CN110007042A

CN110007042A - 谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法

Info

Publication number: CN110007042A
Application number: CN201910337159.5A
Authority: CN
Inventors: 俞明正; 徐剑宏; 董飞; 王淑芳; 张笑; 赫丹; 史建荣
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明公开了一种谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，包括以下步骤：取谷物样品，打成粉末后过筛备用；将乙腈、水和甲酸混合后，加入粉末样品中，振荡混合均匀后离心，收集上清液；取上清液注入EP管中，涡旋振荡后离心，将上层清液吸出后吹干，吹干后的残渣溶解后过滤，收集滤液，作为待测样品提纯液；将待测样品提纯液注入液相色谱仪，采用液相色谱‑质谱联用进行检测。本发明采用QuEChERS结合高效液相色谱‑质谱联用仪，提出一种简单、快速、准确的粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的一次性快速筛查检测技术，成本低、操作简便、灵敏度高、稳定性强，为明确粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的污染及控制、保障粮谷质量安全奠定了技术基础。

Description

谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法。

背景技术

真菌毒素是一类由丝状真菌在适宜的环境条件下产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于小麦、玉米等谷物中。人或动物摄入被真菌毒素污染的食物可能会引发多种中毒症状，严重时可危害到人或动物的生命安全。已确认化学结构的真菌毒素达400余种，其中，对人体健康危害最大的主要有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素(FBS)等。而多毒素污染在粮谷中存在一定的普遍性，因此，建立粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的一次性快速筛查技术为明确粮谷产品质量安全和保障消费者身体健康等方面提供了有力的技术支持，具有重要的现实意义。

目前，粮谷中真菌毒素的前处理方法主要有薄层层析法(TLC)，此方法虽然对仪器的要求不高，检测的成本也相对较低，但一般只适用于半定量，并不适合绝对定量分析；固相萃取法(SPE)是目前粮谷中真菌毒素分析的主要前处理方法，它具有操作相对简单，具有较好的选择性，可自动化批处理等优点，但该方法回收率低，且固相萃取柱的填料容易被堵塞；免疫亲和柱净化法(IAC)具有选择性强，样品净化效果好等优点，但其成本昂贵、检测参数相对单一，操作机械强度低；酶联免疫吸附法(ELISA)检测速度快、选择性强，但操作繁琐，容易受非目标物干扰，从而出现假阳性；液相微萃取具有富集效率高、操作简单等优点，但其稳定性差，重复使用性不佳；磁分离法富集效果好，操作简便，具有一定的机械强度和化学稳定性，但选择性较差；QuEChERS(Quick，Easy，Effective，Rugged，Safe)方法是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，从而达到去除杂质的净化目的，因其分析速度快、操作简便、回收率好、安全性高等特点，近年来已渐渐的成为了真菌毒素检测常用的前处理方法。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法。所述技术方案如下：

一方面，一种谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，包括以下步骤：

(1)取谷物样品，打成粉末后过筛备用；

(2)将乙腈、水和甲酸混合后，加入粉末中，振荡混合均匀后离心，收集上清液；

(3)取上清液注入EP管中，涡旋振荡后离心，将上层清液吸出后吹干，吹干后的残渣溶解后过滤，收集滤液，作为待测样品提纯液；

(4)将待测样品提纯液注入液相色谱仪，采用液相色谱-质谱联用进行检测。

进一步的，步骤(4)中液相色谱-质谱联用进行检测的方法包括：

色谱条件：色谱柱：C18，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流动相梯度程序：初始流动相为10％B，保持1min，1min至3min，升到35％B，3-5min升到90％B，5-11min维持90％B，11.01min回到初始流动相，共15min；

质谱条件：离子化方式：电喷雾电离子源；扫描方式：多反应监测模式；离子源温度500℃；雾化气50psi；辅助气50psi；气帘气35psi；喷雾电压：5500V；碰撞室射出电压：10V。

进一步的，电喷雾电离子源为ESI+。

进一步的，步骤(3)取上清液2mL注入含有分散固相萃取净化填料的4mL EP管中。

进一步的，分散固相萃取净化填料为硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，柠檬酸钠0.1g，C180.1g。

进一步的，步骤(2)中以2500r/min，涡旋振荡5min，然后5000r/min离心5min。

进一步的，步骤(3)中以2500r/min，涡旋振荡1min，然后5000r/min离心5min。

进一步的，步骤(1)中粉末过2.00mm孔筛。

进一步的，步骤(2)将乙腈、水和甲酸以50:49:1的体积比混合，然后按照体积质量比4:1加入粉末中。

进一步的，步骤(3)中将上层清液吸出后，室温下用氮气吹干，吹干后的残渣，溶解于中含1％甲酸的50％甲醇溶液，然后用0.22μm的滤膜过滤。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，采用QuEChERS结合高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)，通过采用安普公司生产的氯化钠、无水硫酸镁、柠檬酸二钠和C18等4种净化填料对粮谷样品中磷酯、蛋白等杂质净化效果的研究，提出一种简单、快速、准确的粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的一次性快速筛查检测技术。本发明的检测方法成本低、萃取速度快、操作简便、灵敏度高、回收率好、稳定性强，为明确粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的污染及控制、保障粮谷质量安全奠定了技术基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明中4种伏马毒素及其衍生物阳性样品的TIC总离子流图。

图2是本发明中4种伏马毒素及其衍生物阳性样品的选择反应监测(SRM)图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

(1)样品提取与净化

将乙腈、水和甲酸以50:49:1的体积比混合后，按照体积质量比4:1加入谷物样品粉末(粉末过2.00mm孔筛)中，置于多管式涡旋振荡器上以2500r/min，涡旋振荡5min，然后5000r/min离心5min，收集上清液。

取上清液2mL注入含有分散固相萃取净化填料的4ml EP管中(CNWBOND硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，柠檬酸钠0.1g，C180.1g)，置于多管式涡旋振荡器上以2500r/min，涡旋振荡1min，5000r/min离心5min，将所有上层清液吸出，室温下用氮气吹干，吹干后的残渣溶解于体积比为50％的甲醇水溶液(含1％甲酸)中，过0.22μm的滤膜，收集滤液，即为待测样品提纯液。

(2)液相色谱-质谱联用分析

色谱条件：

色谱柱：AgilentXDB C18，3.5μm，2.1×150mm。

柱温：40℃；进样量：3μL；流速：0.4mL/min。

流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：甲醇。

流动相梯度程序见表1。

表1流动相梯度程序

时间	流动相A	流动相B
			0min	90％	10％
1min	90％	10％
			3min	65％	35％
5min	10％	90％
			11min	10％	90％
11.01min	90％	10％
			15min	90％	10％

质谱条件：

离子化方式：电喷雾电离子源(ESI+)。

扫描方式：多反应监测模式(MRM)。

离子源温度500℃；雾化气50psi；辅助气50psi；气帘气35psi。

喷雾电压：5500V。

碰撞室射出电压：10V。

各伏马毒素及其衍生物质谱参数见表2、图1和图2。

表2伏马毒素及其衍生物质谱离子参数

如图1所示，15分钟内一次性进样，同时检测谷物中伏马毒素B₁(FB₁)、伏马毒素B₂(FB₂)、伏马毒素B₃(FB₃)和水解伏马毒素B₁(HYFB₁)4种伏马毒素，4种毒素色谱图的峰形良好，分离度高，能满足定性和定量的要求。如图2所示，4种伏马毒素均给出了相应的定性和定量离子相关的离子信息和色谱图。

(3)建立标准曲线

分别准确称取伏马毒素B₁(FB₁)、伏马毒素B₂(FB₂)、伏马毒素B₃(FB₃)、水解伏马毒素B₁(HY-FB₁)标准物质，用50％的甲醇稀释成10μg/ml的混合标准储备溶液。

将4种伏马毒素的混合标准储备溶液用空白基质溶液稀释成五个不同浓度的标准工作液，将标准工作液上机测试，外标法定量，建立响应值与浓度的线性拟合方程。

空白基质溶液为不含伏马毒素及其衍生物的空白样品，按照(1)样品提取与纯化步骤中的方法进行提取所得到的50％甲醇(含1％甲酸)溶液。

(4)检出限(LOD)和定量限(LOQ)

以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比作为定量限，4种伏马毒素的检出限和定量限见表3。

表3 4种伏马毒素的检出限和定量限

化合物	LOD(μg/kg)	LOQ(μg/kg)
			FB<sub>1</sub>	0.005	0.02
FB<sub>2</sub>	0.003	0.01
			FB<sub>3</sub>	0.003	0.01
HYFB<sub>1</sub>	0.005	0.02

(5)回收率和精密度

回收率实验：采用基质加标法对方法，对空白基质中添加高、中、低三个水平4种伏马毒素的混合标准储备溶液，按本发明的方法进行处理，每个处理做3个重复，添加回收率的结果见表4。

日内精密度(RSDr)试验：空白基质中加入高、中、低三个浓度水平的4种伏马毒素的混合标准储备溶液(添加浓度同回收率实验)，在同一天内，按照本发明的方法进行处理，每个处理3个重复。

日间精密度(RSDR)试验：空白基质中加入高、中、低三个浓度水平的4种伏马毒素的混合标准储备溶液(添加浓度同回收率实验)，在连续的5天内，按照本发明的方法进行处理，每个处理3个重复。

回收率及精密度结果见表4

表4不同基质中4种伏马毒素的回收率及精密度(n＝3)

采用基质加标法对方法的回收率进行考察，低、中、高三个浓度3个平行的添加回收率范围为80.26％-113.28％，相对标准偏差1.98％-8.23％。

上述4种伏马毒素在小麦和玉米基质中的日内精密度范围为1.98％-7.64％，日间精密度范围为2.34％-8.23％。

本发明的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，采用QuEChERS结合高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)，通过采用安普公司生产的氯化钠、无水硫酸镁、柠檬酸二钠和C18等4种净化填料对粮谷样品中磷酯、蛋白等杂质净化效果的研究，提出一种简单、快速、准确的粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的一次性快速筛查检测技术。本发明的检测方法成本低、萃取速度快、操作简便、灵敏度低、回收率好、稳定性强，为明确粮谷中谷物伏马毒素及其衍生物的污染及控制、保障粮谷质量安全奠定了技术基础。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取谷物样品，打成粉末后过筛备用；

(2)将乙腈、水和甲酸混合后，加入所述粉末中，振荡混合均匀后离心，收集上清液；

(3)取所述上清液注入EP管中，涡旋振荡后离心，将上层清液吸出后吹干，吹干后的残渣溶解后过滤，收集滤液，作为待测样品提纯液；

(4)将所述待测样品提纯液注入液相色谱仪，采用液相色谱-质谱联用进行检测。

2.如权利要求1所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中液相色谱-质谱联用进行检测的方法包括：

3.如权利要求2所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述电喷雾电离子源为ESI+。

4.如权利要求3所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)取上清液2mL注入含有分散固相萃取净化填料的4mL EP管中。

5.如权利要求4所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述分散固相萃取净化填料为硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，柠檬酸钠0.1g，C180.1g。

6.如权利要求5所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中以2500r/min，涡旋振荡5min，然后5000r/min离心5min。

7.如权利要求6所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中以2500r/min，涡旋振荡1min，然后5000r/min离心5min。

8.如权利要求7所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述粉末过2.00mm孔筛。

9.如权利要求8所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)将乙腈、水和甲酸以50:49:1的体积比混合，然后按照体积质量比4:1加入所述粉末中。

10.如权利要求9所述的谷物伏马毒素及其衍生物的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中将上层清液吸出后，室温下用氮气吹干，吹干后的残渣，溶解于中含1％甲酸的50％甲醇溶液，然后用0.22μm的滤膜过滤。