CN116794146A - 冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组胺检测领域，特别是涉及鱼类产品中组胺的检测领域，更为具体的说是涉及冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法。所述方法是高效液相色谱与高分辨质谱联用方法，其中所述的海水鱼及其制品的前处理方法是样品经乙腈+水溶解后加入C18分散剂，超声、离心处理。本发明所公开的预处理方法中无需衍生反应、萃取净化等步骤，从而避免不易挥发酸碱试剂和衍生试剂的添加，对高分辨质谱仪检测无损害，进而可以利用高分辨质谱仪实现准确、可靠、快速的组胺含量检测。本发明公开的技术方案能够适用于冰鲜海水鱼及其制品中组胺的快速筛查检测。
Description
技术领域
本发明涉及组胺检测领域，特别是涉及鱼类产品中组胺的检测领域，更为具体的说是涉及冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法。
背景技术
组胺是游离的组氨酸类物质在组氨酸脱羧酶的作用下氨基化形成的小分子质量的化合物。组胺本身是人体重要的活性成分，适量的组胺对调解机体正常生理功能具有重要作用，如控制胃酸分泌、调解细胞因子、参与炎症反应及促进甲肾上腺素和肾上腺素的释放。然而，组胺摄入过量则会导致人体组胺中毒，出现头痛、恶心、呕吐等多种不良症状，严重者甚至死亡。
因此，食品中组胺含量的检测十分必要。
液相色谱法是目前食品中组胺检测的主要手段，但是该法测定中前处理步骤过程复杂，需要净化、衍生等操作，其中衍生操作的步骤多、复杂程度高，使得整体分析时间较长，对检测结果干扰大，同时该方法依赖于分析软件，如果分析软件缺少光谱功能，则分析定量结果准确性低。
液相色谱与质谱联用的检测技术相较于传统的高效液相色谱法具有更多优势。但是由于传统的高效液相色谱检测中前处理需要用到不易挥发的酸碱、衍生试剂等，而这些试剂会给质谱仪造成很大的损害，特别是高分辨质谱仪，由于仪器对样品中试剂更为敏感，因此，传统的前处理方式限制了高分辨质谱仪在组胺检测中的应用。
目前尚未见到组胺检测中采用高效液相色谱-高分辨质谱法联用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速测定冰鲜海水鱼及其制品中的组胺的方法。
为了解决上述技术，本发明公开了冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，所述方法是将待检测的冰鲜海水鱼或其制品经过预处理制备得到待测样品后，经高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用进行分析检测的方法，所述预处理包括以下步骤：
(1)将待检测试样置于离心管中，所述待检测试样为冰鲜海水鱼或其制品；
(2)向离心管内加入乙腈和水组成的混合溶液；
(3)再向混合溶液中加入C18分散剂；
(4)超声、离心；
(5)取上清液作为待测样品。
优选地，所述冰鲜海水鱼制品是指盐渍海水鱼、海水鱼罐头。本发明所公开的测定方法，特别是该测定方法中的预处理步骤能够适用于非鲜活的鱼，以及经过深度处理的盐渍海水鱼和海水鱼罐头，有效提取待测物中的组胺，保证后续测定的准确性。
进一步优选地，所述乙腈和水组成的混合溶液中，乙腈与水的体积比为4:6。
更为优选地是，步骤(3)中，C18的添加量以重量计为待检测试样重量的2％～6％。
在一个优选的技术方案中，所述步骤(3)向混合溶液中加入C18分散剂后，用乙腈和水的混合溶液定容，定容后，待测试样的浓度为1g/mL。
作为一种优选的技术方案，所述超声的条件为，超声功率50～200kw，超声时间10～50分钟。
作为一种优选的技术方案，所述离心的条件为，离心转速1000～8000r/min，离心时间5～10min。
进一步优选地，高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用进行分析检测中，高效液相色谱仪采用C18分析柱，柱温30℃，以甲酸水-乙腈作为洗脱液，利用梯度洗脱的方式进行洗脱。
进一步地，所述梯度洗脱的洗脱程序为：洗脱梯度以体积计分别为90:10、10:90、10:90、90:10，各梯度洗脱时间分别为2min、1.0min、3.0min、1min。
进一步优选地，所述高分辨质谱仪采用离子化电喷雾，检测条件为：电喷雾离子源为HESI-II，毛细管温度为320℃，鞘气流速50L/min，辅助气流速8L/min，吹扫气流速5L/min，喷雾电压为3KV，透镜电压为50V，采用正离子采集数据，一级全扫描的分辨率R＝35000，扫描范围100～1000m/z。
我们还公开了前述测定方法在冰鲜海水鱼及其制品的定性和定量检测中的应用。
当定性检测时，分别将标准工作液和样品液，采用上述的条件进行测定，如果在样品液与标准工作液的一级全扫描质谱图中，样液中目标物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在±2.5％以内；且实测分子量与理论分子量的偏差小于10×10-6，则认为样品液中含有所参照的标准工作液成分。
当定量检测时，以组胺的化学标准品制作标准液，采用外标法绘制标准工作曲线。其中标准曲线的横坐标为标准液浓度，纵坐标为标准溶液质谱响应峰面积。本发明所制备得到的标准工作曲线在0.1μg/mL～5μg/mL线性关系良好，相关系数0.9992。
采用本发明所公开的技术方案，测量结果精密度高，该方法对组胺的检测下限可达1.0mg/kg。本发明公开的检测方法的定量限为1.0mg/kg。在1.0、2.0和10.0μg/mL 3个加标水平下对冰鲜海水鱼、盐渍海水鱼以及海水鱼罐头制品进行加标回收试验，回收率在85.0％～101.5％范围内，相对标准偏差(RSD)在0.36％～3.55％范围内，说明本发明公开的预处理方法对组胺的提取效果好，能够用于海水鱼及其制品种组胺的测定。
同时，本发明所公开的预处理方法中无需衍生反应、萃取净化等步骤，从而避免不易挥发酸碱试剂和衍生试剂的添加，对高分辨质谱仪检测无损害，从而可以利用高分辨质谱仪实现准确、可靠、快速的组胺含量检测。本发明公开的技术方案能够适用于冰鲜海水鱼及其制品中组胺的快速筛查检测。
附图说明
图1为组胺高效液相色谱图。
图2为组胺高分辨质谱仪质谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水均为二级水。
Q-Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱仪、配备HESI-Ⅱ源、Ultimate 3000高压液相色谱(赛默飞世尔科技有限公司)；XW-80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；SQP及CPA225D分析天平(精确至0.01g及0.00001g，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KH-500B超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；纯水机(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
组胺标准品(纯度99.7％，阿尔塔科技有限公司)；乙酸锌(分析纯，国药试剂集团)；乙腈(色谱纯,德国默克公司)；甲酸(色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)。
实施例1
在本实施例中我们以已知组胺量的鱼罐头作为待检测试样，按照定量检测的方法测定鱼罐头中的组胺含量，从而验证本发明公开方法对试样中组胺的提取效果。所选用的鱼罐头(Fapas公司)中组胺质控样特性值20.2mg/kg，范围10.1-32.3mg/kg。
1.标准溶液的配制
组胺标准溶液储备液(1.0mg/mL)：准确称量组胺(二盐酸盐)标准品16.56050mg(精确至0.00001g)于10mL容量瓶中，用适量水溶解，加1mL乙腈溶解，最后用水定容至刻度，摇匀，于4℃冰箱中储存。
组胺标准溶液使用液：临用前由储备液用水稀释至100μg/mL。
2.样品前处理
称取鱼罐头中肉质部分10.00g于50mL刻度塑料离心管中，用体积比4:6乙腈-水溶解后，再加入400mg C18分散剂，并定容至10mL，超声功率100kw，超声处理30min，然后在4℃条件下，以8000转/分钟的速度离心8min，取上清液，即为待测样品。将待测样品过0.22μm尼龙和水相滤膜，备用。
3.采用高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用进行定量分析检测
(1)用100μg/mL的组胺标准使用液分别配成0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL的组胺标准工作溶液，供液质测定用。
(2)按照以下仪器条件，采用外标法绘制标准曲线
a.质谱条件
离子源：可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)；质谱扫描模式：采用正离子一级全扫描(full mass)模式；扫描范围m/z＝80～210；毛细管温度：320℃；鞘气(N2)流速50L/min，辅助气(N2)流速8L/min，吹扫气(N2)流速5L/min；电压：喷雾电压3kV，透镜电压50V；分辨率R＝35000。组胺质谱理论分子量为112.08704。
b.色谱条件
色谱柱：ZORBAX sb-aq C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.5mL/min；进样量10μL；柱温35℃。采用梯度洗脱方式：在0～2min时10％乙腈，90％的甲酸水溶液(0.1％)，2～3min时乙腈比例升至90％，并保持3min，6～7min时乙腈比例降至10％，并在此比例下保持1min，梯度洗脱程序如表1所示：
表1液相色谱梯度洗脱程序表
得到标准曲线y＝1.37819×107x+1.9838×107，相关系数r2＝0.9992。该曲线在0.1μg/mL～5.0μg/mL范围内线性关系良好。
(3)按照(2)中的质谱条件和色谱条件对第2步中获得的待测样品进行液质联用测定，并根据标准曲线计算得到待测样品中的组胺含量。经计算，组胺检测值为20.1mg/kg。结果表明本发明公开的预处理方法能够有效、完全提取深度处理后的鱼罐头制品中的组胺。
实施例2
按照实施例1中公开的方法，分别对不同冰鲜海水鱼及其制品进行1.0μg/mL、2.0μg/mL、10.0μg/mL三个水平的加标回收实验，每个添加水平平行测定6次，回收率结果见表2。
表2回收率试验(n＝6)
结果表明本发明公开的测定方法回收率在85.0％～101.5％范围内，相对标准偏差(RSD)在0.36％～3.55％范围内，说明本发明所公开的测定方法中预处理效果好，能够有效提取冰鲜海水鱼及深度加工后样品中的组胺成分，同时通过高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用的测定方法，显著提高组胺含量测量的准确度。
实施例3
不同的高效液相色谱条件下，对组胺成分的分离效果不同，本实施例中分别考察了不同色谱柱以及不同洗脱程序下对样品中组胺成分的分离效果，结果表明，在色谱柱：ZORBAX sb-aq C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.5mL/min；进样量10μL；柱温35℃。采用梯度洗脱方式：在0～2min时10％乙腈，90％的甲酸水溶液(0.1％)，2～3min时乙腈比例升至90％，并保持3min，6～7min时乙腈比例降至10％，并在此比例下保持1min的色谱条件下，各个样品中组胺的分离效果最好，其色谱图和质谱图分别如图1和图2所示。
实施例4实际样品测定
对实验室委托及法检送检的海水鱼及其制品按照实施例1中公开的条件和方法进行组胺检测，并分别给出定性和定量结果。
其中，定性结果的判断方法为：分别将标准工作液和样品液，采用实施例1中所述的方法进行测定，如果在样品液与标准工作液的一级全扫描质谱图中，样液中目标物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在±2.5％以内；且实测分子量与理论分子量的偏差小于10×10-6，则认为样品液中含有所参照的组胺成分。组胺保留时间及理论分子量、实测分子量如表3所示。
表3组胺质谱参数
| 化合物名称 | 离子模式 | 保留时间(min) | 理论分子量 | 实测分子量 | 偏差 |
| Histamine | [M+H]+ | 3.40 | 112.08704 | 112.08686 | -0.00018 |
经检测，上述样品中均含有组胺成分。
进一步地，对上述样品进行定量检测，定量结果的判断方法为：以一级母离子的精确质量数为定量离子，用外标法进行定量。
结果见表4。
表4水产品及其制品中组胺含量的测定
结果表明，本次送检的各样品中一般海水鱼及其制品中组胺含量均满足《GB2733-2015食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》对组胺的限量要求(高组胺鱼类≤40mg/100g，其他海水鱼类≤20mg/100g)，臭鳜鱼中组胺含量满足《GB 10136-2015食品安全国家标准动物性水产制品》的限量要求(高组胺鱼类≤40mg/100g，其他海水鱼类≤20mg/100g)。鱼罐头中组胺含量也满足《GB 7098-2015食品国家安全标准罐头食品》的限量要求(≤100mg/100g)。
实施例5
目前本领域中的组胺检测方法大都集中在鲜活鱼，或者冰鲜鱼中。鲜少有涉及海水鱼深加工制品中组胺的检测方法。这是因为包括盐渍鱼、鱼罐头等在内的海水鱼制品的加工过程复杂，通常是在冰鲜鱼的基础上，进行腌制、油炸、调料液、灌装、杀菌等系列处理后制备而成。在这个深加工的过程中，鱼中所含的蛋白质等发生变化，使得制品中基质的成分更为复杂，就需要预处理方法既能够确保样品基质中的组胺充分提取，同时又要减少和避免鱼制品中其他基质对质谱检测的影响。
在本实施例中按照实施例1中公开的方式分别进对已知组胺含量的鱼罐头质控样品、盐渍鱼以及冰鲜鱼采用液-质联用的方式测定组胺，但是与实施例1不同的是，在进行样品预处理时，不添加有C18，检测结果对比见表5。
表5不同前处理方式对鱼罐头中组胺定结果的比较
结果表明仅添加乙腈和水组成的预处理溶液后，样品中的组胺成分无法完全提取，试验结果偏差不能满足《食品安全国家标准食品生物胺的测定》中对组胺的测定要求
因此，说明在预处理液中加入C18对于深加工制品中组胺的提取具有显著影响。
实施例6前处理中C18添加量的考察
按照实施例1中公开的方法对样品进行处理，与实施例1不同的是，分别考察不同C18添加量对组胺检测结果的影响。C18的添加量以重量计为待检测试样重量的百分比，不同C18分散剂的含量对组胺结果的影响如表6所示。结果发现随着C18分散剂的加入量增大，组胺的测定值也更接近真实值，在不同的检测样品中，组胺最佳添加量不同，在鱼罐头样品中，当C18加入量大于5％时，组胺的测定值不再发生明显变化。但是当在冰鲜鱼中时，当C18加入量大于2％时，组胺的测定值不再发生明显变化。当被检测样品为盐渍鱼时，C18的最佳添加量为6％。
表6不同C18添加量对样品中组胺测定结果的影响
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述方法是将待检测的冰鲜海水鱼或其制品经过预处理制备得到待测样品后，经高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用进行分析检测的方法，所述预处理包括以下步骤：
(1)将待检测试样置于离心管中，所述待检测试样为冰鲜海水鱼或其制品；
(2)向离心管内加入乙腈和水组成的混合溶液；
(3)再向混合溶液中加入C18分散剂；
(4)超声、离心；
(5)取上清液作为待测样品。
2.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述冰鲜海水鱼制品是指盐渍海水鱼、海水鱼罐头。
3.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述乙腈和水组成的混合溶液中，乙腈与水的体积比为4:6。
4.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：步骤(3)中，C18的添加量以重量计为待检测试样重量的2％～6％。
5.根据权利要求1或3所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)向混合溶液中加入C18分散剂后，用乙腈和水的混合溶液定容，定容后，待测试样的浓度为1g/mL。
6.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述超声的条件为，超声功率50～200kw，超声时间10～50分钟。
7.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述离心的条件为，离心转速1000～8000r/min，离心时间5～10min。
8.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：高效液相色谱仪-高分辨质谱仪联用进行分析检测中，高效液相色谱仪采用C18分析柱，柱温30℃，以甲酸水-乙腈作为洗脱液，利用梯度洗脱的方式进行洗脱；
进一步地，所述梯度洗脱的洗脱程序为：洗脱梯度以体积计分别为90:10、10:90、10:90、90:10，各梯度洗脱时间分别为2min、1.0min、3.0min、1min。
9.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：所述高分辨质谱仪采用离子化电喷雾，检测条件为：电喷雾离子源为HESI-II，毛细管温度为320℃，鞘气流速50L/min，辅助气流速8L/min，吹扫气流速5L/min，喷雾电压为3KV，透镜电压为50V，采用正离子采集数据，一级全扫描的分辨率R＝35000，扫描范围100～1000m/z。
10.根据权利要求1所述的冰鲜海水鱼及其制品中组胺的测定方法，其特征在于：
当所述测定方法为定性检测时，分别将标准工作液和样品液，采用上述的条件进行测定，如果在样品液与标准工作液的一级全扫描质谱图中，样液中目标物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在±2.5％以内；且实测分子量与理论分子量的偏差小于10×10-6，则认为样品液中含有所参照的标准工作液成分；
当所述测定方法为当定量检测时，以组胺的化学标准品制作标准液，采用外标法绘制标准工作曲线。其中标准曲线的横坐标为标准液浓度，纵坐标为标准溶液质谱响应峰面积。本发明所制备得到的标准工作曲线在0.1μg/mL～5μg/mL线性关系良好，相关系数0.9992。
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