CN103772522A - 高分子乳化剪切提取黑木耳多糖的方法 - Google Patents

Abstract

一种高分子乳化剪切提取黑木耳多糖的方法，其特征在于采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，通过单因素及其响应面优化方法，得到提取的最佳工艺条件。所述的方法为：首先取黑木耳超微粉体与水质量比1:20～1:140混合，在温度20～100℃水浸泡，浸泡时间为30～60min。用高分子乳化剪切技术机A～G档高速剪切1～6min，剪切离心后，得到上清液与沉淀物，取上清液，浓缩、醇沉、过滤干燥得到黑木耳多糖粉。本发明能够有效地提高黑木耳多糖的溶出率，具有反应时间短、反应条件适宜、细胞壁破碎彻底、得率高的优点。经研究发现，利用这种方法提取木耳多糖，得率有了明显的提高，较超声波辅助萃取法提高了5～10%，微波辅助提取法提高了10～15%，水浴浸提法提高了16%左右。

Description

高分子乳化剪切提取黑木耳多糖的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种高分子乳化剪切提取黑木耳多糖的方法。 

（二）背景技术

一、黑木耳 

黑木耳又称木耳，光木耳。真菌学分类属担子菌纲，木耳目，木耳科。色泽黑褐，质地柔软，味道较好，营养丰富。对缺铁性贫血有较好的的疗效，具有很多药用功效。且原料来源广泛、价格便宜，是天然的植物资源。木耳生长于栎、杨、榕、槐等120多种阔叶树的腐木上，易于栽培。木耳由以东北产木耳为佳，是我国比较重要的大型真菌。黑木耳具有抗氧化、抗衰老、降血脂、美容护肤等生物学功能。因此可应用于医药、食品、化妆品等行业。 

黑木耳细胞壁主要由几丁质和P-葡聚糖组成,质地坚韧,极难被人体所消化,因此细胞壁内的多糖类物质无法出来，被人体消化吸收，这样黑木耳多糖就无法发挥其功效，直接被排出体外,因而对黑木耳进行精深加工就必须进行破壁处理，破壁可使黑木耳细胞内的功能性成分从细胞中出来，溶出于水中，提高黑木耳的消化吸收率。破碎细胞壁的方法较多，本发明将采用一种新方法-高速剪切分散技术来进行破壁处理。 

二.黑木耳多糖 

黑木耳多糖是从木耳子实体中得到的多糖，经预处理后得到的。木耳中含有较多的酸性粘多糖，粘多糖是由L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖等组成的，且呈灰白丝状，较难溶。Sone等人从黑木耳子实体中分离到了水溶性的p-D-葡聚糖(葡聚糖I)水不溶性的p-D-葡聚糖(葡聚糖II)和两种酸性杂多糖，并指出水溶性的葡聚糖I的主链由葡萄糖经(1→3)糖昔键连接而成,在主链上有2/3的葡萄糖残基在0-6位上被单个葡萄糖基取代，这种多羟基基团的存在使葡聚糖I在水中的溶解度较高^[1]。 

三.木耳多糖的提取方法 

传统提取黑木耳多糖的方法主要是超声波辅助提取方法、微波辅助提取方法、超临界二氧化碳萃取法水浴浸提法等方法。传统的工艺存在耗时长、得率低、工序复杂等问题。而且黑木耳多糖难以从细胞中出来，无法被人体消化吸收。本发明采用高速剪切技术，不仅耗时短、得率高、工序简单，而且可以使细胞壁破碎，有利于多糖的溶出，提高多糖的含量，为接下来对木耳多糖的分离纯化做好了准备。在工业生产中，大大减小了所需时间，为工业生产提供了可能性，降低了工业成本。 

四.高速剪切技术 

高速剪切技术（High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）是样品在高剪切分散乳化机上，接受转子高速旋转，从而产生高剪切线速度和高频机械效应，进而产生较大的动能，使原料在定、转子的间隙中受到强烈的气蚀作用、较大的机械效应和高速剪切效应的协同作用。高速剪切分散乳化技术是近年来发展起来的一种新型的均质化技术，已被应用到药物、植物研究相关的诸多领域。孙术国研究该方法与微波法提取鲜葛中葛根素，结论发现该法明显提高了得率，缩短了提取时间^[5]。滑聚娜等人在研究黄芪中黄酮时也发现该法有助于提高得率及缩短提取时间^[6]。李丽等人在研究油菜花的黄酮时发现该法能有效地提高黄酮的得率及缩短了提取时间^[7]。 

本发明采用高速分散乳化技术，该设备转速可高达30000r/min，能够大大缩短了提取时间，能耗低、提高了多糖得率。本实验研究了料液比、水浴温度、水浴时间、高剪切分散乳化机的档位、高剪切分散乳化机的提取时间、提取次数等因素对多糖得率的影响。通过单因素实验选取响应面实验的因素及水平。通过响应面实验来确定黑木耳多糖提取的最佳工艺条件。 

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种木耳多糖的综合提取方法，以克服现有技术中得率低、耗时长、纯度不高等问题。 

本发明采用高速剪切分散乳化机提取黑木耳多糖，能够有效地提高木耳多糖的溶出率，具有反应时间短、反应条件适宜、细胞壁破碎彻底、得率高的优点。经研究发现，利用这种方法提取木耳多糖，所得到的木耳多糖含量提高，得率也得到了相应的提高。较超声波辅助萃取法提高了5～10%，微波辅助提取法 提高了10～15%，水浴浸提法提高了16%左右。 

一种木耳多糖的综合提取方法，包括下列步骤: 

1.将黑木耳精选、水浴后除梗、干燥、粉碎后，过筛（80目），得到黑木耳干粉，采用石油醚进行脱脂，干燥待用。 

2.取黑木耳超微粉体与水质量比1:20～140混合，在温度20℃～100℃水浸泡，用A～F（10000～28000r/min）档高速剪切1～7min，剪切离心后，得到上清液与沉淀物，取上清液，浓缩、醇沉、绢布过滤干燥得到黑木耳多糖粉。 

3.本发明所述加水浸泡时，加水量为木耳干重的60～120倍，水浴温度50℃～70℃，水浴时间为10～20min后清洗除梗。 

4.本法所述滤液减压浓缩的真空度为0.08～0.09MPa，温度为65～85℃。 

5.本法所述料水比1:20～140，20～100℃浸泡时间20～60min高速剪切从A～F（10000～28000r/min）档剪切1～7min。 

6.本法所述醇沉用3倍体积的95%乙醇醇析24h，反复将沉淀水溶性多糖醇析。 

7.本法所述醇沉后沉淀分别用丙酮、乙醚洗涤。 

8.本法所述真空干燥的真空压力为0.09～0.10MPa，温度为60～75℃，干燥至水分的重量百分含量小于6%。 

9.本法所述喷雾干燥时，进风温度控制在165～175℃，出风温度控制在70～80℃。 

10.本发明以黑木耳为原料，采用超微粉碎结合高速剪切协同作用于黑木耳子实体，提高多糖的得率，发明的技术要点在于超微粉碎结合高速剪切协同作用，促使多糖有效溶出，得到的多糖纯度高、活性破坏小。 

本发明的有益效果主要体现在: 

1.所制得产品纯度高，其中多糖含量可高达75%以上，且得率较高。 

2.针对黑木耳细胞壁质地坚韧，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁，筛选适用于此的超微粉碎和高剪切技术协同处理工艺，可有效破壁，黑木耳粗多糖的得率可达30.84%，比传统的热水浸提机械式粉碎粗粉得到的粗多糖提高了18.31倍。工艺条件温和，不易损坏多糖结构，绿色环保，符合保健食品的生产要求。 

3.采用高剪切技术应用到黑木耳多糖的制备中，在剪切后确保稳定快速的提取速度，大大缩短工艺时间，提纯过程中的同时亦对样液进行浓缩，便于工业化生产。较超声波辅助萃取法提高了5～10%，微波辅助提取法提高了10～15%，水浴浸提法提高了18%左右。 

（四）附图说明

附图1具体实施方式一中步骤4）Y=f(A，B)交互作用的响应面和等高线图 

附图2具体实施方式一中步骤4）Y=f(A，C)交互作用的响应面和等高线图 

附图3具体实施方式一中步骤4）Y=f(B，C)交互作用的响应面和等高线图 

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此: 

具体实施方式一：本实施方式中木耳多糖的提取工艺流程如下所示。 

黑木耳→清洗→烘干→粉碎→过筛（80目）→石油醚脱脂→烘干→木耳粉→按料水比加蒸馏水→水浴→机器提取→离心→无水乙醇醇沉→绢布过滤→冷冻干燥→黑木耳多糖 

1）黑木耳粉碎工艺 

取100g的黑木耳，经中药粉碎机粉碎后，先用80目标准筛进行筛分，然后把筛下物采用超微粉碎机进行粉碎，调控超微粉碎机风机转速为16000r/min，得到黑木耳超微粉体。 

2）多糖的相关计算公式 

H=C/(m₁/V₁×V₂/V₃) 

ω=(H×m₂)/M 

式中，H为多糖的含量(%);m₁为复溶的质量;V₁为定容的体积；V₂为吸取的体积；V₃为溶液的总体积；C为多糖质量浓度（ug/ml）;ω为木耳得率(%);m₂为醇沉后的质量（g）;M为样品质量(g)。 

3)黑木耳多糖的提取 

取1）得到的黑木耳超微粉体1g，料液比1：20～1：120ml，在水浴温度为20～100℃的条件下浸提30～60min后，用高速剪切分散乳化机乳化1～5min，档位设置为A～G档，4000r/min离心10min，弃去残渣，保留上清液。开启真空泵及循环水冷却泵，待真空度升至0.04MPa时，继续抽真空，待真空度至0.08MPa时，水浴锅的温度80℃，控制真空度在0.08～0.09MPa之间。木耳多糖的真空干燥时，真空压力控制为0.09～0.10MPa，温度为60℃，干燥至水分的重量百分含量小于6%，大约需要24小时。 

4）单因素结合响应面优化黑木耳多糖提取工艺 

在单因素试验基础上，根据中心试验原则，设定了机器档位、机器时间、水浴温度的3因素3水平响应面法试验设计，其因素水平见表1，所得试验结果见表2。 

表1.黑木耳多糖提取响应面试验因素水平及编码 

Table1Coded values and corresponding actual values of factors in BBD design 

表2.响应面分析及结果 

Table2.Experiment of design and results of response surface method 

选用Box-Beknhen中心组合试验设计原理，做三因素三水平共17个试验点(5个中心点)的响应面分析试验。以多糖得率为响应值。零点试验重复5次，用以估计试验误差。使用响应曲面design-expert分析软件对表2中多糖得率的数据进行分析处理，分析后得出的相应回归方程为：y=27.64+0.67A-0.96B+1.22C+0.011AB-0.50AC-0.044BC-3.71A²-1.24B²-1.75C²该方程说明与机器档位和水浴温度成正相关的影响，与机器时间成负相关。这可能是由于乳化时间过长，导致木耳多糖中的蛋白质和 脂肪溶出，影响苯酚-硫酸法测定木耳多糖的得率。也可能是由于本发明是用少量的木耳粉进行实验的，未能完全发挥高速分散乳化机的工作效率，所以得到的结论可能具有片面性。 

采用响应面法软件对试验结果进行方差分析，其结果见表3。 

表3.回归模型方差分析表 

Table3.ANOVA for Response Surface Quadratic Model 

注：**，p<0.01，极显著；*，p<0.05，显著。 

失拟项0.0864>0.05，差异不显著，说明了方程对试验拟合的情况好，试验误差小；变异系数值为5.21，说明了试验可靠；模型的较正决定系数R² _adj=0.7820说明该模型能解释78.20%响应值的变化，有总变异21.80%的实验值不能用此模型来解释。 

所选模型的不同处理间差异显著，说明用响应面回归方程描述各因子和响应值间的关系时，各个变量之间呈现一定的线性关系，即该试验方法可靠。水浴温度、机器时间、机器档位二次项的差异不显著；机器档位、机器时间的P值小于0.01呈极显著；水浴温度的P值小于0.05呈一般显著。通过F值还能看出，试验中各因素对多糖得率的影响大小顺序为：机器档位＞机器时间＞水浴温度。 

响应面的图形是响应值对各实验因子所构成的三维空间的曲面图，根据拟合函数，每2个因素对提取得率画出响应面和等高线图，此时考虑到定性分析各因素对多酚提取量的关系，固定另外2个因素时，均作“0”水平处理。如附图1-3为各因素交互作用的响应面和等高线图。从图中可以直观地反映各因素对响应值的影响，找出最佳工艺参数以及各参数之间的相互作用，从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范围内存在极值，响应面的最高点同时也是等高线中的最小椭圆的中心点。 

此回归模型得出BBD试验的最优提取条件为：水浴温度86℃，水浴时间60min，料水比1:80，机器时间4.21min，机器档位为E档，提取次数为一次。 

5）旋转蒸发浓缩 

开启真空泵及循环水冷却泵，待真空度升至0.04MPa时，继续抽真空，待真空度至0.08MPa时，水浴锅的温度80℃，控制真空度在0.08～0.09MPa之间。 

6）醇沉 

醇沉用1～3倍体积的95%～无水乙醇醇析24h，反复将沉淀水溶醇析。醇沉后沉淀分别用有机溶剂洗涤。 

7）木耳多糖的干燥 

木耳多糖的真空干燥时，真空压力控制为0.09-0.10MPa，温度为60～75℃，干燥至水分的重量百分含量小于6%，大约需要24小时。喷雾干燥时，进风温度控制在165～175℃，出风温度控制在70～80℃。 

相应面优化后理论多糖得率为28.08%。 

具体实施方式二： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤3）料液比1：80ml，水浴温度86℃，水浴时间为60min，用高分子乳化剪切技术机E档(22000r/min)，高速剪切4min。其它与具体实施方式一相同。干燥后得到黑木耳多糖最佳0.2675g，得到多糖含量81.37%，多糖得率28.45%。 

具体实施方式三： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤3)料液比1：100ml，水浴温度100℃，水浴时间为30min，用高分子乳化剪切技术机E档(22000r/min)，高速剪切5min。其它与具体实施方式一相同。干燥后得到黑木耳多糖最佳0.2613g，得到多糖含量82.14%，多糖得率28.15%。 

具体实施方式四： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤3)料液比1：80ml，水浴温度100℃，水浴时间为60min，用高分子乳化剪切技术机D档(18000r/min)，高速剪切6min。其它与具体实施方式一相同。干燥后得到黑木耳多糖最佳0.2689g，得到多糖含量81.69%，多糖得率27.65%。 

具体实施方式四： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤5)减压浓缩的真空度为0.08-0.09MPa，温度为65-85℃。其它与具体实施方式一相同。 

具体实施方式五： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤6)醇沉用3倍体积的95%乙醇醇析24h，反复将沉淀水溶醇析。醇沉后沉淀分别用丙酮、乙醚洗涤。其它与具体实施方式一相同。 

具体实施方式六： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤7)真空干燥的真空压力为0.09-0.10MPa，温度为60-75℃，干燥至水分的重量百分含量小于6%。其它与具体实施方式一相同。 

具体实施方式七： 

本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤7)喷雾干燥时，进风温度控制在175±3℃，出风温度控制在75±3℃。其它与具体实施方式一相同。 

Claims (9)

1.一种新型的黑木耳多糖的提取方法，其特征在于采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，首先取黑木耳超微粉体与水质量比1:20～1:140混合，在温度20～100℃水浸泡，浸泡时间为30-60min。用高分子乳化剪切技术机A～G档高速剪切1～6min，剪切离心后，得到上清液与沉淀物，取上清液，浓缩、醇沉、过滤干燥得到黑木耳多糖粉。

2.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述加水水浴时，加水量为黑木耳干重的80倍，水浴温度86℃，水浴时间为60min，用高分子乳化剪切技术机E档(22000r/min)，高速剪切5min。

3.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述加水水浴时，加水量为黑木耳干重的100倍，水浴温度100℃，水浴时间为30min，用高分子乳化剪切技术机E档(22000r/min)，高速剪切5min。

4.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述加水水浴时，加水量为黑木耳干重的80倍，水浴温度100℃，水浴时间为60min，用高分子乳化剪切技术机D档(18000r/min)，高速剪切6min。

5.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述滤液减压浓缩的真空度为0.08-0.09MPa，温度为65-85℃。

6.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述醇沉用3倍体积的95%乙醇醇析24h，反复将沉淀水溶醇析。

7.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述醇沉后沉淀分别用丙酮、乙醚洗涤。

8.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述真空干燥的真空压力为0.09-0.10MPa，温度为60-75℃，干燥至水分的重量百分含量小于6%。

9.根据权利要求1所述的采用高分子乳化剪切技术提取黑木耳多糖，其特征在于所述喷雾干燥时，进风温度控制在175±3℃，出风温度控制在75±3℃。

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