CN111793140A - 一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途，属于食用菌有效成分制备领域。其黑木耳寡糖是由黑木耳干燥子实体经快速均质结合酶法提取，挤压过滤及除蛋白，离子交换层析获得。该制备方法缩短了提取时间、减少了试剂用量、节约了能源、提高了溶解性，并且采用的挤压过滤方法适用于胶质含量较高的粘稠溶液的分离；同时该黑木耳寡糖具有保护肝细胞氧化损伤的功能，可用于制备保肝、护肝辅助药品、保健食品，为黑木耳深加工产品开发提供基础数据，具有重要的经济和市场价值。

Description

一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途，属于天然产物领域。
背景技术
肝脏是人体腹腔内最大的代谢器官，起着调节免疫耐受、合成蛋白、维护机体内环境平衡的作用。我国每年死于肝脏疾病的患者超过40万的患者，而肝损伤是多种肝病共有的生理状态。熬夜、劳累、醉酒、病毒、药物、遗传等均是引发肝损伤的原因，但是各种诱因引发得肝损伤均会伴随氧化应激、脂质过氧化物堆积等过氧化状态。黑木耳是我国主要的食用菌品种，年生产量及消费量均在食用菌中位居前列。黑木耳多糖是黑木耳重要的活性成分，具有降血糖、降血脂、增强免疫、抗凝血等多种生物活性，也发现其具有保护卡介苗引起的免疫性肝损伤，但是并不清楚多糖结构特征及作用通路。
此外，黑木耳多糖的提取制备方法以热水提取最为简单也最常使用，但存在提取时间长、所用溶剂量大、高温易破坏多糖结构等缺点(魏红.黑木耳多糖的提取工艺[J].食品研究与开发，2010，05：117～120.)。而且，黑木耳多糖大部分为胶质成分，水提物粘稠度高亦被称为“非牛顿流体”，因此在提取过程中也常加入酸、碱及生物酶辅助提取，以提高黑木耳流动性。但是，酸、碱会破坏多糖结构，生物酶的加入也使提取条件受到了限制，只能在酶的最适温度、pH范围内进行，而且后续分离纯化时需要将其灭活、去除，酶制剂费用较高(李啸.响应面法优化酶法提取黑木耳活性多糖的条件[J].安徽农业科学，2010，33：475～478.)；超声波辅助提取噪音较大(徐秀卉.超声波法提取黑木耳多糖的工艺[J].药学与临床研究，2011，2(19)：189～190.)；而微波辅助提取受设备限制，提取量较小(朱磊.响应面法优化微波辅助提取黑木耳多糖工艺研究[J].中国食品学报，2009，02：58～65.)。上述现有技术均不能满足该类产品产业化开发及生产的大量需求。
发明内容
本发明是针对现有研究及技术的不足，旨在提供一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及其制备方法和用途。
本发明所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖，该黑木耳寡糖是为β型吡喃糖，由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成，分子量范围6.882×103～22.684×103Da。
所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的制备方法，是该黑木耳寡糖由黑木耳干燥子实体经快速均质结合酶法提取，挤压过滤及除蛋白，离子交换层析获得。
上述制备方法具体步骤如下：
a、对黑木耳干燥子实体进行粉碎，过40目筛，形成黑木耳干燥子实体粉末，将黑木耳干燥子实体粉末装入均质机中，按料液比1:30～1:100加入去离子水，均质5～20min，加10mg/mL果胶酶溶液，使果胶酶的质量为黑木耳干燥子实体粉末的0.4％，形成黑木耳酶提取液，对黑木耳酶提取液进行挤压过滤，制备成黑木耳过滤液，在80～100℃温度下将黑木耳过滤液浓缩至原有体积1/2～1/3后，冷却至室温，加3～4倍浓缩后黑木耳过滤液体积的无水乙醇，形成混合液1，在4℃温度下，将混合液1静置12h，以6000～10000r/min转速进行离心，离心时间5～10min，离心后挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体粗多糖；
b、加入纯净水，将黑木耳子实体粗多糖配制成5mg/mL溶液，加入氯仿正丁醇混合溶液，磁力搅拌，离心分层，提取上层溶液，重复加入氯仿正丁醇混合溶液1次，离心，取上清液进行减压浓缩至原体积1/2～1/3，加入浓缩后体积3～4倍的无水乙醇，4℃温度下静置12h，以6000～10000r/min转速进行离心，离心5～10min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体多糖；
c、黑木耳子实体多糖加去离子水溶解，定容，上样DEAE52纤维素柱层析，用去离子水洗脱，流速5mL/3min，每管收集5mL，苯酚硫酸法测定各管糖含量，根据各管糖含量收集洗脱峰，获得黑木耳寡糖。
在一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的制备方法中，所述的挤压过滤采用单螺杆挤压机，单螺杆挤压机的模孔直径为8～16mm、挤压机套筒温度为60～100℃、螺杆转速为160～260r/min。
上述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖在制备保健食品、药品中的用途。
一种可用于肝细胞氧化损伤的保健食品、药品组合物，所述保健食品、药品组合物中含有权利要求1～3所述的黑木耳寡糖成分。
上述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的保健食品、药品组合物中，所述保健食品、药品组合物的剂型可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。
本发明积极效果在于：首次从黑木耳子实体中获得了一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途在制备保健食品、药品中的用途；并在该黑木耳寡糖制备过程中采用了黑木耳干燥子实体经快速均质结合酶法提取，挤压分离及除蛋白、离子层析的提取分离方法，缩短了提取时间、减少了试剂用量、节约了能源、提高了溶解性，并且采用的挤压过滤方法适用于胶质含量较高的粘稠溶液的分离；同时公开了该黑木耳寡糖可通过调控PI3K-akt信号通路保护肝细胞氧化损伤的功能活性，可用于制备保肝、护肝辅助药品、保健食品，为黑木耳深加工产品开发提供基础数据，具有重要的经济和市场价值。
附图说明
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步说明：
图1为本发明黑木耳寡糖DEAE52洗脱曲线；
图2为本发明黑木耳寡糖高效凝胶渗透色谱洗脱曲线；
图3为本发明黑木耳寡糖单糖组成分析；
图4为本发明黑木耳寡糖的红外光谱；
图5为本发明黑木耳寡糖对氧化损伤HepG2细胞保护作用；
图6为本发明黑木耳寡糖对氧化损伤HepG2细胞形态影响；
图7为本发明黑木耳寡糖对HepG2细胞超氧化物歧化酶活性影响；
图8为本发明黑木耳寡糖对HepG2细胞过氧化氢酶活性影响；
图9为本发明黑木耳寡糖对HepG2细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性影响；
图10为本发明黑木耳寡糖对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实施例1：
1、对黑木耳干燥子实体进行粉碎，过40目筛，形成黑木耳干燥子实体粉末，将黑木耳干燥子实体粉末装入均质机中，按料液比1:80加入去离子水，均质10min，加10mg/mL果胶酶溶液，使其酶的质量为黑木耳干燥子实体粉末的0.4％，50℃水浴锅中恒温加热反应1小时，再将烧杯放置于90℃水浴中1小时，灭活果胶酶活性，进行挤压过滤。挤压过滤采用单螺旋杆挤压机，挤压机模孔的直径为16mm、挤压机套筒的温度60℃、螺杆转速240r/min。90℃下黑木耳过滤液将浓缩至原有体积1/3，冷却至室温，加3倍体积无水乙醇，4℃静置12h，10000r/min，离心5min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体粗多糖。
2、黑木耳子实体粗多糖配制成5mg/mL溶液，加入氯仿正丁醇混合溶液，磁力搅拌，离心分层，提取上层溶液，重复加入氯仿正丁醇混合溶液1次，离心，取上清液进行减压浓缩至原体积1/2，加入4倍无水乙醇，4℃静置12h，10000r/min，离心5min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体多糖。
3、黑木耳子实体多糖加去离子水溶解，定容，上样DEAE52纤维素柱层析(4.0×30cm)，去离子水洗脱，流速5mL/3min，每管收集5mL。苯酚硫酸法测定各管糖含量，根据各管糖含量收集洗脱峰，如图1所示，获得黑木耳寡糖，继续将黑木耳寡糖进行凝胶渗透色谱分析(TSK-gelG-3000PWXL色谱柱(7.8×300mm))，色谱条件：色谱柱：DionexTMCarboPacTMPA20。流动相：A相：ddH2O；B相：200mMNaOH；C相：200mMNaOH/500mMNaAC。流速：0.5mL/min。分子量以lgMw＝7.831-0.228t+计算，获得平均分子量为16.190kDa的黑木耳寡糖，如图2所示。红外光谱检测黑木耳寡糖为β型吡喃糖，取2mg黑木耳寡糖通过含有1MHCl的甲醇水解，水解产物通过2MTFA水解后，水解产物通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后，产物经CompassC18column(250×4.6mm)色谱柱分离，HPLC分析，UV245nm检测洗脱产物，结果如图3所示。结果表明，黑木耳寡糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，并含有少量的岩藻糖、阿拉伯糖、木糖。
实施例2：
1、对黑木耳干燥子实体进行粉碎，过40目筛，形成黑木耳干燥子实体粉末，将黑木耳干燥子实体粉末装入均质机中，按料液比1:100加入去离子水，均质5min，加10mg/mL果胶酶溶液，使其酶质量为黑木耳干燥子实体粉末的0.4％，50℃水浴锅中恒温加热反应1小时，再将烧杯放置于100℃水浴中1小时，灭活果胶酶活性，进行挤压过滤。挤压过滤采用单螺旋杆挤压机，挤压机模孔的直径8mm、挤压机套筒的温度80℃、螺杆转速160r/min。100℃下黑木耳过滤液将浓缩至原有体积1/2，冷却至室温，加3倍体积无水乙醇，4℃静置12h，6000r/min，离心10min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体粗多糖。
2、黑木耳子实体粗多糖配制成5mg/mL溶液，加入氯仿正丁醇混合溶液(体积比4:1)，磁力搅拌，离心分层，提取上层溶液，重复加入氯仿正丁醇混合溶液(体积比4:1)1次，离心，取上清液进行减压浓缩至原体积1/2，加入3倍无水乙醇，4℃静置12h，6000r/min，离心10min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体多糖。
3、黑木耳子实体多糖加去离子水溶解，定容，上样DEAE52纤维素柱层析(4.0×30cm)，去离子水洗脱，流速5mL/3min，每管收集5mL。苯酚硫酸法测定各管糖含量，根据各管糖含量收集洗脱峰，如图1所示，获得黑木耳寡糖，继续将黑木耳寡糖进行凝胶渗透色谱分析(TSK-gelG-3000PWXL色谱柱(7.8×300mm))，色谱条件：色谱柱：DionexTMCarboPacTMPA20。流动相：A相：ddH2O；B相：200mMNaOH；C相：200mMNaOH/500mMNaAC。流速：0.5mL/min。分子量以lgMw＝7.831-0.228t+计算，获得平均分子量为22.684×103Da的黑木耳寡糖，如图2所示。红外光谱检测黑木耳寡糖为β型吡喃糖，取2mg黑木耳寡糖通过含有1MHCl的甲醇水解，水解产物通过2MTFA水解后，水解产物通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后，产物经CompassC18column(250×4.6mm)色谱柱分离，HPLC分析，UV245nm检测洗脱产物，结果如图3所示。结果表明，黑木耳寡糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，并含有少量的岩藻糖、阿拉伯糖、木糖。
实施例3：
1、对黑木耳干燥子实体进行粉碎，过40目筛，形成黑木耳干燥子实体粉末，将黑木耳干燥子实体粉末装入均质机中，按料液比1:30加入去离子水，均质20min，加10mg/mL果胶酶溶液，使其酶质量为黑木耳干燥子实体粉末的0.4％，50℃水浴锅中恒温加热反应1小时，再将烧杯放置于80℃水浴中1小时，灭活果胶酶活性，进行挤压过滤。挤压过滤采用单螺旋杆挤压机，挤压机模孔直径16mm、挤压机套筒温度100℃、螺杆转速260r/min。80℃下黑木耳过滤液将浓缩至原有体积1/3，冷却至室温，加4倍体积无水乙醇，4℃静置12h，8000r/min，离心8min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体粗多糖。
2、黑木耳子实体粗多糖配制成5mg/mL溶液，加入氯仿正丁醇混合溶液(体积比4:1)，磁力搅拌，离心分层，提取上层溶液，重复加入氯仿正丁醇混合溶液(体积比4:1)1次，离心，取上清液进行减压浓缩至原体积1/3，加入4倍无水乙醇，4℃静置12h，8000r/min，离心8min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体多糖。
3、黑木耳子实体多糖加去离子水溶解，定容，上样DEAE52纤维素柱层析(4.0×30cm)，去离子水洗脱，流速5mL/3min，每管收集5mL。苯酚硫酸法测定各管糖含量，根据各管糖含量收集洗脱峰，如图1所示，获得黑木耳寡糖，继续将黑木耳寡糖进行凝胶渗透色谱分析(TSK-gelG-3000PWXL色谱柱(7.8×300mm))，色谱条件：色谱柱：DionexTMCarboPacTMPA20。流动相：A相：ddH2O；B相：200mMNaOH；C相：200mMNaOH/500mMNaAC。流速：0.5mL/min。分子量以lgMw＝7.831-0.228t+计算，获得平均分子量6.882×103的黑木耳寡糖，如图2所示。红外光谱检测AHP-0为β型吡喃糖，取2mg黑木耳寡糖通过含有1MHCl的甲醇水解，水解产物通过2MTFA水解后，水解产物通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后，产物经CompassC18column(250×4.6mm)色谱柱分离，HPLC分析，UV245nm检测洗脱产物，结果如图3所示。结果表明，黑木耳寡糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，并含有少量的岩藻糖、阿拉伯糖、木糖。
通过以下试验证明本发明一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖及制备方法和用途：
试验例1：
将处于对数生长期的细胞消化为细胞悬液，调整细胞浓度为4×104个/mL，铺板96孔板每孔100μL，5％浓度CO2培养箱培养24h。吸去培养基，按实验分组分别加入相应培养液100μL。实验分为6组，空白对照组加入无血清培养基；实验组加入分别含125、250、500和1000μg/mL的黑木耳寡糖及0.7mmol/LH2O2的完全培养液；模型对照组加入含0.7mmol/LH2O2的完全培养液，每组设6个重复。5％浓度CO2培养箱培养48h，吸弃含药培养液，加入100μL含有10％CCK-8的新鲜无血清培养基，孵育1h。酶标仪490nm检测各孔吸光度，并计算各组IC50。
试验例2：
选取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，接种于6孔板中，培养箱培养24h。分别以浓度125、250、500和1000μg/mL的黑木耳寡糖与0.7mmol/LH2O2同时处理HepG2细胞24h。弃去培养基，DPBS洗涤3遍。加70％冰乙醇，4℃固定15min。DPBS洗3遍，1％结晶紫溶液室温染色10min后DPBS再次洗涤3遍。适宜放大倍数镜检并拍照。
试验例3：
将对数生长期的HepG2细胞以2×106个/mL接种于6孔板，培养24h后，处理条件同试验例1。收集培养液并重悬细胞，根据制造商提供的实验方案，使用市售试剂盒(T-SOD、CAT、GSH-Px检测试剂盒)，分别测量细胞上清液中的抗氧化酶水平。实验结果使用酶联免疫酶标仪在不同吸光度下测量数值表示。每组数据设置3个重复对照孔。
试验例4：
将处于对数生长期的HepG2细胞传代至10cm无菌培养皿，贴壁培养24h。胰酶消化，离心收集细胞。实验分6组，分别为实验对照组，损伤模型组(0.7mmol/L过氧化氢)和不同浓度黑木耳寡糖(125、250、500和1000μg/mL)给药实验组。按组别分别加入对应培养液培养24h后，弃去培养基，预冷DPBS洗涤2次。胰酶消化细胞，加1mL含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，期间不时振动离心管，以便裂解完全。12000rpm/min，4℃离心10min，上清用于测定蛋白含量。采用BCA试剂盒测定蛋白含量，将样品与Lodaing Buffer混合，95℃加热5min以变性蛋白。将变性蛋白分装后-20℃保存。根据不同蛋白分子量大小，选择不同密度预制胶，电泳液使用超纯水现用现制。取上述变性蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为恒压110V、75min，直至溴酚蓝指示染液距离凝胶低端1cm左右停止电泳，转膜。转膜后，立即将PVDF膜放入TBST缓冲液中漂洗1～2min，洗去残留液体。将PVDF膜置于5％BSA中，摇床速度10rpm/min，4℃条件下封闭60min。将封闭后的PVDF膜完全浸泡在一抗稀释液中(按1：1000比例稀释)中。摇床转速2rpm/min，4℃避光孵育过夜。镊子取出PVDF膜后TBST缓冲液漂洗4次，5min/次。洗涤后将PVDF膜置于二抗辣根过氧化物酶(HRP)中，4℃避光孵育60min。TBST漂洗4次，每次5min，摇床转速4rpm/min。二抗孵育完成后，取出PVDF膜，TBST溶液洗涤3次，5min/次。根据化学发光试剂盒说明书，将A、B液按体积比1:1避光混合。PVDF膜置于ChemiDocXRS(Bio-Rad)仪器内，将混合后的发光试剂均匀的滴加于PVDF膜上，室温避光反应2min，选择信号累计模式，凝胶成像仪自动曝光，保存图片。
上述抗氧化酶酶活性检测及活性氧生成实验结果如图5～图10所示，当黑木耳寡糖的浓度为0.25～1.0mg/mL时，通过调控PI3k-akt细胞信号通路抑制氧化损伤肝细胞的死亡，并提高氧化损伤肝细胞抗氧化酶活性，对肝细胞的氧化损伤具有保护作用。
本发明实施方式说明到此结束。

Claims (7)

1.一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖，其特征在于，该黑木耳寡糖是为β型吡喃糖，由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成，分子量范围6.882×103～22.684×103Da。
2.根据权利要求1所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的制备方法，其特征在于：该黑木耳寡糖由黑木耳干燥子实体经快速均质结合酶法提取，挤压过滤及除蛋白，离子交换层析获得。
3.根据权利要求2所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的制备方法，其特征在于：上述制备方法具体步骤如下：
a、对黑木耳干燥子实体进行粉碎，过40目筛，形成黑木耳干燥子实体粉末，将黑木耳干燥子实体粉末装入均质机中，按料液比1:30～1:100加入去离子水，均质5～20min，加10mg/mL果胶酶溶液，使果胶酶的质量为黑木耳干燥子实体粉末的0.4％，形成黑木耳酶提取液，50℃水浴锅中恒温加热反应1小时，再将烧杯放置于90℃水浴中1小时，灭活果胶酶活性，对黑木耳酶提取液进行挤压过滤，制备成黑木耳过滤液，在80～100℃温度下将黑木耳过滤液浓缩至原有体积1/2～1/3后，冷却至室温，加3～4倍浓缩后黑木耳过滤液体积的无水乙醇，形成混合液1，在4℃温度下，将混合液1静置12h，以6000～10000r/min转速进行离心，离心时间5～10min，离心后挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体粗多糖；
b、加入纯净水，将黑木耳子实体粗多糖配制成5mg/mL溶液，加入氯仿正丁醇混合溶液，磁力搅拌，离心分层，提取上层溶液，重复加入氯仿正丁醇混合溶液1次，离心，取上清液进行减压浓缩至原体积1/2～1/3，加入浓缩后体积3～4倍的无水乙醇，4℃温度下静置12h，以6000～10000r/min转速进行离心，离心5～10min，挥发残余乙醇，冷冻干燥，干燥粉末即为黑木耳子实体多糖；
c、黑木耳子实体多糖加去离子水溶解，定容，上样DEAE 52纤维素柱层析，用去离子水洗脱，流速5mL/3min，每管收集5mL，苯酚硫酸法测定各管糖含量，根据各管糖含量收集洗脱峰，获得黑木耳寡糖。
4.根据权利要求2和3所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的制备方法，其特征在于：所述的挤压过滤采用单螺杆挤压机，单螺杆挤压机的模孔直径为8～16mm、挤压机套筒温度为60～100℃、螺杆转速为160～260r/min。
5.根据权利要求1～3所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖在制备保健食品、药品中的用途。
6.一种可用于肝细胞氧化损伤的保健食品、药品组合物，其特征在于：所述保健食品、药品组合物中含有权利要求1～3所述的黑木耳寡糖成分。
7.根据权利要求6所述的一种保护肝细胞氧化损伤的黑木耳寡糖的保健食品、药品组合物，其特征在于：所述保健食品、药品组合物的剂型可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。
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