CN111912929A - 一种黄曲霉毒素b1的提取方法及应用 - Google Patents

一种黄曲霉毒素b1的提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种黄曲霉毒素B1的提取方法和黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法，包括以下步骤：将样品用水分散浸泡，加入萃取剂，然后加入缓冲盐及净化剂，离心过滤，得有机相提取液；将团聚剂加入得到的有机相提取液中，加入pH调节剂，调节pH值为6‑9；振荡混匀，静置分层，取水层，即为无机相提取液。将制备得到的Au溶胶加入到无机相提取液中，可得待测溶液；并采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。本发明不需要专业技术人员，也无需任何大型仪器设备，操作简单，成本低，速度快，使用便携式拉曼光谱仪，便于携带，易推广，是一种非常适合用于现场快速检测的SERS方法。

Description

一种黄曲霉毒素B1的提取方法及应用
技术领域
本发明涉及一种致癌物质的提取及检测方法，具体涉及一种黄曲霉毒素B1的提取方法和黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法。
背景技术
拉曼光谱是基于拉曼散射效应的一种分子振动与转动光谱，可以在无损的情况下提供样品分子的结构信息，并对样品进行组成和分子结构分析，从而实现对分子进行定性分析。拉曼光谱强度与散射分子数呈正相关，可实现对分子进行半定量－定量分析，于是拉曼光谱在诸多领域都得到了广泛的应用。然而由于光谱检测灵敏度低的原因，使得其的实际应用在一定程度上受到限制。
拉曼(SERS)检测技术是一种新型的快速检测技术，具有灵敏度高、荧光背景低、不受水干扰、操作简便、可实现痕量无损检测、便携式设备等优点。自发现以来，SERS技术在食品安全、环境监测、生物技术、医学鉴定、药物分析、材料科学、公共安全、表面科学等领域得到了广泛的应用。除此之外，便携式拉曼光谱仪具有便于携带、操作简单、野外实时检测等特点，可以更加方便人们进行现场实时快速检测样品。
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin.AFT)是一种真菌有毒代谢产物，由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉产生，能够导致肝脏坏死癌变、肺癌、结肠癌、胃癌、肾肿瘤等，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。主要存在于霉变的玉米、谷物、花生、果仁和大米等粮食作物中，全世界每年约25％的粮食受其污染，对粮食安全造成严重威胁。我国每年因此造成粮食损失150-200亿公斤，经济损失约180-240亿元，严重威胁着我国粮食产品的质量安全。因此，分析检测粮食产品中黄曲霉毒素B1的含量水平对保障我国食品质量安全具有极其重要的意义。
目前黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱－质谱联用法(LC－MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析方法(GICA)等。TLC法操作步骤多、样品前处理烦琐。HPLC和LC－MS需要大型仪器设备、价格昂贵，且需要专门的技术人员。ELISA和GICA这两种方法都是利用抗原、抗体特异性反应的原理，检测成本较高，检测结果存在假阳性等不足。因此，基于拉曼检测技术，对于粮食产品中黄曲霉毒素B1建立一种检测速度快、检测成本低的方法就尤为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种黄曲霉毒素B1的提取方法及利用便携式拉曼光谱仪快速、低成本、现场检测粮食产品中黄曲霉毒素B1含量的方法。
本发明第一方面提供了一种黄曲霉毒素B1的提取方法，包括以下步骤：
S1:将样品用水分散浸泡，加入萃取剂，然后加入缓冲盐及净化剂，离心过滤，得有机相提取液；
S2：将团聚剂加入步骤S1得到的所述有机相提取液中，加入pH调节剂，调节pH值为6.5-9；振荡混匀，静置分层，取上层清液，即为无机相提取液。
若有机相提取液的pH值小于6.5，黄曲霉毒素B1分子则无法从有机相转移到水相；若pH值大于9，黄曲霉毒素B1分子在碱性条件下会分解；由于黄曲霉毒素B1分子存在于有机相提取液中，如果不调节有机相提取液的pH值，黄曲霉毒素B1分子无法转移到水相，用SERS方法无法检测到黄曲霉毒素B1的拉曼信号。
进一步的，所述萃取剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正丁醇、环己烷和丙酮中的一种或几种。
进一步的，所述萃取剂中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为(3-6)：1，其中正己烷也可以是乙酸乙酯、正丁醇、环己烷和丙酮中的一种。
进一步的，所述萃取剂中三氯甲烷和正己烷的摩尔比为(3-6)：1，其中正己烷也可以是乙酸乙酯、正丁醇、环己烷和丙酮中的一种。
进一步的，所述缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物。
进一步的，所述缓冲盐及净化剂中MgSO4与NaCl的质量比为(3-5):1，PSA与C18的质量比为(6-4)：3。
进一步的，所述pH调节剂为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸氢钠溶液和磷酸二氢钠溶液中的一种或几种。
进一步的，所述团聚剂为KBr、NaCl、HCl、KI和KCl中的一种优选的团聚剂为KI。
本发明第二方面提供一种黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法，包括Au溶胶的制备；以及将制备得到的Au溶胶加入到如本发明所述的黄曲霉毒素B1的提取方法得到的无机相提取液中，即可得待测溶液；采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
进一步的，所述Au溶胶的制备具体为，取1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得Au溶胶，其中HAuCl4和柠檬酸钠的摩尔比为5：3。
进一步的，所述Au溶胶中Au粒子直径为40-100nm。
现有的黄曲霉毒素B1的SERS检测方法中，基底的制备复杂且耗时，技术性较强，且不能直接获得黄曲霉毒素B1的拉曼信号，只能通过标记的信号分子间接表达黄曲霉毒素B1，或者通过抗原抗体、适配体特异性结合的方式，或者通过磁性纳米粒子修饰，以及制备3D结构的检测基底等方法来检测黄曲霉毒素B1。这些方法实验过程复杂，修饰的信号分子、抗原、抗体以及适配体等成本较高，专业技术性较强，且不能满足现场快速检测的需求。此外，用HPLC或LC－MS等方法来检测黄曲霉毒素B1，需要大型仪器设备、价格昂贵，对实验场地以及环境有一定的要求，且需要专业的技术人员操作。
相较于先前技术，本发明提供了一种黄曲霉毒素B1的无机相提取液方法，及在此基础上利用团聚剂使Au纳米粒子团聚进行利用便携式拉曼光谱仪对黄曲霉毒素B1进行检测。本发明的方法用于检测黄曲霉毒素B1的基底制备简单，前处理操作便捷，只需要简单调节有机相提取液的pH值，使黄曲霉毒素B1分子从有机相提取液转移到水相，再通过加入团聚剂，使Au溶胶团聚，直接获得黄曲霉毒素B1的SERS信号。这种方法不需要专业技术人员，也无需任何大型仪器设备，操作简单，成本低，速度快，使用便携式拉曼光谱仪，便于携带，易推广，是一种非常适合用于现场快速检测的SERS方法。
附图说明
图1为Au溶胶中金纳米粒子的扫描电镜表征图；
图2为不同浓度黄曲霉毒素B1标准品的SERS标准曲线；
图3为黄曲霉毒素B1的提取方法和其在拉曼检测中的应用流程图；
图4为实施例2样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图5为实施例3样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图6为实施例4样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图7为实施例5样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图8为实施例6样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图9为实施例7样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图10为实施例8质控样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图11为实施例9样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图12为实施例10样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图；
图13为实施例11样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图。
具体实施方式
以下藉由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技艺的人士的了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如「上」、「内」、「外」、「底」、「一」、「中」等用语，也仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当也视为本发明可实施的范畴。
以下以实施例说明本发明所提供制备方法的详细制作流程与条件。
实施例1
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～100nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。图1为Au溶胶中金纳米粒子的扫描电镜表征图，可见Au粒子直径均一，为40-100nm。
不同浓度黄曲霉毒素B1标准品的SERS标准曲线。配置含有不同浓度黄曲霉毒素B1的标准溶液，加入团聚剂和Au纳米粒子进行SERS检测。例如图2为团聚剂是KI条件下不同浓度黄曲霉毒素B1标准品的SERS标准曲线，具体为将黄曲霉毒素B1特征峰的峰面积取对数和其浓度做图，两变量呈线性，相关系数为0.9836。
自然的，在检测过程中，使用不同的团聚剂进行拉曼检测所得到的图谱特征峰强度，需要根据相应的团聚剂制备得到的不同浓度黄曲霉毒素B1标准品的SERS标准曲线图来进行样品中黄曲霉毒素B1的浓度取值。
在样品玉米粉中分别添加低、中、高浓度的黄曲霉毒素B1标准品进行回收实验，以下实施例2-8为不同样品中黄曲霉毒素B1的回收加标实验。
实施例2
参考图3，为黄曲霉毒素B1的提取方法和其在拉曼检测中的应用流程图。
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为5μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为三氯甲烷和正丁醇的混合物，其中三氯甲烷和正丁醇的摩尔比为6:1，漩涡混匀1min，然后加入3g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为3:1，PSA与C18的质量比为5:3。继续涡旋3min，在5000r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将150μL团聚剂NaCl(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入碳酸氢钠溶液调节其pH值为7.2，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～60nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将200μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图4所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为4.33μg/kg，回收率为86.6％，满足方法回收率的要求。
实施例3
本实施例采用的样品玉米粉中黄曲霉毒素B1添加含量为50μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和正己烷的混合物，其中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为(3-6):1，漩涡混匀1min，然后加入2.5g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1，PSA与C18的质量比为2:1。继续涡旋3min，在5000r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将150μL团聚剂KI(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钠溶液调节其pH值为6-7，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～60nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将100μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图5所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为45.3μg/kg，回收率为90.6％，满足方法回收率的要求。
实施例4
本实施例采用的样品玉米粉中黄曲霉毒素B1添加含量为100μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为三氯甲烷和乙酸乙酯的混合物，其中三氯甲烷和乙酸乙酯的摩尔比为5:1，漩涡混匀1min，然后加入3g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为5:1，PSA与C18的质量比为4:3。继续涡旋4min，在5500r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将120μL团聚剂KBr(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钾溶液调节其pH值为7，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的60～80nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将150μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图6所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为82.1μg/kg，回收率为82.1％，满足方法回收率的要求。
实施例5
本实施例采用的样品玉米粉中黄曲霉毒素B1添加含量为20μg/kg。
将待测食物样品用水分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和正己烷的混合物，其中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为(3-6):1，漩涡混匀1min，然后加入2g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1，PSA与C18的质量比为5:3。继续涡旋3min，在4000r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将100μL团聚剂KI(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钠溶液调节其pH值为6-7，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
若有机相提取液的pH值小于6.5，黄曲霉毒素B1分子则无法从有机相转移到水相；若pH值大于9，黄曲霉毒素B1分子在碱性条件下会分解；由于黄曲霉毒素B1分子存在于有机相提取液中，如果不调节有机相提取液的pH值，黄曲霉毒素B1分子无法转移到水相，用SERS方法无法检测到黄曲霉毒素B1的拉曼信号。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～60nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将200μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图7所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为18.9μg/kg，回收率为94.5％，满足方法回收率的要求。
实施例6
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为20μg/kg,将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和环己烷的混合物，其中二氯甲烷和环己烷的摩尔比为(3-6)：1，漩涡混匀1min，然后加入2.5g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为3:1，PSA与C18的质量比为2:1。继续涡旋3min，在4500r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将100μL团聚剂HCl(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入磷酸二氢钠溶液调节其pH值为7-8，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～60nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将250μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图8所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为17.03μg/kg，回收率为85.2％，满足方法回收率的要求。
实施例7
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为50μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为三氯甲烷和丙酮的混合物，其中三氯甲烷和丙酮的摩尔比为(3-6)：1，漩涡混匀1min，然后加入3g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1，PSA与C18的质量比为2:1。继续涡旋3min，在5000r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将120μL团聚剂KCl(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钾溶液调节其pH值为6.8，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的60～80nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将300μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图9所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为43.7μg/kg，回收率为87.3％，满足方法回收率的要求。
实施例8
玉米粉质控样品中黄曲霉毒素B1的检测。分别对含量为23.0μg/kg、78.0μg/kg的玉米粉质控样品进行检测(质控样品购于国家标准物质中心，玉米粉中黄曲霉毒素B1的含量经高效液相色谱方法鉴定)，采用上述实施例4和实施例5中的方法来对本发明方法进行验证。玉米粉质控样品的SERS谱图如图10所示，两种质控样品用本方法测得三次实验结果的平均值分别为20.7μg/kg和69.8μg/kg，相对标准偏差分别为12.9％和10.4％。
实施例9
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为100μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和正己烷的混合物，其中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为5.5：1，漩涡混匀1min，然后加入3g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为5:1，PSA与C18的质量比为2:1。继续涡旋3min，在4500r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将150μL团聚剂Na2SO4(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钠溶液调节其pH值为6.8，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的60～80nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将200μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图11所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图。由图可知，测得三次实验结果的平均值为3.03μg/kg，几乎未检测到黄曲霉毒素B1的SERS信号。因此，Na2SO4团聚剂不适用于黄曲霉毒素B1的检测。
实施例10
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为100μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和正己烷的混合物，其中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为4：1，漩涡混匀1min，然后加入2.5g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为5:1。继续涡旋3min，在4500r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将150μL团聚剂KI(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钠溶液调节其pH值为7，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的60～80nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将200μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图12所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为55.0μg/kg，回收率为55％，回收率偏低。因此，缓冲盐和净化剂的添加对实验结果有影响。
实施例11
本实施例采用的样品小麦粉中黄曲霉毒素B1添加含量为100μg/kg，将待测食物样品用水充分分散浸泡5h，加入5mL萃取剂，萃取剂为二氯甲烷和正己烷的混合物，其中二氯甲烷和正己烷的摩尔比为5：1，漩涡混匀1min，然后加入2.5g缓冲盐及净化剂，缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、C18的混合物，其中硫酸镁与氯化钠的质量比为4:1。继续涡旋3min，在5000r/min条件下离心，过滤得到上清液，上清液即为黄曲霉毒素B1的有机相提取液。
将150μL团聚剂KI(0.1M)加入到有机相提取液中混合，加入氢氧化钠溶液调节其pH值为7.3，振荡混匀，使黄曲霉毒素B1分子从有机相转移到无机相，静置分层，取上层无机相清液，即为黄曲霉毒素B1的无机相提取液。
Au溶胶的制备：本发明采用浓缩Au溶胶用于表面增强拉曼检测信号的增强。Au溶胶的制备是利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，合成带有柠檬酸钠保护层的40～60nm金纳米粒子。首先取2.424mL 1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得到Au溶胶备用。
将150μL制备得到的Au溶胶溶液加入到黄曲霉毒素B1的无机相提取液，混匀后得待测溶液。采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
如图13所示，为本实施例样品的黄曲霉毒素B1的SERS谱图，测得三次实验结果的平均值为57.6μg/kg，回收率为57.6％，回收率偏低。因此，缓冲盐和净化剂的添加对实验结果有影响。
本发明的检测方法与其它SERS方法不同，其它方法基底的制备复杂且耗时，技术性较强，且不能直接获得黄曲霉毒素B1的拉曼信号，只能通过标记的信号分子间接表达黄曲霉毒素B1，或者通过抗原抗体、适配体特异性结合的方式，或者通过磁性纳米粒子修饰，以及制备3D结构的检测基底等方法来检测黄曲霉毒素B1。这些方法实验过程复杂，修饰的信号分子、抗原、抗体以及适配体等成本较高，专业技术性较强，且不能满足现场快速检测的需求。此外，用HPLC或LC－MS等方法来检测黄曲霉毒素B1，需要大型仪器设备、价格昂贵，对实验场地以及环境有一定的要求，且需要专业的技术人员操作。本发明方法用于检测黄曲霉毒素B1的基底制备简单，前处理操作便捷，只需要简单调节有机相提取液的pH值，使黄曲霉毒素B1分子从有机相提取液转移到水相，再通过加入团聚剂，使Au溶胶团聚，直接获得黄曲霉毒素B1的SERS信号。这种方法成本低，速度快，使用便携式拉曼光谱仪，便于携带，易推广，是一种非常适合用于现场快速检测的SERS方法。
上述实施例仅用以例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟习此项技艺的人士均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修改。因此本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。

Claims (9)

1.一种黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将样品用水分散浸泡，加入萃取剂，然后加入缓冲盐及净化剂，离心过滤，得有机相提取液；
S2：将团聚剂加入步骤S1得到的所述有机相提取液中，加入pH调节剂，调节pH值为6-9；振荡混匀，静置分层，取水层，即为无机相提取液。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，所述萃取剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正丁醇、环己烷和丙酮中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，所述缓冲盐及净化剂为MgSO4、NaCl、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、PSA、C18的混合物。
4.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，所述缓冲盐及净化剂中MgSO4与NaCl的质量比为(3-5):1，PSA与C18的质量比为(6-4):3。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，所述pH调节剂为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸氢钠溶液和磷酸二氢钠溶液中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于，所述团聚剂为KBr、NaCl、HCl、KI和KCl中的一种。
7.一种黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法，其特征在于，包括Au溶胶的制备；以及将制备得到的Au溶胶加入到如权利要求1至6任一项黄曲霉毒素B1的提取方法得到的无机相提取液中，即可得待测溶液；采用便携式拉曼光谱仪对待测溶液进行检测。
8.根据权利要求7所述的黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法，其特征在于，所述Au溶胶的制备具体为，取1％的HAuCl4溶液加入50mL水中，加热煮沸，再加入1％的柠檬酸钠溶液，继续加热30min，冷却至室温，即得Au溶胶，其中HAuCl4和柠檬酸钠的摩尔比为5：3。
9.根据权利要求7所述的黄曲霉毒素B1的拉曼检测方法，其特征在于，所述Au溶胶中Au粒子直径为40-100nm。
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