직화학적 분석에서, Nod2가 결장 상피에서 주로 발현되었음이 결정되었다. 내강의 공생 세균총과 직접 접촉된 상피의 꼭대기쪽 표면 상에서 강한 염색이 주로 발견되었다. 또한, 대식세포 및 단핵구-유사 세포의 점막하 염색이 상피 아래에서 관찰될 수 있다.

6.5.2 세균에 응답한 세포성 Nod2 국소화

배양된 SW480 장 상피 세포에서의 Nod2

상피에서의 Nod2의 기능을 연구하기 위해, SW480 장 상피 세포를 대장균과 함께 인큐베이션하고, 세포 내에서의 Nod2의 국소화를 면역형광에 의해 결정하였다 (도 2). 세균의 부재 하에 (SW480 대조군), Nod2는 배양된 세포의 사이토솔 내에서 주로 발견되었다. 대장균과의 인큐베이션 후, 세포 내의 약 1 ㎛ 길이의 종종 장방형인 반점 구조물에서 Nod2가 관찰될 수 있었다. 이러한 독특한 도메인에서의 Nod2의 관찰은 대장균 자체의 형상을 연상케 하고, 따라서 이러한 구조물 내의 Nod2의 확인을 명확하게 하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. Caco2 장 상피 세포로 실험을 반복하였다. 이러한 세포주는 정상적인 상피 층의 표현형을 더욱 빽빽하게 나타내어, 조밀한 접합부를 지니고, 상피통과(trans-epithelial) 저항성이 발달된다. 이러한 세포를 대장균과 함께 인큐베이션하면, 세균과의 공동배양 후 SW480 세포로 나타난 것과 유사한 반점 구조물에서 Nod2가 확인되었다 (도 3). 이러한 세포를 그람-음성 세균의 외막의 성분인 대장균 LPS에 대해 특이적인 항체로 공동-염색하였다. LPS와 Nod2 사이에 명확한 공동-국소화가 나타났고, 이는 확인된 Nod2 -양성 구조물이 세균이었음을 가리킨다.

배양된 세포의 세포질 내에서의 세균의 Nod2 양성 염색은 직접적인 상호작용, 또는 미확인 소포 구조물 내의 Nod2와 세균의 공동-국소화의 결과일 수 있다. Nod2와 대장균 간의 상호작용이 직접적이었다는 가설을 테스트하기 위해, Nod2로부터의 정제된 재조합 LRR 도메인을 대장균과 함께 인큐베이션하였다 (도 4). PBS 내에서의 대장균의 대조군 배양은 커버슬립의 전역에 걸쳐 균일하게 확산된 개별적인 세균들을 나타냈다 (상부 패널, 도 4). 그러나, Nod2 LRR 도메인과의 인큐베이션 후, 대장균이 응집하였고, 시험 시 잔해물이 관찰될 수 있었다. 이는 Nod2 LRR 도메인이 대장균과 직접 상호작용할 수 있다는 가설을 지지한다.

6.5.3 세균 감염

이전의 연구들에서 세균에 의한 감염에 대한 Nod2의 보호 효과가 실연되었다 ([Hisamatsu T, 2003]). 상기 제시된 데이터는 이러한 보호 효과가 세균에 대한 Nod2 LRR 도메인의 직접적인 상호작용으로 인한 것일 수 있음을 시사한다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, Nod2 또는 Nod2 3020insC LRR 도메인을 발현하는 안정적인 유사유전자형(congenic) 세포주를 구축하여, 단백질 발현 수준 및 기타 인자를 제어하였다. 배양된 세포에 배양물 내의 293 세포를 활발하게 감염시키는 것으로 공지된 병원체인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에를 접종하였다 ([Opitz B, 2004]). 그후, 젠타마이신-보호 세포내 세균을 평가할 수 있었다 (도 5). 감염된 대조군 세포로부터 세균 잔디가 관찰되었다. Nod2 LRR 도메인을 발현하는 세포에서 이러한 개수가 극적으로 감소되었다. 크론병-관련 Nod2 3020insC LRR 도메인을 발현하는 세포에서는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 명백한 보호가 관찰되지 않았다. 이러한 세포주에서 Card 및 Nacht 도메인이 발현되지 않았기 때문에, 이는 Nod2의 신호전달 기능이 감염으로부터 세포를 보호하는데 없어도 된다는 것을 나타낸다. 또한, Nod2 LRR 도메인이 세균 감염으로부터 세포를 보호하는데 충분하다.

6.5.4 시험관 내에서의 Nod2 및 LRR 도메인의 항균 활성

제시된 데이터는 Nod2 LRR 도메인이 직접 세균에 결합하고 감염으로부터 세포를 보호한다는 것을 나타낸다. LRR 도메인은 신호 전달에 대한 어떠한 능력도 보고되어 있지 않기 때문에, 본 발명가들은 Nod2 LRR 도메인이 항미생물 폴리펩티드이다는 가설을 연구하였다. Nod2, 크론병-관련 Nod2 3020insC 또는 Nod1으로부터의 증가하는 농도의 정제된 재조합 LRR 도메인을 호기성 그람-양성 및 그람-음성 세균의 패널과 함께 인큐베이션하고, ATP 농도를 모니터링함으로써 세균 성장을 평가하였다 (표 1). LRR 도메인에 대해 항미생물 활성이 실연될 수 있었다. 여러 관찰에서, 특정 세균에 대한 Nod2 및 Nod1 LRR 도메인의 특이성이 실연되었다. Nod2 LRR 도메인은 엔테로코쿠스 파에칼리스 및 스타필로코쿠스 아우레우스에 대해 Nod1 LRR보다 적어도 10배 더 강력하였다. Nod1 LRR 도메인은 일부 그람-음성 세균 예컨대 대장균 (ATCC8739) 및 클레브시엘라 뉴모니아에에 대해 Nod2보다 더 큰 효율을 나타냈다. 또한, Nod2 LRR 도메인은 리스테리아 모노사이토게네스를 제외한 모든 민감성 세균에 대해 Nod2 3020insC LRR 도메인보다 일반적으로 현저하게 더 강력하였다. 이는 크론병-관련 SNP가 항균 활성 면에서 부족하다는 것을 나타내고, 현재의 지식 상태의 맥락에서, 이것이 이러한 대립유전자를 보유하는 환자에서 크론병의 근본적인 원인이라는 것을 시사한다.

6.5.5 호기성 세균

6.5.6 혐기성 세균

위장관 내의 대다수의 세균은 혐기성이다. 따라서, Nod2 LRR 도메인의 항미생물 활성을 그람-양성 및 그람-음성 혐기성 세균의 패널에 대해 평가하였다 (표 2). 시프로플록사신은 테스트된 모든 균주에 대해 활성인 광범위한 항생제이다. 모든 균주에 대한 재조합 Nod2 LRR 도메인의 활성이 중량 (㎍/㎖) 기준으로 시프로플록사신에 필적하였다. 중요하게, 두 화합물의 분자량을 고려했을 때, Nod2 LRR 도메인은 테스트된 모든 세균에 대해 몰(molar) (mmole/㎖) 기준으로 시프로플록사신에 비해 약 25-200배 더 강력하다.

6.5.7 기타 LRR 도메인

Nod2 의 항균 메커니즘

Nod2에 대해 제안된 유일한 추정 리간드는 그람-양성 및 그람-음성 세균의 프로테오글리칸 코트에서 발견되는 MDP 모티프이다. 이러한 상호작용이 Nod2 LRR 항미생물 효과에 대한 개시 인자이면, 도메인을 이러한 모티프를 함유하는 세균 성분과 함께 예비-인큐베이션하는 것이 항균 활성을 억제할 것으로 예상될 것이다. 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 Nod2 LRR 활성을 사용하여 경쟁 분석법을 설정하였다. 재조합 LRR 도메인 또는 BSA (대조군)을 스타필로코쿠스 아우레우스 막의 다양한 성분과 함께 예비-인큐베이션한 후, 살아 있는 스타필로코쿠스 아우레우스에 첨가하고, 세균 생육력을 상기 표 1에서와 같이 평가하였다 (도 6). MDP 모티프를 함유하는 스타필로코쿠스 아우레우스 프로테오글리칸, 또는 리포테이코산은 Nod2 LRR 도메인의 항균 효과를 억제하지 않았다. 가열-살균 스타필로코쿠스 아우레우스만 Nod2 LRR 활성을 억제할 수 있었다. 이는 Nod2의 항균 효과에 대한 표적이 Nod2와 세균 프로테오글리칸의 상호작용에 비-의존적임을 가리키고, Nod2의 신호전달 기능 및 항균 활성이 별개의 세균 표적을 지닌다는 것을 시사한다.

6.5.8 그람-음성 세균 유출 펌프 돌연변이체에 대한 Nod2 활성

Nod2 LRR 도메인의 항균 활성에 대한 표적을 연구하였다. 활성은 세균의 외막에 대한 결합에 좌우되는 것으로 나타나지 않았다 (도 6). 따라서, Nod2, Nod1 및 Nod2 3020insC LRR 도메인에 대한 작용 메커니즘을 대장균, 슈도모나스 아에루기노사 또는 헤모필루스 인플루엔자에의 유출 펌프 돌연변이체를 사용하여 연구하였다 (표 3). 유출 펌프 돌연변이체는 세포내 분자를 원형질막 주위공간으로부터 외막을 가로질러 펌핑함으로써 세포내 분자의 농도를 감소시킨다. 테스트된 유출 돌연변이체 세균 중 2개 (대장균 및 헤모필루스 인플루엔자에)는 Nod2 및 Nod1의 LRR 도메인에 대한 감도에서의 현저한 증가를 나타냈다. 또한 이러한 2개의 세균은 야생형에 비해 Nod2의 크론병-관련 LRR 돌연변이체에 더욱 저항성이었다. 이는 LRR 도메인에 대한 표적이 세포내 물질이고, 크론병-관련 Nod2보다 야생형에 대해 더욱 감수성임을 시사한다.

6.5.9 질량 분광법에 의한 Nod2 항균 표적의 확인, 부분적 정제 및 가능성 확인

제시된 증거들은 Nod2가 자신의 LRR 도메인을 통해 세포내 세균 표적에 결합함으로써 직접적인 항균 활성을 지닌다는 것을 시사한다. 또한, 크론병-관련 Nod2 돌연변이 3020insC는 항미생물 활성이 부족하다. LRR 도메인의 항미생물 활성을 매개하는 Nod2 세균 표적을 확인하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 대장균을 프렌치 프레스, 세제 및 구아니디늄 HCl에 의해 순차적으로 분획화하고, 경쟁 분석법에 의해 평가하여, Nod2 LRR에 의한 스타필로코쿠스 아우레우스 살균을 억제한 분획을 확인하였다 (도 7). 대장균의 세제 불용성 막 분획으로부터 최초로 확인된 억제 분획을 구아니디늄 HCl에 용해시키고, 젤 여과에 의해 분획화하였다. 젤 여과로부터의 분획 5가 프로티네이스 K로 분획을 처리한 후 검출된 활성에 의해 나타나는 바와 같이 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 Nod2 LRR 항미생물 활성을 억제한 단백질을 함유하였다. 이러한 분획을 Nod2 LRR 친화력 칼럼 상에 로딩하였고, 회합된 단백질이 NaCl 구배에 의해 용출되었다 (도 8). 용출된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 밴드를 추출하고, 단백질을 질량 분광법에 의해 확인하였다. 주요 용출 밴드 (도 8, 패널 b, 밴드 H1)가 2개의 외막 단백질 (포린(porin))인 OmpF 및 OmpC를 함유하였다. 이러한 단백질들은 그람-음성 세균의 외막 상에서 발견되고, 세균의 원형질막 주위공간 내로의 펩티드의 진입을 허용한다 (참고문헌). 포린은 Nod2 LRR 도메인의 최초의 접촉 지점일 것이고, 이러한 도메인의 그람-음성 세균의 원형질막 주위공간 내로의 투과를 허용한다. 대장균의 유출 펌프 돌연변이체에 대한 LRR 도메인의 강화된 효율의 맥락에서 (표 3), 아마도 포린은 그 자체로서 표적이 아니지만, 세균 내로의 진입 지점으로서 작용함으로써 항미생물 메커니즘에서 수반될 것이다. 또한, 그람-양성 세균은 일반적으로 포린을 발현하지 않지만, 여전히 Nod LRR 도메인에 대해 감수성이고, 이는 포린이 Nod2 항균 활성의 궁극적인 표적이 아님을 시사한다.

추정 세포내 표적을 확인하기 위해, 대장균으로부터의 전체 세제-불용성 분획을 구아니디늄 HCl로 추출하고, 2개의 분획으로 분할하고, 분획들을 1) Nod2 LRR 도메인 친화력 칼럼 또는 2) Nod2 LRR 3020insC 도메인 친화력 칼럼 중 하나에 로딩하였다. 어느 한쪽 칼럼에 결합된 단백질을 SDS-PAGE에 이어서 질량 분광법에 의해 분석하였다 (도 9). 밴드 C3 및 E3 (도 9에서 지시된 밴드)에서 포린이 또다시 확인되었다. 표 4에서, Nod2 LRR 친화력 칼럼으로부터 용출된 밴드 E3 및 Nod2 LRR 3020insC 친화력 칼럼으로부터의 밴드 F3에서 확인된 모든 단백질이 열거된다. 두드러지게, 포린 (OmpC 및 OmpF)가 WT LRR 칼럼으로부터의 용출물에서 특이적으로 확인되었지만, 3020insC LRR 칼럼에서는 그렇지 않았다. 이는 크론병-돌연변이체가 세포내 세균 구획에 접근하지 않을 수 있음을 가리킨다. 표 5에서, WT 또는 3020insC 친화력 칼럼으로 특이적으로 확인된 모든 단백질이 열거된다. 지시된 바와 같이, OmpC 및 OmpF가 WT LRR 친화력 칼럼과 회합하는 것으로 명확하게 나타났다. 또다른 특정 단백질들이 또한 확인되었고, 이들 중 일부는 정상적인 대장균 성장에 필수적인 것으로 나타났다. 따라서, Nod2 LRR 항미생물 표적에 대한 여러 추정 후보물질이 확인되었다.

E3 및 F3은 도 9에 지시된 바와 같이 절단된 밴드를 가리킨다.

GuHCl로 추출된 대장균의 1％ 트리톤-불용성 분획으로부터 단백질들이 확인되었다. 지시된 밴드들은 도 3-9에서 확인된 것들과 상호관련된다.

7. 참고문헌 정보

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Leu His His Phe Pro Lys Arg Leu Ala Leu 115 120 125 Asp Leu Asp Asn Asn Asn Leu Asn Asp Tyr Gly Val Arg Glu Leu Gln 130 135 140 Pro Cys Phe Ser Arg Leu Thr Val Leu Arg Leu Ser Val Asn Gln Ile 145 150 155 160 Thr Asp Gly Gly Val Lys Val Leu Ser Glu Glu Leu Thr Lys Tyr Lys 165 170 175 Ile Val Thr Tyr Leu Gly Leu Tyr Asn Asn Gln Ile Thr Asp Val Gly 180 185 190 Ala Arg Tyr Val Thr Lys Ile Leu Asp Glu Cys Lys Gly Leu Thr His 195 200 205 Leu Lys Leu Gly Lys Asn Lys Ile Thr Ser Glu Gly Gly Lys Tyr Leu 210 215 220 Ala Leu Ala Val Lys Asn Ser Lys Ser Ile Ser Glu Val Gly Met Trp 225 230 235 240 Gly Asn Gln Val Gly Asp Glu Gly Ala Lys Ala Phe Ala Glu Ala Leu 245 250 255 Arg Asn His Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ser Asn Gly Ile 260 265 270 Ser Thr Glu Gly Gly Lys Ser Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gln Asn Thr 275 280 285 Ser Leu Glu Ile Leu Trp Leu Thr Gln Asn Glu Leu Asn Asp Glu Val 290 295 300 Ala Glu Ser Leu Ala Glu Met Leu Lys Val Asn Gln Thr Leu Lys His 305 310 315 320 Leu Trp Leu Ile Gln Asn 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Ser Leu Phe Ser 115 120 125 His Leu Thr Lys Leu Gln Ile Leu Arg Val Gly Asn Met Asp Thr Phe 130 135 140 Thr Lys Ile Gln Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu Glu Glu 145 150 155 160 Leu Glu Ile Asp Ala Ser Asp Leu Gln Ser Tyr Glu Pro Lys Ser Leu 165 170 175 Lys Ser Ile Gln Asn Val Ser His Leu Ile Leu His Met Lys Gln His 180 185 190 Ile Leu Leu Leu Glu Ile Phe Val Asp Val Thr Ser Ser Val Glu Cys 195 200 205 Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asp Leu Asp Thr Phe His Phe Ser Glu Leu 210 215 220 Ser Thr Gly Glu Thr Asn Ser Leu Ile Lys Lys Phe Thr Phe Arg Asn 225 230 235 240 Val Lys Ile Thr Asp Glu Ser Leu Phe Gln Val Met Lys Leu Leu Asn 245 250 255 Gln Ile Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Phe Asp Asp Cys Thr Leu Asn 260 265 270 Gly Val Gly Asn Phe Arg Ala Ser Asp Asn Asp Arg Val Ile Asp Pro 275 280 285 Gly Lys Val Glu Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu His Ile Pro Arg Phe 290 295 300 Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Glu Arg Val 305 310 315 320 Lys Arg Ile Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu 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Claims

항미생물제로서 사용하기 위한, 다수의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하는 단리된 단백질.
제1항에 있어서, 단백질의 C-말단이 LRR 도메인인 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 LRR 도메인이 독립적으로 하기 화학식 I의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 것인 단백질.
[화학식 I]

[식 중,
F1 및 F2는 독립적으로 잔기 1개 내지 30개의 연속 아미노산 서열이고;
x는 임의의 아미노산일 수 있고;
L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;
Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;
N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;
C는 Cys 또는 Ser이며;
Y = 0 또는 1이다].
제3항에 있어서, 각각의 LRR 내의 2개 이상의 L 잔기가 Leu인 단백질.
제4항에 있어서, 각각의 LRR 내의 3개 이상의 L 잔기가 Leu인 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 4개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 6개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항균성인 단백질.
제10항에 있어서, 그람(gram) 양성 세균에 대해 사용하기 위한 단백질.
제10항에 있어서, 그람 음성 세균에 대해 사용하기 위한 단백질.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서의 세균 감염의 치료를 위한 단백질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, NOD, TLR, CIITA로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질.
제14항에 있어서, NOD가 NOD1 또는 NOD2인 단백질.
제14항에 있어서, TLR이 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12, TLR13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
제16항에 있어서, TLR이 TLR2, TLR4 또는 TLR5인 단백질.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 직접적인 항미생물 활성을 자체적으로 지니는 단백질.
제18항에 있어서, 직접적인 항미생물 활성이 시험관내 조건 하에서 효과적인 단백질.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 이상의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하고, 항미생물제로서 사용하기 위한 것이며, 이때 단백질의 C-말단은 LRR 도메인이고, 각각의 LRR 도메인은 독립적으로 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
[화학식 I]

[식 중,
F1 및 F2는 독립적으로 잔기 1개 내지 30개의 연속 아미노산 서열이고;
x는 임의의 아미노산일 수 있고;
L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;
Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;
N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;
C는 Cys 또는 Ser이며;
Y = 0 또는 1이다].
제20항에 있어서, 각각의 LRR 내의 2개 이상의 L 잔기가 Leu인 단백질.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단백질을 포함하는 제약 조성물.
제20항에 있어서, 항미생물제로서 사용하기 위한 제약 조성물.
제22항 또는 제23항에 있어서, 감염에 대해 감수성인 숙주에서 세균 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
제24항에 있어서, 숙주가 인간과 같은 포유동물인 조성물.
제24항에 있어서, 인간이 크론병, IBD 또는 IBS와 같은 위장 질환을 앓고 있는 것인 조성물.
다수의 LRR (류신 풍부 반복) 도메인을 포함하는 단리된 단백질을 유효량으로 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서의 미생물 감염을 치료하는 방법.
제27항에 있어서, 단백질의 C-말단이 LRR 도메인인 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 각각의 LRR 도메인이 독립적으로 하기의 화학식 I의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 것인 방법.
[화학식 I]

[식 중,
F1 및 F2는 독립적으로 잔기 1개 내지 30개의 연속 아미노산 서열이고;
x는 임의의 아미노산일 수 있고;
L은 Leu, Ile, Val 또는 Phe일 수 있고;
Z는 NxL 또는 CxxL일 수 있고;
N은 Asn, Thr, Ser 또는 Cys이고;
C는 Cys 또는 Ser이며;
Y = 0 또는 1이다].
제29항에 있어서, 각각의 LRR 내의 2개 이상의 L 잔기가 Leu인 방법.
제29항에 있어서, 각각의 LRR 내의 3개 이상의 L 잔기가 Leu인 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 3개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 것인 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 4개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 것인 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 5개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 것인 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 6개 이상의 LRR 도메인을 포함하는 것인 방법.