CN111855871B - 一种过滤式固相萃取结合超临界流体色谱-质谱测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

一种过滤式固相萃取结合超临界流体色谱‑质谱测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于：用乙腈通过磁力搅拌将样品中的异丙菌胺和氟吡菌酰胺萃取，以过滤式固相萃取技术净化后，以超临界流体色谱‑串联质谱（SFC‑MS/MS）测定烟草及烟草制品中异丙菌胺和氟吡菌酰胺农药残留量的方法。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，填补了该类物质测定的空白，能够为相关残留限量的测定和方法技术的开发提供诸多借鉴，针对烟草和烟草制品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：本发明方法样品前处理过程简单、快速，具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

Description

一种过滤式固相萃取结合超临界流体色谱-质谱测定烟草中 异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法
技术领域
本发明属于烟草及烟草制品中农药残留的理化检验技术领域，主要涉及烟草及烟草制品中异丙菌胺和氟吡菌酰胺农药残留量的测定技术，具体说是一种通过磁力搅拌萃取农药残留，以手持注射式固相萃取技术净化、过滤后，以超临界流体色谱-串联质谱测定烟草及烟草制品中异丙菌胺和氟吡菌酰胺农药残留量的方法。
背景技术
烟草作为吸食品，其农药残留量问题已成为吸烟安全性问题中的重要组成部分，烟草及烟草制品农药残留量指标是各国在烟草制品质量控制中的重要内容。异丙菌胺是拜耳公司开发的氨基酸类杀菌剂，它通过抑制孢子囊胚芽管的生长、 菌丝体的生长和芽孢形成而发挥对作物的保护、治疗作用。此外，作为一种具有生物活性的杀菌剂，不仅在霜霉科、疫霉属真菌导致的病害上有突出的治疗及铲除效果，而且对促进植株生长也有良好的作用。氟吡菌酰胺是是拜耳公司于 2003 年开发的一种新型吡啶基乙基苯甲酰胺类杀菌剂，是广谱、内吸性杀菌剂，具有保护和治疗作用，可用于防治包括葡萄、梨、核果、蔬菜和大田作物等在内的 70 多种作物上的灰霉病、白粉病、菌核病和褐腐病等，也可以防治香蕉叶斑病。这两种农药均是烟草中常用的杀菌剂，如果长期单一使用会导致病原菌抗药性的产生，造成化合物的防效降低、使用量增加、使用寿命明显缩短。所以这两种杀菌剂经常配伍使用，因此有必要开发一种同时检测该两种杀菌剂的方法。
目前关于异丙菌胺与氟吡菌胺酰胺残留的测定的文献报道并不多，异丙菌胺主要采用HPLC方法测定【卢平，张钰萍。杀菌剂异丙菌胺原药的反相超临界流体色谱分析方法，农药科学与管理，2013，2】，氟吡菌酰胺主要采用GC、GC-MS测定【李文卓，钱圆，MATSUMOTOHaruna，等。气相色谱-串联质谱检测蔬菜中氟吡菌酰胺及其代谢物残留，农药学报，2016，6；孙雪梅，孙财远，包兴涛，等。通过GC和GC-MS方法测定氟吡菌酰胺蔬菜中残留量，农药，2017，5】。前处理方法主要是通过乙腈等有机溶剂进行提取，然后经分散固相萃取净。
现有的异丙菌胺与氟吡菌胺酰胺残留的测定方法，不能够同时对烟草或烟草制品中的异丙菌胺与氟吡菌胺酰胺单独定量研究，并且这些测定方法耗时较长，净化效果较差，测定干扰多，测定结果不准确。
发明内容：
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种磁力搅拌萃取农药残留，以手持过滤式固相萃取技术净化、过滤后，以超临界流体色谱-串联质谱测定烟草及烟草制品中异丙菌胺及氟吡菌酰胺农药残留量的方法，该方法能快速、准确检测烟草及烟草制品中异丙菌胺及氟吡菌酰胺农药残留量，测定结果准确、测定干扰少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种过滤式固相萃取结合超临界流体色谱-质谱测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，用乙腈经磁力搅拌提取后，以手持过滤式固相萃取净化，过滤后以超临界流体色谱-串联质谱（SFC-MS/MS）测定样品中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的含量。其中过滤式固相萃取柱中分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg。异丙菌胺和氟吡菌酰胺分子结构中均含有苯环和酰胺基团，石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp²杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料，N-丙基乙二胺固相吸附剂中含有氨基。这两种材料按照质量1：1组合可以最大程度除去烟草基质中的干扰，而在乙腈溶液中不易吸附目标物。
该方法具体包括以下步骤：
a、样品准备：烟草及烟草制品样品干燥粉碎后过2mm的筛子。
b、样品的提取：准确称取0.8-1.2 g样品（精确至0.01 g）于50 mL具塞三角瓶中，加入8-12 mL水，静置10 min直至样品被水充分浸润；移取8-12 mL乙腈至三角瓶中，并在三角瓶中放入磁力搅拌子。将三角瓶放置于磁力搅拌器上，以1000 rpm 速率搅拌0.5小时；然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以200 rpm速率振荡2 min，上清液即为萃取液；
c、样品净化：移取萃取液0.8-1.2mL于2mL的过滤式固相萃取柱中(内分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg)，并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，推动注射器推杆使得萃取液缓慢经过固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；移取200 μL滤液，加入800 μL乙腈稀释，用SFC-MS/MS检测；萃取液经过固相萃取柱的速度为每分钟20-25滴。
d、基质混合标准工作溶液制备：分别称取10mg异丙菌胺和氟吡菌酰胺标准品到10mL容量瓶中，用乙腈稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；分别移取上述标准工作溶液200 μL和200 μL空白样品基质溶液，然后加入600 μL乙腈，配制成基质混合标准工作溶液；
空白样品基质溶液的制备方法如下：准确称取0.8-1.2g研磨后的空白烟草样品于50 mL具盖离心管中，加入8-12mL水，静置10min直至样品被水充分浸润；移取8-12mL乙腈至三角瓶中，并在三角瓶中放入磁力搅拌子；将三角瓶放置于磁力搅拌器上，以1000rpm速率搅拌0.5小时；然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以200rpm速率振荡2min，静置5min，取上清液即为萃取液；移取萃取液1.0mL于2mL的过滤式固相萃取柱中(内分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg)，并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，缓慢推动注射器推杆使得萃取液经过固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；所得滤液即空白样品基质溶液。
e、超临界流体色谱-串联质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的基质混合标准工作溶液，注入超临界流体色谱-串联质谱仪；
f、农药残留量测定结果的计算
以外标法进行农药残留量的定量分析，即以农药的色谱峰面积与对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.998,对提取后的样品进行测定，测得检出农药的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的残留量。
所述基质混合标准工作溶液的配制方式如下：分别称取10mg异丙菌胺和氟吡菌酰胺标准品农药标准品至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0 mg/mL的标准储备液；分别移取以上两种农药单一标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度；配得混合标准储备液（10μg/mL）；分别移取混合标准储备液25μL, 50μL, 100μL,250 μL , 500 μL 及1000 μL到6个10 mL容量瓶中，用乙腈定容；配制的各标准工作溶液的浓度分别为0.025μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL；分别移取上述标准工作溶液200 μL和200μL空白样品基质溶液混合，并加入600μL乙腈；配置的各基质混合标准工作溶液浓度分别为0.005μg/mL, 0.01μg/mL, 0.02μg/mL,0.05μg/mL, 0.1μg/mL, 0.2μg/mL。
采用的色谱条件为：色谱柱：Torus 2-PIC(100 mm×2.1 mm，1.7um, 美国Waters公司)；补偿溶剂：0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为乙醇，流动相B为CO2；流速：0.2mL/min；柱温：40 ℃；背压：1800psi; 进样量：2μL；梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描； 电喷雾离子源(ESI)； 离子源温度150℃；毛细管电压：2.8 KV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：800 L/hour；脱溶剂气温度：350 ℃；MRM模式采集。MRM参数见表2。
表1 梯度洗脱程序
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 5 95
1 5 95
2 10 90
4 10 90
5 5 95
6 5 95
表2质谱条件
Figure 615536DEST_PATH_IMAGE002
*定量离子
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草及烟草制品样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比具有如下优良效果：
⑴本发明方法样品前处理过程简单，大大缩短了每个烟草样品的萃取及净化时间。
本发明方法将烟末用乙腈进行提取后，再加无水硫酸镁、氯化钠等促使其分层，最后取萃取液进行过滤式固相萃取净化。该方法提高萃取效率，又能对烟草中的色素及烟草植物组织的其他共萃物（脂肪酸、叶绿素等）起到很好的吸附净化作用，避免了样品浓缩、净化过程造成的待测农药组分损失，又使实验操作更加简单、快捷。
（2）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。
①本发明方法的检测限：
将不同浓度的异丙菌胺和氟吡菌酰胺农药标准工作溶液注入SFC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限在0.005mg/kg-0.008 mg/kg之间。
②本发明方法的重复性和加标回收率：
在烟草和烟草制品样品中加入异丙菌胺和氟吡菌酰胺的标准溶液，然后进行样品前处理和SFC－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出，两种农药的回收率在94.8％－106.6％之间，平均相对标准偏差（RSD）小于3.0%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。
Figure 532676DEST_PATH_IMAGE004
附图说明
图1为本发明的测定方法流程图，
图2为本发明加标样品的选择离子色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例具体说明本发明所述方法的应用。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实施例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围中。
实施例中涉及的仪器与试剂规格/型号如下：
农药：异丙菌胺、氟吡菌酰胺，均为标准品；乙腈为农残级；
Waters 合相色谱串联质谱仪；磁力搅拌器(美国talboys公司)；AE 163电子天平（感量：0.0001g）和AE 166电子天平（感量：0.01g）（瑞士Mettler公司）。
一、实施例
本实施例的烟草及烟草制品中异丙菌胺与氟吡菌酰胺的测定方法，以烘烤后的烤烟样品为待测样品，测定流程如图1所示，具体包括以下步骤：
1. 样品干燥粉碎，过筛。准确称取1.0g样品（精确至0.01 g）于50 mL具塞三角瓶中，加入10 mL水，静置10 min直至样品被水充分浸润；移取10 mL乙腈至三角瓶中，并在三角瓶中放入磁力搅拌子。将三角瓶放置于磁力搅拌器上，以1000 rpm 速率搅拌0.5小时；然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以200rpm速率振荡2 min，上清液即为萃取液；
2. 移取萃取液1.0mL于2mL的过滤式固相萃取柱中(内分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg)，并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，推动注射器推杆使得萃取液缓慢经过固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；移取200 μL滤液，加入800μL乙腈稀释，用SFC-MS/MS检测；萃取液经过固相萃取柱的速度为每分钟20-25滴。
3.准备标准工作溶液：分别称取0.01 g两种农药（异丙菌胺与氟吡菌酰胺）标准品（精确至0.0001 g）至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0 mg/mL的标准储备液。然后分别移取以上两种农药单一标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度。配得10μg/mL的混合标准储备液。分别移取一定体积的混合储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，即配制成不同浓度的农药标准工作溶液，标准序列：0.025 μg/mL,0.05μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5μg/mL, 1.0μg/mL。分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品基质溶液混合，然后加入600μL乙腈，即配制成不同浓度的基质混合标准工作溶液。分别对这些基质混合标准溶液进行SFC-MS/MS分析。
4.测定方法: 将配制好的不同浓度的农药标准工作溶液注入SFC-MS/MS，并对各标样峰面积（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线。对提取后的样品待测液进行测定，测得农药的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的异丙菌胺与氟吡菌酰胺含量分别为2.52mg/kg和1.18mg/kg。
采用的色谱条件为：色谱柱：Torus 2-PIC (100 mm×2.1 mm，1.7um, 美国Waters公司)；补偿溶剂：0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为CO2；流速：0.2mL/min；柱温：40 ℃;背压:1800psi; 进样量：2μL；梯度度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描； 电喷雾离子源(ESI)； 离子源温度150℃； 毛细管电压：2.8 KV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：800 L/hour；脱溶剂气温度：350 ℃；MRM模式采集。MRM参数见表2。
为判断方法的准确性，在此样品中加入10 µg/mL的异丙菌胺与氟吡菌酰胺标准溶液,使得样品中异丙菌胺与氟吡菌酰胺的含量为3.52mg/kg和2.18mg/kg，进行同上的样品前处理，以LC-MS/MS测得异丙菌胺与氟吡菌酰胺选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中异丙菌胺与氟吡菌酰胺含量分别为3.48mg/kg和2.14mg/kg，即异丙菌胺与氟吡菌酰胺的加标回收率为98.9％和98.2％，说明此方法是准确的。
二、对比例
对比例1：本对比例以申请公布号为CN108918747A的中国发明专利中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烤烟样品添加样品(异丙菌胺与氟吡菌酰胺的含量为3.52mg/kg和2.18mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表4所示。
对比例2：本对比例以《基于UPLC-MS/MS检测番茄中10种杀虫剂农药残留》（李晨雨等，农药，2020年第59卷第2期）中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烤烟样品添加样品(异丙菌胺与氟吡菌酰胺的含量为3.52mg/kg和2.18mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表4所示。
对比例3：本对比例以《Analysis of 118 pesticides in tobacco afterextraction with the modified QuEChRS method by LC-MS-MS.》（Fei Yang等，JChromatogr Sci, 2014, 52(8): 788-792.）中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烤烟样品添加样品(异丙菌胺与氟吡菌酰胺的含量为3.52mg/kg和2.18mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表4所示。
通过本发明与对比例1-3的结果我们发现，本发明所采用的前处理条件简便，将分散固相萃取和过滤集于一体。且针对烟草基质中这两种新型杀菌剂的特点，选用石墨烯和N-丙基乙二胺1：1的量作为净化材料，不仅很好的除去基质中的干扰物质，且获得很好的回收率。采用SFC-MS/MS分析也大大缩短了色谱分离时间，减少了分离过程所需的有机溶剂。
表4 各方法的回收率
方法 回收率（%）
本发明 94.8－104.6
对比例1 78.8-83.5
对比例2 80.6-86.8
对比例3 85.1-90.2

Claims (5)

1.一种过滤式固相萃取结合超临界流体色谱-质谱测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于：烟草样品用乙腈经磁力搅拌提取后，用过滤式固相萃取柱净化，过滤后以超临界流体色谱-串联质谱测定样品中异丙菌胺及其氟吡菌酰胺的含量，具体步骤如下：
a、样品准备：烟草及烟草制品干燥粉碎后过2mm的筛子；
b、样品的提取：准确称取0.8-1.2 g样品于50 mL具塞三角瓶中，加入8-12 mL水，静置10 min直至样品被水充分浸润；移取8-12 mL乙腈至三角瓶中，并在三角瓶中放入磁力搅拌子；将三角瓶放置于磁力搅拌器上，以1000 rpm 速率搅拌0.5小时；然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以200 rpm速率振荡2 min，上清液即为萃取液；
c、样品净化：移取上清液0.8-1.2 mL于2mL的过滤式固相萃取柱中，柱内分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg；并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，缓慢推动注射器推杆使得萃取液经过固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；移取200μL滤液，加入800μL乙腈稀释，用SFC-MS/MS检测：
色谱条件为：色谱柱：Torus 2-PIC ，规格100 mm×2.1 mm，1.7um；补偿溶剂：0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为CO2；流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；背压：1800psi; 进样量：2μL；梯度洗脱，具体程序如表1所示：
表1 梯度洗脱程序
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%) 0 5 95 1 5 95 2 10 90 4 10 90 5 5 95 6 5 95
采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度150 ℃；毛细管电压：2.8 KV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：800 L/hour；脱溶剂气温度：350 ℃；MRM模式采集；
d、基质混合标准工作溶液制备：分别称取10mg异丙菌胺与氟吡菌酰胺标准品到10mL容量瓶中，用乙腈稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品基质溶液，然后加入600μL乙腈，配制成基质混合标准工作溶液；
e、超临界流体色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的基质混合标准工作溶液，注入超临界流体色谱-串联质谱仪；
f、农药残留量测定结果的计算
以外标法进行农药残留量的定量分析，即以农药的色谱峰面积与对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.998,对提取后的样品进行测定，测得检出农药的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中异丙菌胺与氟吡菌酰胺的残留量。
2.根据权利要求1所述的测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于：所述步骤d中的空白样品基质溶液的制备方法如下：准确称取0.8-1.2g研磨后的空白烟草样品于50 mL具盖离心管中，加入8-12mL水，静置10min直至样品被水充分浸润；移取8-12mL乙腈至三角瓶中，并在三角瓶中放入磁力搅拌子；将三角瓶放置于磁力搅拌器上，以1000rpm速率搅拌0.5小时；然后向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以200rpm速率振荡2min，静置5min，取上清液即为萃取液；移取萃取液1.0mL于2mL的过滤式固相萃取柱中，柱内分散有石墨烯和N-丙基乙二胺各15mg，无水硫酸镁20mg；并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，缓慢推动注射器推杆使得萃取液经过固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；所得滤液即空白样品基质溶液。
3.根据权利要求1或2所述的测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于，萃取液经过固相萃取柱的速度为每分钟20-25滴。
4.根据权利要求1所述的测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于：步骤d中基质混合标准工作溶液的具体配制方式如下：分别称取10mg异丙菌胺与氟吡菌酰胺农药标准品至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0 mg/mL的标准储备液；分别移取两种农药单一标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，配得混合标准储备液，浓度10μg/mL；分别移取混合标准储备液25μL, 50μL, 100μL, 250 μL , 500μL 及1000μL到6个10 mL容量瓶中，用乙腈定容；配制的各标准工作溶液的浓度分别为0.025μg/mL, 0.05μg/mL, 0.1μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0μg/mL；分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品基质溶液混合，并加入600μL乙腈；配制的各基质混合标准工作溶液浓度分别为0.005μg/mL, 0.01μg/mL, 0.02μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2μg/mL。
5.根据权利要求1所述的测定烟草中异丙菌胺和氟吡菌酰胺的方法，其特征在于：所述质谱条件中MRM参数如表2所示：
表2质谱条件
Figure DEST_PATH_IMAGE001
*定量离子。
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