CN111154678B - 马流产沙门氏菌驴源株及其在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用 - Google Patents
马流产沙门氏菌驴源株及其在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了马流产沙门氏菌驴源株及其在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用,属于生物疫苗领域。本发明所述的马流产沙门氏菌驴源株,命名为20180422.D.DE.X,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏编号为:CGMCC No.18342。本发明的马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X具有免疫原性好、培养特性好等优点,将该马流产沙门氏菌驴源株接种于沙门氏菌增菌液,培养后,用甲醛(终浓度0.2%)灭活后,制备成灭活疫苗。实验证明,使用本发明制备得到的灭活疫苗免疫小鼠,能够使小鼠免于强毒马流产沙门氏菌的攻击,且在驴体上免疫安全性良好。因此该疫苗具有安全、低剂量免疫等优点,是首个驴用马流产沙门氏菌灭活疫苗,可以用于预防由马流产沙门氏菌引起的驴副伤寒。
Description
技术领域
本发明涉及一种马流产沙门氏菌其在制备灭活疫苗中的应用,特别涉及一株自行分离得到的马流产沙门氏菌驴源株以及由该细菌株制备得到的驴副伤寒灭活疫苗。本发明属于生物疫苗领域。
背景技术
驴副伤寒是由马流产沙门氏菌(Salmonella abortus)引起的马属动物的一种传染病。临床特征是孕畜发生流产;公畜表现为睾丸炎、髻甲肿;幼驹主要表现为关节肿大、下痢,有时还见支气管肺炎。马流产沙门氏菌只对马属动物具有致病性,该菌属于革兰氏阴性菌,具有菌体抗原4、12,鞭毛第二相抗原H-enx。早在18世纪末19世纪初,欧美地区发生过大批马流产的现象,20世纪70年代末,我国华北、西北、东北等养马地区也陆续爆发马流产沙门氏菌病,并造成了比较严重的经济损失,该病全年都可发生,但主要发生于春秋两季,大多数表现为散发,有时呈地方流行性。
关于驴得马流产沙门氏菌病(驴副伤寒),我国很少报道,20世纪60年代,崔思烈曾报道由马流产沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌引起孕驴的流产,以及驴驹的腹泻和死亡,在分离的26株沙门氏菌中有19株鼠伤寒沙门氏菌和7株马流产沙门氏菌,在4例病料中,均为两种菌混合感染。2019年,H.Wang等报道在我国东海岸的流产驴群中分离到马流产沙门氏菌。以往驴的马流产沙门氏菌病的研究不被关注,国内和国际的相关研究并不多见,也不深入,是一种被忽视的传染病。近年来我国驴业市场发展迅速,各种驴肉、驴奶、阿胶等副产品供不应求,随着经济发展的需要,传统的农户散养驴已经逐步发展为集约化饲养的模式。驴本身是一种抗病能力很强的动物,所以人们普遍认为“驴不得病”,但是集约化养殖驴只饲养密度大,有利于传染病病原的传播和扩散,所以,集约化养殖的驴场面临与鸡场、猪场等饲养场同样的传染病流行的问题。很多驴场出现了一病病一群,一倒倒一地的情况,从2017年,我国华北、东北等地区驴出现了约30%的流产率,经过哈尔滨兽医研究所马传染病与慢病毒病创新团队对流产驴驹组织进行细菌分离鉴定,所有流产组织分离菌株,经鉴定后均为马流产沙门氏菌,而未检测到鼠伤寒沙门氏菌。马流产沙门氏菌主要通过污染的水和食物以及交配进行传播,母驴流产时造成环境污染,难以根除,会持续在驴群中传播。该病的发生直接影响了我国驴的存栏量、给养驴业造成严重的经济损失,而且该病还有蔓延的趋势,对我国驴业持续发展产生了潜在的威胁和巨大的影响,严重阻碍了我国驴业的发展。
本发明的发明人在2018年在山东省聊城市某驴场流产驴驹的心脏组织中分离到一株马流产沙门氏菌,经实验室鉴定为强毒株,命名为20180422.D.DE.X。利用20180422.D.DE.X株,开展了驴副伤寒灭活疫苗的研制开发工作,筛选培育出免疫原性良好的马流产沙门氏菌强毒20180422.D.DE.X株,选择了符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定,并获得了大量的试验数据,实验证明,使用本发明制备得到的灭活疫苗免疫小鼠,能够使小鼠免于强毒马流产沙门氏菌的攻击,且在驴体上免疫安全性良好。因此该疫苗具有安全、低剂量免疫等优点,是首个驴用马流产沙门氏菌灭活疫苗,可以用于预防由马流产沙门氏菌引起的驴副伤寒。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种免疫原性良好、效价稳定的马流产沙门氏菌驴源株;
本发明的目的之二是提供所述的马流产沙门氏菌驴源株在制备疫苗中的应用;
本发明的目的之三是提供一种由所述的马流产沙门氏菌驴源株制备得到的疫苗;
本发明的目的之四是提供所述的疫苗在制备预防驴副伤寒药物中应用。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明的发明人于2018年在山东省聊城市某驴场流产驴驹心脏组织分离到一株马流产沙门氏菌,经鉴定为强毒株,命名为20180422.D.DE.X。本发明的20180422.D.DE.X株是从发生典型马流产沙门氏菌感染导致妊娠母驴流产的胎儿心脏组织中分离获得的。经沙门氏菌显色培养基分离和实验室鉴定后可作为疫苗毒种,将马流产沙门氏菌20180422.D.DE.X株与马流产沙门氏菌强毒株C77-1进行毒力比较,均以相同剂量(5×105CFU/0.2ml)腹腔注射小鼠,攻毒6周龄18-21g Balb/c鼠时,7天内均可以引起100%小鼠死亡,因此,该菌株也属于强毒株。
本发明的一种马流产沙门氏菌驴源株,经实验室鉴定后,命名为20180422.D.DE.X,分类命名为马流产沙门氏菌(Salmonella abortus),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,其菌种保藏编号为:CGMCC No.18342,保藏日期为2019年7月26日。
本发明还提供了所述的马流产沙门氏菌驴源株在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用。
本发明的一种驴副伤寒灭活疫苗,其含有灭活后的本发明所述的马流产沙门氏菌驴源株。
在本发明中,优选的,所述的灭活是指将所述的马流产沙门氏菌驴源株采用0.2%v/v的甲醛在28℃、130rpm/min条件下灭活48小时后,涂布无抗LB平板,37℃,培养3天,无菌,则灭活合格,再继续灭活12小时,加入PBS清洗2遍。
在本发明中,优选的,所述的灭活疫苗中还含有佐剂。
在本发明中,优选的,所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE PETISA35佐剂。
在本发明中,优选的,所述的驴副伤寒灭活疫苗是由20%(v/v)的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂和0.2%(v/v)甲醛(HCHO)灭活的马流产沙门氏菌驴源株(20180422.D.DE.X株)乳化后得到。
在本发明中,乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂,除菌后可直接用于疫苗乳化制备;乳化前将灭活的同批沙门氏菌菌液混合,佐剂按照总体积20%的比例混合。
进一步的,本发明还提供了所述的灭活疫苗在制备预防由马流产沙门氏菌驴源株引起的疾病的生物制品中的用途。
特别地,所述的疾病为驴副伤寒。
附图说明
图1为沙门氏菌的分离与鉴定;
图2为马流产沙门氏菌的抗原构造分析;
其中:左图,O因子4、12混合血清,右图鞭毛第二相特异性抗血清H-enx;
图3为FliC基因的PCR扩增;
其中:M:marker;1、2、3:20180422.D.DE.X菌株扩增结果;4:阴性对照;
图4为20180422.D.DE.X的生长曲线;
图5为不同菌株攻毒后小鼠的生存曲线;
图6为不同代次灭活疫苗最小免疫剂量免疫下,攻毒后体重变化;
图7为不同代次灭活疫苗最低免疫剂量下免疫保护效果;
图8为不同剂量免疫后小鼠体重变化;
图9为不同剂量免疫,攻毒后小鼠体重变化;
图10为最低免疫剂量下耐受最大攻毒剂量。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
实施例1马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X的分离及培养鉴定
根据新生物制品申报要求,结合本发明获得的大量的试验数据,参照《中国兽药典》(2005年版),对制苗用毒种进行了鉴定,现将试行规程(草案)中毒种标准进行以下说明。
1毒种的分离及培养鉴定
制造本品用的毒种为驴源马流产沙门氏菌20180422.D.DE.X株,为本发明的发明人于2018年在山东省聊城市某驴场流产驴驹心脏组织分离到的一株马流产沙门氏菌。
将流产驴驹心脏组织,划线接种于在沙门氏菌显色培养基上,沙门氏菌呈现紫色。如图1。
利用沙门氏菌特异性血清,对沙门氏菌显色培养基上紫色菌落进行鉴定,与A-F群血清可发生凝集,为沙门氏菌;与O因子血清4、12发生凝集,为B群沙门氏菌;并与第二相H因子血清e,n,x发生凝集,证明是马流产沙门氏菌。如图2(左图,O因子4、12混合血清,右图,鞭毛第二相特异性抗血清H-enx)。
利用马流产沙门氏菌FliC基因特异性引物,对20180422.D.DE.X菌株进行PCR扩增和测序鉴定结果如图3;序列证实,该菌株为马流产沙门氏菌。
测定20180422.D.DE.X菌在沙门氏菌增菌液中的生长曲线,每小时进行细菌计数;结果表明,0-1h,细菌生长缓慢;1-7h处于对数生长期,7h以后处于平台期。如图4。
将马流产沙门氏菌20180422.D.DE.X株与C77-1进行毒力比较;均以相同剂量(5×105CFU/0.2ml)腹腔注射小鼠,攻毒6周龄18-21g Balb/c鼠时,7天内均可以引起100%小鼠死亡,如图5。因此,该菌株也属于强毒株。
本发明分离得到的马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号院中国科学院微生物研究所,其菌种保藏编号为:CGMCC No.18342,保藏日期为2019年7月26日。
2毒种(CGMCC No.18342)标准
2.1毒力
细菌代次为马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X株第2~10代。攻毒剂量为5×105CFU/0.2ml,攻毒程序是SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只,采取腹腔注射方式,注射后观察7天,每天记录小鼠死亡情况。
2.2免疫原性
将毒种接种于沙门氏菌增菌液进行培养,利用试管进行2倍梯度稀释,采用平板涂布法计数,用0.2%v/v的甲醛溶液灭活后,加MONTANIDE ISA35佐剂混合乳化制成灭活疫苗,用SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只,腹腔注射菌苗1×107CFU/0.2ml,未免疫菌苗小鼠8只作为对照组,19天后,免疫组与对照组小鼠均腹腔注射强毒株C77-1,攻毒剂量为5个最小完全致死剂量/0.2ml(5MLD/0.2ml),攻毒后观察15天,对照组7日内全部死亡,免疫组小鼠15天内,死亡不超过2只。
2.3毒种使用代次
利用显色培养基,划线连续传代,传至40代,以20、30、40代,以最小完全致死剂量(5×105CFU/0.2m)去攻毒8只小鼠,观察15天,死亡率分别为87.5%、75%、75%,结果表明,随着菌株传代以后,毒力有所降低,如表1。马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X不同代次(20、30、40代)菌株制备成灭活疫苗,以最低免疫剂量免疫8只小鼠,第19天,攻强毒C77-1,5MLD。未免疫对照组不进行免疫、仅进行攻毒。结果表明,不同代次免疫后,仅引起小鼠体重下降,均不引起小鼠死亡,如图6。免疫19天后,分别攻5MLD,免疫组的保护率均为87.5%;未免疫组,保护率为0%,如图7。为确保菌株的毒力及疫苗免疫原性,将菌株最高保存代次定为20代。
表1不同代次菌株的毒力鉴定
实施例2驴副伤寒灭活疫苗的制备
1灭活工艺
选择终浓度为0.1%v/v、0.15%v/v、0.2%v/v的甲醛溶液在4℃、28℃、37℃灭活,结果表明0.2%v/v甲醛在28℃灭活48小时,灭活效果完全。因而最终确定0.2%甲醛在28℃灭活48小时,涂布无抗LB平板,37℃,培养3天,无菌,则灭活合格,然后再继续灭活12h。利用PBS洗2遍,去除甲醛。
2乳化工艺
采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂与0.2%v/v甲醛(HCHO)灭活的马流产沙门氏菌驴源株20180422.D.DE.X混合乳化制成灭活疫苗,佐剂浓度为20%。利用PBS定容。
3半成品检验质量标准
3.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
3.3灭活检验
取灭活后的原菌液,涂布无抗LB平板100μl,37℃观察3天,应无菌生长。
4关于成品检验质量标准
4.1安全检验标准
将安全性试验合格的3批灭活疫苗,分别按照不同剂量106CFU/0.2ml、107CFU/0.2ml、108CFU/0.2ml分别腹腔注射小鼠,每天记录每组小鼠的平均体重。结果表明3组不同剂量免疫后,仅引起小鼠体重下降,免疫剂量越大,体重下降越明显,如图8,但不能引起小鼠死亡,如表2,说明不同剂量灭活疫苗对小鼠均安全。3批次灭活疫苗的小鼠安全性试验结果均一致,存活率均为100%。
表2不同免疫剂量的小鼠安全性检验
4.2效力检验标准的制定
4.2.1小鼠攻毒保护的最小免疫剂量
将安全性试验合格的3批灭活疫苗,按照不同剂量106CFU/0.2ml、107CFU/0.2ml、108CFU/0.2ml分别免疫6月龄balb/C小鼠8只,19天进行攻强毒C77-1,5MLD剂量。每天记录每组小鼠的平均体重变化及小鼠的死亡情况。结果表明,免疫剂量108CFU/0.2ml组,攻毒后体重下降最小,如图9。等于或者高于107CFU/0.2ml剂量时,免疫保护率均为100%,免疫剂量为106CFU/0.2ml时,免疫保护率略高于80%,如表3。因此以106CFU/0.2ml作为小鼠的最低免疫剂量。
表3不同免疫剂量的小鼠免疫效力检验
4.2.2免疫保护小鼠可抵抗的最高攻毒剂量试验
将安全性试验合格的灭活疫苗在最低免疫剂量(106CFU/0.2ml)下分别免疫8只小鼠,19天后,分别攻C77-1强毒5MLD、10MLD、15MLD、20MLD,观察15天。对照组(不免疫,攻毒5MLD的C77-1)7天内100%死亡,免疫组小鼠15天死亡只数分别为0、1、1、1只,如表4。死亡均不超过2只,如图10,均达到免疫保护的要求。因此,最低免疫剂量下,免疫小鼠可抵抗的最高攻毒剂量为不低于20MLD的C77-1强毒。
表4免疫小鼠抵抗的最高攻毒剂量试验
5免疫程序的确定
根据驴副伤寒的发病特点,以及灭活疫苗免疫的相关经验,免疫程序采用1年2次免疫,春秋两季各一次,间隔6个月。
6疫苗的保存期
本发明对实验室制备的灭活疫苗保存期在小鼠上进行了试验研究,将3批疫苗在2~8℃条件下保存1、3、6、7个月,在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力(以最小免疫剂量免疫)进行检测。结果显示,疫苗在2~8℃条件下保存7个月性状不发生明显变化,无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。最低免疫剂量下,攻5MLD的强毒C77-1,死亡均不超过2只,符合灭活疫苗的合格标准;对照组7天内100%死亡。考虑到疫苗在运输和使用过程中有可能造成效价损耗,本发明将疫苗的保存期暂定为2~8℃条件下暂定保存6个月。
实施例3驴副伤寒灭活疫苗(20180422.D.DE.X株)免疫剂量与佐剂比例安全性试验
按照20180422.D.DE.X株不同剂量大小,不同佐剂浓度进行分组,每组包括未孕母驴、怀孕母驴、公驴各8头,分别采用不同剂量免疫驴只(免疫组-1~3),佐剂的体积比例占25%,进行驴体安全性试验,观察实验驴只对疫苗的吸收和不良反应情况,如饮食、饮水等精神状况;体温变化情况;皮肤肿胀破溃情况;以及其他体征变化等。结果表明,免疫后1日:少数驴只食欲有所下降,但第2日便恢复正常;绝大多数驴只免疫后会出现一过性体温升高,但不超过39℃,1~3日内恢复正常;皮肤观察结果表明,免疫组-1(1×109CFU/ml)和免疫组-2(5×108CFU/ml)的个别驴只(3~5头)出现注射部位的破溃,抗生素治疗后1星期恢复健康;绝大多数驴只,包括免疫组-3(2.5×108CFU/ml)的驴只没有出现破溃情况,大部分驴只会在免疫部位出现拳头大小的肿胀,待1-2周后,随着疫苗被驴体逐渐吸收而恢复正常。
一般疫苗免疫后出现的肿胀属于正常现象,有经验的兽医注射可降低肿胀的发生率。而破溃现象容易造成创口的感染,应尽量避免。因此,为了解决上一轮试验中出现的破溃情况,我们将疫苗中佐剂的体积比例下调至20%,同时疫苗中细菌含量被稀释,浓度随之下降,分别为免疫组-4和免疫-5,见表5。试验结果表明,此轮试验驴只没有发生破溃的情况,这说明降低佐剂工作浓度到20%,可以有效地避免破溃的发生。此外,通过一个月的观察,上述两轮试验均未引起怀孕母驴的流产;也没有出现任何其他的不良反应症状。见表5。因此,免疫组-3、免疫组-4、免疫组-5的免疫剂量与佐剂的配比对驴体均是安全的。
表5不同剂免疫剂量与佐剂比例在驴体的安全性试验
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.马流产沙门氏菌(Salmonella abortus)驴源株,命名为20180422.D.DE.X,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为:CGMCC No.18342。
2.权利要求1所述的马流产沙门氏菌在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用。
3.一种驴副伤寒灭活疫苗,其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的马流产沙门氏菌驴源株。
4.如权利要求3所述的灭活疫苗,其特征在于所述的灭活是指将权利要求1所述的马流产沙门氏菌驴源株采用0.2%v/v的甲醛在28℃、130rpm/min条件下灭活48小时后,涂布无抗LB平板,37℃,培养3天,无菌,则灭活合格,再进行灭活12小时,加入PBS清洗2遍。
5.如权利要求3所述的灭活疫苗,其特征在于所述的灭活疫苗中还含有佐剂。
6.如权利要求5所述的灭活疫苗,其特征在于所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDE ISA35佐剂。
7.权利要求3-6任一项所述的灭活疫苗在制备预防由马流产沙门氏菌引起的疾病的生物制品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述的疾病为驴副伤寒。
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CN108220183A (zh) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | 新疆农业大学 | 一株马流产沙门氏菌菌株smxj-97及其在马流产沙门氏菌疫苗中的应用 |
CN108218965A (zh) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | 新疆农业大学 | 一种马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的制备方法和应用 |
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2020
- 2020-01-14 CN CN202010036541.5A patent/CN111154678B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108220183A (zh) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | 新疆农业大学 | 一株马流产沙门氏菌菌株smxj-97及其在马流产沙门氏菌疫苗中的应用 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Abortion in donkeys associated with Salmonella abortus equi infection;H Wang,et al;《Equine Vet J》;20190410;全文 * |
TLR-5 agonist Salmonella abortus equi flagellin FliC enhances FliC-gD-based DNA vaccination against equine herpesvirus 1 infection;Zhao, YN,et al;《ARCHIVES OF VIROLOGY》;20190531;全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111154678A (zh) | 2020-05-15 |
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