CN103675175A - 一种测定植物油中农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定植物油中农药残留的方法，包括（1）样品处理；（2）标准溶液的配制；（3）色谱条件：Restek C18色谱柱；柱温35℃；平衡时间5min；进样量10μL；流速0.5mL/min；流动相：A溶液10mMol乙酸铵水溶液和B溶液10mMol乙酸铵甲醇溶液；（4）质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；编程的多反应监测模式；气帘气15L/min；GS1雾化气60L/min；GS2辅助加热气70L/min；CAD碰撞气中；辅助加热气温度500℃；喷雾电压5000v。本发明建立了橄榄油、棕榈油和花生油这三种常用植物油脂中多种农药残留的高通量检测方法，并用于其品质监控。

Description

一种测定植物油中农药残留的方法

技术领域

本发明涉及一种测定植物油中农药残留的方法，具体涉及一种利用分散固相萃取与超高效液相色谱-串联质谱法联用，来测定植物油中一种或多种农药残留的方法。 

背景技术

随着农业科学技术和经济水平的提高，农产品已基本满足数量安全的要求，人们越来越关注农产品与食品的质量安全情况。我国是世界第一植物油消费大国，但我国对于植物油中农药残留的研究远远落后于国际水平。 

植物油高含油量的特点给农药残留的提取和净化造成很大困难，因此采用合适的前处理技术有效去除油料和植物油中的脂肪，减少对仪器的损伤是多农药残留检测方法建立的关键。传统的油脂检测方法中，多采用液液萃取（LLE）以及近年来兴起的加速溶剂萃取技术（ASE）和凝胶色谱技术（GPC），但这些前处理方法普遍存在设备昂贵，有机试剂消耗量大，前处理时间长，无法大批量同时进行的缺憾。 

另外，传统检测方法中多使用气相色谱（GC）和气相色谱-质谱（GC/MS），在面对某些极性较强的除草剂、有机磷类的农药时，因为其在GC-MS上的灵敏度本身就比较差，导致方法检测限量偏高。但这些具有高效分离能力的技术，在对分离后各组分的定性鉴定方面显得无能为力。在农药残留检测过程中,本底干扰不容忽视,特别是在残留浓度很低的情况下,仅依靠保留时间定性很困难,必须有质谱数据即化合物结构信息,才能准确判断。欧盟和美国要求农残的确认必须有质谱数据。依托近年来液相色谱与质谱技术联用的迅猛发展，液相色谱-串联质谱凭借其高分离能力、适用范围极广及高灵敏度、高选择性，已成为农药多残留分析应用最广泛的联用技术。 

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种测定植物油中农药残留的方法，具体涉及一种利用分散固相萃取与超高效液相色谱-串联质谱法联用来测定植物油中多种农药残留的方法。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

本发明的一种测定植物油中多种农药残留的方法，包括如下步骤： 

（1）样品处理：称取5.00g植物油样品，加入5mL正己烷、5mL超纯水、5mL乙腈和2g氯化钠，振荡10min，以4000r/min离心5min，移去上层清液，下层重复提取一次；合并提取液，冷冻2h，取1.0mL上清液与150mg无水硫酸镁、50mg乙二胺-N-丙基PSA和50mgC18粉末混合，12000r/min离心5min，取0.5mL上清液与0.5mL超纯水混合，过0.2μm滤膜，装瓶待测； 

（2）标准溶液的配制：标准物质购自Dr.Ehrenstorfer公司商品混标，其规格为10.0μg/mL，纯度≧96.0%，使用前保存于-18℃； 

（3）色谱条件： 

Restek C18色谱柱：3μm，2.1×100mm，Restek,美国； 

柱温：35℃； 

平衡时间：5min； 

进样量：10μL； 

流速：0.5mL/min； 

流动相：采用A溶液10mMol乙酸铵水溶液和B溶液10mMol乙酸铵甲醇溶液作为组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0－8min，B由20.0%－90.0%；8－12min，B由90.0%－100.0%；12－14.8min，B保持100.0%；14.8－14.9min，B由100.0%－20.0%；15.0min停止； 

（4）质谱条件： 

电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描； 

检测方式：编程的多反应监测模式； 

气帘气：15L/min； 

GS1雾化气：60L/min； 

GS2辅助加热气：70L/min； 

CAD碰撞气：中； 

辅助加热气温度：500℃； 

喷雾电压：5000v。 

优选的，上述步骤（1）中的样品的待测浓度为0μg/L‐30.0μg/L。 

所述植物油包括棕榈油、花生油或橄榄油中的一种或多种。 

本发明以近百种常用农药为分析对象，采用分散固相萃取技术作为前处理手段，与超高效液相色谱-串联质谱联用，建立了橄榄油、棕榈油和花生油这三种常用植物油脂中多种农药残留的高通量检测方法，并用于植物油脂的品质监控。 

附图说明

图1.1为重复两次使用第一组流动相体系的分离效果图； 

图1.2为重复两次使用第二组流动相体系的分离效果图； 

图1.3为重复两次使用第三组流动相体系的分离效果图； 

图1.4为重复两次使用第四组流动相体系的分离效果图； 

图1.5是全局色谱图； 

图1.6是全局色谱图； 

图2.1、图2.2、图2.3、图2.4是使用A、B、C、D、E、F六组提取溶剂提取不同化合物的响应值比较的结果图； 

图3为冷冻时间优化图，其中，A、B、C、D、E、F分别表示实施例2中的A－F的六种提取方案； 

图4.1、图4.2、图4.3、图4.4是D－SPE条件的优化实验结果比较图； 

图5.1是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测毒死蜱（Chlorpyrifos）的基质效应考察结果图； 

图5.2是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测乐果（Dimethoate）的基质效应考察结果图； 

图5.3是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测倍硫磷（Fenthion）的基质效应考察结果图； 

图5.4是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测杀扑磷（Methidathion）的基质效应考察结果图。 

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域中常规实验方法进行。 

仪器与试剂： 

API4000串联质谱仪：美国应用生物系统公司；配Shimadzu LC20液相色谱仪、四元低压梯度输液泵、自动进样器、柱温箱；电喷雾离子源，AB公司Analyst1.5.1仪器控制及数据处理软件。 

乙腈、甲醇为色谱纯(TEDIA公司,美国)，无水硫酸镁、氯化钠、PSA粉、二水合柠檬 酸钠、倍半水合柠檬酸二钠均为分析纯(Sigma–Aldrich，Missouri,美国)，乙酸铵为质谱级(Fluka Chemie AG,Buchs,德国)。实验所有用水均为超纯水(Millipore,美国)。标准物质均购自Dr.Ehrenstorfer公司商品混标（10.0μg/mL，纯度≧96.0%）。 

标准溶液的配制：所用标准溶液为10.0μg/mL商品化混合标准，标准物质均购自Dr.Ehrenstorfer公司商品混标（10.0μg/mL，纯度≧96.0%），使用前保存于-18℃，工作曲线使用前配置。 

检测目标物的相关质谱信息见表1，表1为各目标化合物的质谱参数。 

表1 

实施例1：色谱条件的优化 

待检测的104种目标化合物性质差异较大，流动相体系的选择对分离效果起到重要作用，在本实施例中，在乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、乙酸铵甲醇溶液-乙酸铵水溶液四种溶液中选择最佳的流动相体系。 

色谱柱条件具体如下： 

Restek C18色谱柱（3μm，2.1×100mm，Restek,美国）； 

柱温：35℃； 

平衡时间：5min； 

进样量：10μL； 

流速：0.5mL/min； 

流动相：采用溶液A和溶液B组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0－8min，B由20.0%-90.0%；8-12min，B由90.0%-100.0%；12-14.8min，B保持100.0%；14.8-14.9min，B由100.0%－20.0%；15.0min停止。上述百分数是溶液B占由溶液A和溶液B组成的流动相的体积百分比。 

上述流动相体系选用四组不同的流动相体系，分别为： 

第一组流动相体系：10mMol乙腈-水；其中，A为水，B为10mMol乙腈； 

第二组流动相体系：10mMol甲醇-水；其中，A为水，B为10mMol甲醇； 

第三组流动相体系：10mMol甲醇-10mMol乙酸铵溶液；其中，A为10mMol乙酸铵溶液，B为10mMol甲醇； 

第四组流动相体系：10mMol乙酸铵甲醇溶液-10mMol乙酸铵水溶液，其中，A为10mMol乙酸铵水溶液，B为10mMol乙酸铵甲醇溶液。 

图1.1为重复两次使用第一组流动相体系的分离效果图；图1.2为重复两次使用第二组流动相体系的分离效果图；图1.3为重复两次使用第三组流动相体系的分离效果图；图1.4为重复两次使用第四组流动相体系的分离效果图；图1.5是全局色谱图，图1.6是全局色谱图。 

由上述图1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6比较分析可见，在10m Mol乙酸铵甲醇溶液-10m Mol乙酸铵水溶液下大部分化合物有较高的响应值且峰型尖锐对称，也就是说，采用第四组流动相体系，其分离效果较好。 

因此，本方法采用第四组流动相体系10m Mol乙酸铵甲醇溶液-10m Mol乙酸铵水溶液作为流动相体系。 

综上，色谱质谱条件为：色谱柱：Restek C18色谱柱（3μm，2.1×100mm，Restek,美国）；柱温：35℃；平衡时间：5min；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；流动相：采用10mMol乙酸铵水溶液（A）和10mMol乙酸铵甲醇溶液（B）组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0－8min，B由20.0%－90.0%；8－12min，B由90.0%－100.0%；12－14.8min，B保持100.0%；14.8－14.9min，B由100.0%－20.0%；15.0min停止。 

流动相中加入适量的乙酸铵可以使待测物在测试时成为离子状态，然后在电喷雾过程中将离子从溶液中转移至气相，使气相离子的生成过程更容易完成，从而提高待测物的离子化效率，同时还可以抑制待测物与色谱柱固定相中残留硅羟基之间的“二次作用”，达到改善峰形，提高分离效果的作用，而且有机相与水相中盐浓度相等，也保证了梯度变化过程中盐的浓度和离子化氛围酸性稳定。 

而且，本实施例采用Restek C18色谱柱，其填料粒径为3μm，与常规液相色谱柱相比，具有更高的灵敏度和更高的分离能力，且分离时间较常规液相色谱柱大大缩短。通过优化色谱分离条件，使目标化合物与抑制电离的基质实现最大程度的有效分离，可以降低基质对质谱检测的影响。 

实施例2：质谱条件中提取试剂的优化 

本实施例选用APCI源和ESI（+）离子源，实验发现，使用APCI源噪音基线低，但目标物的响应值也偏低，ESI（+）条件下响应较好，满足灵敏度要求。用蠕动泵以10μL/min的流速连续注射，分别将0.5mg/L的农药标准溶液注入ESI离子源中，在正离子检测方式下进行一级质谱分析（Q1扫描），得到准分子离子峰[M+H]+，优化去簇电压。对准分子离 子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到二级质谱碎片的全谱信息，优化碰撞能，同时建立标准物质EPI谱库，以便谱库检索能够实现对化合物同时定性定量的目的。 

在进行提取试剂的优化实验时，选择了六种提取方案，分别是： 

A.5g油+5mL正己烷，5mL乙腈提取两次，合并提取液； 

B.5g油+5mL正己烷+5mL水，5mL乙腈提取两次，合并提取液： 

C.5g油+5mL乙腈饱和的正己烷+5mL水，5mL乙腈提取两次，合并提取液； 

D.5g油+5mL水+1g氯化钠，5mL乙腈提取两次，合并提取液； 

E.5g油，5mL乙腈提取两次，合并提取液； 

F.5g油，10mL乙腈提取一次。 

具体操作如下：准确称取5.00g植物油样品，分别按上述A、B、C、D、E、F六种方案进行提取，振荡10min，以4000r/min离心5min，移去上层清液，如果需要二次提取的，则对下层重新提取一次。 

为了衡量提取试剂的优劣，我们采用了两种方式进行比较。 

其一比较回收率，结果见图2.1、图2.2、图2.3、图2.4，该四个图是A、B、C、D、E、F六组提取溶剂提取不同化合物的响应值比较的结果图，标准溶液浓度为0.05mg/L，标准溶液按上述方法制备； 

其二比较共提取物的重量，结果见图3，图3为冷冻时间优化图，其中，A、B、C、D、E、F分别表示实施例2中的A－F的六种提取方案，由图3可见，在同样的冷冻时间下，六种提取方式的共提取物重量有显著差异，且都随着冷冻时间的延长而减低，直至到达一个稳定的平台；而提取方式B得到的共提取物的重量始终为最低。因此，提取方式B为最优化方案。 

乙腈的通用性强，对农药的溶解度较大，可溶入的杂质量适中，是多残留提取溶剂的最佳选择。其次，由于植物油中含水量极低，并且具有一定的黏性，单纯使用乙腈在提取时可能存在分散不够完全的现象，加入少量的水，提高了乙腈对于组织细胞的渗透性，可以将基体分散得非常均匀。再次，除油脂外，正己烷中可溶入的杂质量比较少，特别是正己烷与水进行两相分配时，大部分杂质在水相中；对于植物油样品来说，由于其与乙腈互溶性不佳，直接提取效率不高，所以先使用正己烷溶解，再用乙腈萃取，这样既可以提高对目标物的提取效率，又可以减少植物油中最主要的干扰杂质油脂的溶入量，对后续进行的净化步骤有利。鉴于上述，故本方法最终先采用正己烷-水溶解分散基质，再加入乙腈溶液提取，最后加盐盐析分层，操作简单，净化效果显著，提取效率高。 

实施例3：质谱条件中冷冻时间的优化 

在进行了提取步骤优化以后，虽然大部分的油脂保留在残渣内，但仍有少部分进入乙腈层，为了进一步净化，采用了冷冻的方式进行除油脂。在冷冻时间的优化中，选择了0h，0.5h，1.0h，2.0h，4.0h和6.0h作为优化时间选择方案。将不同提取方式得到的乙腈提取层同时放入-18℃冰箱内冷冻，按间隔要求时间分别取出2mL提取液，吹干后称重，利用差减法绘制出冷冻效果曲线，见图3。图3为冷冻时间优化图，其中，A、B、C、D、E、F分别表示实施例2中的A－F的六种提取方案。 

从图3中可以明显看出，随着冷冻时间的延长，提取液中的油脂含量显著下降，但当冷冻时间达到2h以后，该趋势趋于平稳，因此，认为冷冻2h即为合适的冷冻时间。 

实施例4：质谱检测中D-SPE条件的优化 

在进行d-SPE条件优化时，选择了三种净化方案： 

A.150mgMgSO₄+50mgPSA； 

B.150mgMgSO₄+50mgPSA+50mgC18； 

C.150mgMgSO₄+50mgPSA+50mgC18+10mgGCB。 

根据实施例2的提取优化得到提取方案B为最优条件，因此提取部分采用B方法得到的提取液用于分散固相萃取净化条件的优化选择，选择加入50mg/L的目标化合物，以化合物的响应值为纵坐标，对上述A、B、C三种不同D-SPE提取条件进行比较，结果见图4.1、图4.2、图4.3、图4.4，该四个图是D－SPE条件的优化实验结果比较图（标准溶液浓度为0.05mg/L）。 

由图4.1、图4.2、图4.3、图4.4可见，对于绝大部分的目标化合物，都是在采用方案C的净化方式时，有最高的响应值，因此，C为最佳的D-SPE的条件。 

使用C18和PSA进行分散固相萃取净化，C18材料的硅胶上接有十八烷基，该十八烷基官能团为其有效成分，有较高的相覆盖率和碳含量，对非极性物质有较高的容量，特别对油脂的去除有十分显著的效果，同时还可以除去其他一些非极性的杂质。PSA材料的硅胶表面键合有极性官能团（氨基），该官能团为其有效成分，它能从样品中吸附极性化合物，再应用比样品本身极性更强的溶剂来洗脱分析物，它对于样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素和金属离子（与金属离子产生配合作用）等具有良好的净化效果。提取液经液液分配除去部分杂质后，再使用C18和PSA粉末分别吸附非极性和极性杂质，净化效果良好；无水MgSO₄用于除去盐析分配后乙腈层中含有的少量水分，以免PSA粉末吸水导致性能下降。加入少量活性炭粉末，可以去除部分色素，但对于一些平面结构的化合物可能 产生吸附作用而导致回收率下降。 

因此，综合实施例2、3、4，样品处理的方法按如下操作进行：准确称取5.00g植物油样品，加入5mL正己烷，5mL超纯水，5mL乙腈和2g氯化钠，振荡10min，以4000r/min离心5min，移去上层清液，下层重复提取一次。合并提取液，冷冻2h，取1.0mL上清液与150mg无水硫酸镁，50mg PSA和50mg C18粉末混合，12000r/min离心5min，取0.5mL上清液与0.5mL超纯水混合，过0.2μm滤膜，装瓶待测。 

实施例5：基质效应实验 

在常规液相色谱‐质谱法的方法确证过程中，一般采用同一来源的空白样品配制系列标准样品和QC样品，以抵消基质效应对方法的精密度和结果的准确度产生的影响。但在方法的实际应用中，因所测定的样品具有不同的来源或大批量测定时所涉及到的样品基质复杂多样，使得无法严格的执行样品测定与基质配制曲线定量一一对应。因此，通常选择对样品进行稀释、延长目标化合物的保留时间（尽量大于3min）以及选择性质相近的基质配制的曲线进行定量的方法来减小基质效应带来的误差。 

在本实施例中，质谱的条件为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：编程的多反应监测模式（Scheduled-MRM）；气帘气：15L/min；GS1雾化气：60L/min；GS2辅助加热气：70L/min；CAD碰撞气：中；辅助加热气温度：500℃；喷雾电压：5000v。 

本实施例涉及到的植物油种类有棕榈油、花生油和橄榄油，但是大批量检测时具体涉及到的品种繁多，因而，只能选择近似的基质配制标准曲线来进行定量。但为了保证结果的准确性，选择了简略的标准曲线法对基质效应进行了考察。分别采用流动相、空白棕榈油提取液、空白花生油提取液和空白橄榄油提取液配制三条浓度一致的标准曲线，每组标准曲线中含有相同的15种以上的化合物，以不同基质中的同种化合物的响应值对相应浓度绘制标准曲线，结果见图5.1、图5.2、图5.3、图5.4，图5.1是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测毒死蜱（Chlorpyrifos）的基质效应考察结果图；图5.2是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测乐果（Dimethoate）的基质效应考察结果图；图5.3是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测倍硫磷（Fenthion）的基质效应考察结果图；图5.4是空白棕榈油提取液、空白花生油提取液、空白橄榄油提取液和流动相检测杀扑磷（Methidathion）的基质效应考察结果图。 

由该四图中的通过对标准曲线斜率的比较发现，不同基质对于不同化合物的确存在基质效应，且绝大多数表现为抑制效应，但是，不同基质间的基质效应并无显著性差异。 

因此通过标准曲线实验结论证明，在无法找到完全一致的空白样品基质配制标准曲线时，采用相近空白基质配制标准曲线所测定的结果准确可靠。 

实施例6：方法线性范围和定量限 

在实施例1－5中所确定的实验条件下，用乙腈/水（6/4，v/v）为溶液，量取一定量各化合物标准溶液，配成一系列标准曲线（0,2,5,10，20，30和50μg/L），以仪器响应峰面积对各目标化合物的浓度进行线性回归，实验结果见表2。 

表2 

由该表结果表明，大部分化合物的浓度在0μg/L‐50.0μg/L，线性关系良好，其定量限(LOQ,S/N=10)可以达到2μg/kg。当实际样品中的某化合物有检出，应当采用相应的空白基质配制标准曲线对其进行定量，若含量超过线性范围时，可适当加大样品的稀释倍 数，并依据SANCO10684/2009进行定性和定量。 

本实施例依据欧盟最新的SANCO/12495/2011进行方法验证。选择三种基质（花生油、橄榄油和棕榈油）分别添加5.0、10.0、20.0μg/kg，每个水平均重复6次，进行回收率实验和精密度实验。得到平均回收率为55%－121%，相对标准偏差（RSD）为0.47%－19.2%，能够满足多种农药残留同时分析的要求。 

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 

Claims (3)

1.一种测定植物油中农药残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样品处理：称取5.00g植物油样品，加入5mL正己烷、5mL超纯水、5mL乙腈和2g氯化钠，振荡10min，以4000r/min离心5min，移去上层清液，下层重复提取一次；合并提取液，冷冻2h，取1.0mL上清液与150mg无水硫酸镁、50mg乙二胺-N-丙基PSA和50mgC18粉末混合，12000r/min离心5min，取0.5mL上清液与0.5mL超纯水混合，过0.2μm滤膜，装瓶待测；

（2）标准溶液的配制：标准物质购自Dr.Ehrenstorfer公司商品混标，其规格为10.0μg/mL，纯度≧96.0%，使用前保存于-18℃；

（3）色谱条件：

Restek C18色谱柱：3μm，2.1×100mm，Restek,美国；

柱温：35℃；

平衡时间：5min；

进样量：10μL；

流速：0.5mL/min；

流动相：采用A溶液10mMol乙酸铵水溶液和B溶液10mMol乙酸铵甲醇溶液作为组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件：0－8min，B由20.0%－90.0%；8－12min，B由90.0%－100.0%；12－14.8min，B保持100.0%；14.8－14.9min，B由100.0%－20.0%；15.0min停止；

（4）质谱条件：

电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；

检测方式：编程的多反应监测模式；

气帘气：15L/min；

GS1雾化气：60L/min；

GS2辅助加热气：70L/min；

CAD碰撞气：中；

辅助加热气温度：500℃；

喷雾电压：5000v。

2.根据权利要求1所述的一种测定植物油中农药残留的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的样品的待测浓度为0μg/L‐30.0μg/L。

3.根据权利要求1所述的一种测定植物油中农药残留的方法，其特征在于，所述植物油包括棕榈油、花生油或橄榄油中的一种或多种。

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