CN114062571A - 一种养殖水体中真菌毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水质检测领域，公开了一种养殖水体中真菌毒素的检测方法，将待测水样采用Na₂EDTA处理后经HLB柱上样后，将活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测水样的比例控制在1g:(12～24mL):(1.0～2.0L)，之后用甲醇、甲酸和二氯甲烷的混合溶剂进行洗脱，洗脱液定容后利用液相‑质谱联用仪进行真菌毒素的分离和检测。本发明提供的检测方法可一次性对20种真菌毒素进行定性、定量分析，真菌毒素在各自的线性响应范围内线性关系良好，相关系数R²均大于0.99，不同种类真菌毒素的检测限为0.01～0.5ng/L，定量限为0.05～1.0ng/L，该检测方法准确性高、重现性好、灵敏度高且样品前处理简便。

Description

一种养殖水体中真菌毒素的检测方法

技术领域

本发明属于水质检测领域，具体涉及一种养殖水体中真菌毒素的检测方法。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxin)是一类由丝状真菌在一定条件下产生的有毒次级代谢产物，经口摄入或皮肤吸入对人和动物具有急性毒性，可使人畜发生免疫系统、神经系统、生长繁殖等疾病和致畸、致癌、致突变效应，严重威胁着人畜健康。据联合国粮农组织(Foodand Agriculture Organization of the United Nations,FAO)统计，世界上每年约有25％的农作物受到真菌毒素污染，造成数十亿吨农产品的损失。为了减少受损，人们会将霉变的粮食谷物用于生产成养殖饲料，使得真菌毒素可能通过养殖过程中的饲料投喂引入到水环境中，不仅污染水体，危害水生生物，而且受污染的水产品经人类摄入进入到人体内，最终真菌毒素通过食物链富集对人体健康造成严重的负面影响。

真菌毒素污染已然成为全球公共卫生健康安全问题，随着研究技术的不断发展，对真菌毒素有更深入的认识，发现多数真菌毒素在极低浓度下就具有毒性，具有低剂量高毒性的特性。为保证日常饮食安全，需要对摄入食品中的真菌毒素进行严格检测。目前，国内外现有的真菌毒素限量标准和检测方法主要是针对粮谷、食用油、奶制品、饲料等领域，尚未建立养殖水体中真菌毒素的限量和检测方法，相关研究存在空白，使得水产品的质量安全存在一定的隐患。因此，建立养殖水体中多种类真菌毒素的一次性快速筛查技术将为明确水产品质量安全和保障消费者身体健康等方面提供有力的技术支持，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是为了填补目前养殖水体中真菌毒素检测方法的技术空白点，提供一种新的液相色谱质谱联用检测方法对养殖水体中多种类真菌毒素的检测方法，该方法有机物用量少、对环境友好、步骤简单、准确度高、重现性好、灵敏度高。

具体地，本发明提供了一种养殖水体中真菌毒素的检测方法，其中，该方法包括如下步骤：

(1)样品前处理

将HLB柱依次用甲醇和超纯水进行活化，得到活性HLB柱；将待测水样经0.4～0.6μm滤膜过滤之后加入Na₂EDTA和同位素替代物，然后以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱进行上样，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测水样的比例为1g:(12～24mL):(1.0～2.0L)；上样结束后，将HLB柱用超纯水淋洗，再用隔膜真空泵抽干，之后用甲醇、甲酸和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱溶剂进行洗脱，所得洗脱液在35～45℃下氮吹至干，再加入磺胺噻唑-D₄作为内标物，用甲醇、甲酸和水的混合溶液定容，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；

(2)配制标准溶液

将真菌毒素标准品、同位素替代物和磺胺噻唑-D₄分别用溶剂稀释并最终配制成具有0.05～100ng/mL浓度梯度的真菌毒素标准品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液；

(3)样品检测

将真菌毒素标准品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用内标法定量，并将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测水样中各待测成分的含量。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，相对于1L待测水样，所述Na₂EDTA的用量为0.5～1g。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶剂中甲醇、甲酸和二氯甲烷的体积比为(11～13):(0.005～0.01):8。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶剂为6mL甲醇、6mL含0.1％v/v甲酸的甲醇和8mL二氯甲烷的混合液。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶液中甲醇、甲酸和水的体积比为(18～20):(0.01～0.05):(75～85)。

在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶液为含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按照体积比2:8配成的混合液。

在一种优选实施方式中，步骤(1)和步骤(2)中，所述同位素替代物均同时含有AFB1-¹³C₁₇、AFG2-¹³C₁₇、DON-¹³C₁₅、HT-2-¹³C₂₂和OTA-¹³C₂₀。

在一种优选实施方式中，步骤(2)中，所述真菌毒素标准品同时含有串珠镰刀菌素、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、杂色曲霉素、赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B。

在一种优选实施方式中，所述LC-MS/MS测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为菲罗门五氟苯基柱Titank F5，柱温为30℃，流速为0.25mL/min，进样量为5μL，流动相以含0.1％v/v甲酸的超纯水作为A相和以含0.1％v/v甲酸的甲醇作为B相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～2min的流动相为85％A相和15％B相的混合溶液，4～6min的流动相为55％A相且45％B相的混合溶液，8～14min的流动相为40％A相和60％B相的混合溶液，19～23min的流动相为30％A相和70％B相的混合溶液，25～30min的流动相为10％A相和90％B相的混合溶液，30.01～40min的流动相为85％A相和15％B相的混合溶液。

在一种优选实施方式中，所述LC-MS/MS测定过程中质谱条件包括：采用Agilent6490串联质谱仪，电喷雾离子源，多反应离子选择监测模式；鞘气温度为400℃，流速为12L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35psi；喷嘴电压为1500V；毛细管电压为4000V；破碎电压为380V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气。

本发明具有以下技术效果：

(1)本发明将待测水体先采用Na₂EDTA进行处理，之后再过活性HLB柱，在活性HLB柱的处理过程中，将活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测水样的比例控制在1g:(12～24mL):(1.0～2.0L)，同时以甲醇、甲酸和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱溶剂进行洗脱，这种特定的前处理方式能够将影响LC-MS/MS检测的杂质去除，基本仅保留目标产物，从而减小了基质干扰，为后续的LC-MS/MS检测奠定基础。本发明提供的方法可同时对养殖水体中20种真菌毒素进行定性及定量分析，所有检测项目在0.05～100ng/mL工作曲线范围内的相关系数R²均大于0.99，具有良好的线性关系，本检测方法准确性高、重现性好，且不同种类真菌毒素的检测限为0.01～0.5ng/L，定量限为0.05～1.0ng/L，本检测方法灵敏度高。

(2)不同水质具有不同的酸碱度，本发明的发明人发现，水样的酸碱度对目标物回收率的影响不显著，因此在后续实验中无须对水样的酸碱度进行调节，简化了样品前处理实验步骤，减少人力物力，提高实验效率，易于推广使用。

(3)不同水质存在盐度不同的情况，本发明的发明人发现，水样的盐度对目标物回收率的影响不显著，因此在后续实验中无须对水样的盐度进行调整，简化了样品前处理实验步骤，减少人力物力，提高实验效率，易于推广使用。

附图说明

图1为目标检测项目、替代物及内标物在优化条件下的总离子(TIC)色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明。

以下实施例和对比例中所采用的仪器和试剂如下：

液相色谱柱：五氟苯基柱Titank F5(3μm，150×2.1mm i.d.，菲罗门，美国)；液相串联质谱仪：Agilent 6490；HLB柱(1g/20mL，Waters，美国)。

试剂：甲醇、甲酸、二氯甲烷和乙腈均为色谱纯；水为超纯水；Na₂EDTA购自国药集团；20种真菌毒素、同位素替代物和内标物磺胺噻唑-D₄标准品购自上海安谱。

实施例

(1)样品前处理

将HLB柱(1g/20mL)依次用10mL甲醇和10mL超纯水进行活化，得到活性HLB柱；将1.0L待测水样经0.45μm滤膜过滤后加入0.5g的Na₂EDTA和100μL浓度为100ng/mL替代物混合标准溶液，然后以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱上样富集；上样结束后，用10mL超纯水淋洗HLB柱，再用隔膜真空泵抽干；用6mL甲醇、6mL含0.1％甲酸(v/v)的甲醇和8mL二氯甲烷的混合溶剂进行洗脱，接取洗脱液，在40℃条件下氮吹至干，加入10μL浓度为10μg/mL的磺胺噻唑-D₄作为内标物，用含0.1％甲酸(v/v)的甲醇-水(2:8，v/v)定容到1.0mL；最后经0.22μm的PTFE针式滤膜过滤，得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测。

(2)配制标准溶液

真菌毒素标准溶液配制：分别准确称取MON、DAS、HT-2、NEO、T-2、15ADON、3ADON、DON、FB1、FB2、FB3、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、STG、OTA、OTB共20种真菌毒素标准品10mg于10mL容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容，再分别准确移取0.1mL的单一标准储备液用甲醇稀释成浓度为100ng/mL真菌毒素混合标准溶液；

替代物标准溶液配制：分别准确称取Su-AFB1、Su-AFG2、Su-DON、Su-HT-2、Su-OTA共5种替代物10mg于10mL容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容，再分别准确移取0.1mL的单一标准储备液用甲醇稀释成浓度为100ng/mL替代物混合标准溶液；

内标磺胺噻唑-D₄标准溶液配制：取10mg磺胺噻唑-D₄于10mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释定容，再准确移取0.1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至10μg/mL，﹣18℃避光保存。

(3)样品检测

分别准确移取真菌毒素混合标准溶液、替代物混合标准溶液以及内标磺胺噻唑-D₄标准溶液，分别用甲醇稀释以配制成具有0.05～100ng/mL浓度梯度，之后进行LC-MS/MS检测，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS检测，采用内标法定量，并将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测水样中各待测成分的含量。

LC-MS/MS检测过程中，液相色谱条件包括：柱温30℃，流速0.25mL/min，进样量5μL；流动相为含0.1％(v/v)甲酸的超纯水(A相)和含0.1％(v/v)甲酸的甲醇(B相)，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 HPLC的梯度洗脱程序

时间(min)	A相(％)	B相(％)
			0～2	85	15
4～6	55	45
			8～14	40	60
19～23	30	70
			25～30	10	90
30.01～40	85	15

注：表1中，A相和B相的洗脱比例为体积比，且未提及时间段的洗脱比例参照上一时间点。

LC-MS/MS检测过程中，质谱条件包括：采用电喷雾离子源(ESI)，多反应离子选择监测模式(MRM)；使用氮气发生器提供鞘气和干燥气，鞘气温度为400℃，流速为12L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35psi；喷嘴电压为1500V；毛细管电压为4000V；破碎电压为380V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气(99.999％)。20种真菌毒素、5种替代物及内标物的母离子、子离子、碰撞能等相关信息见表2，其中标注*为定量离子。所有目标检测项目、替代物及内标物的总离子流图(TIC)见图1。如图1所示，所有目标检测项目在此优化条件下的质谱信号和灵敏度高，且峰形对称，有利于定性、定量分析。

表2检测项目特征离子

本发明采用内标法定量，根据《GB/T 27417-2017化学分析方法确认和验证指南》，选择3倍信噪比时对应的浓度作为该目标物的仪器检测限(DL)，以10倍信噪比时对应的浓度作为该目标物的仪器定量限(QL)。检测项目的线性范围、相关系数、检测限和定量限见表3。从表3可知，所有检测项目在0.05～100ng/mL工作曲线范围内的相关系数R²均大于0.99，具有良好的线性关系，该检测方法准确性高、重现性好；本发明对真菌毒素的检出限为0.01～0.5ng/L，定量限为0.05～1.0ng/L，该检测方法具有高度灵敏性。

表3检测项目线性范围、相关系数、检测限和定量限

本实施例在样品前处理过程中采用HLB柱(1g/20mL)作为固相萃取柱，选取待测水样的体积为1.0L(以1.5L和2.0L作为对照)，加入混合标准溶液至理论浓度为50ng/L，按照样品前处理步骤进行操作，以目标物回收率为依据考察水样的穿透体积。结果发现，目标物的整体回收率随着过柱体积的增加而降低，回收率在40％～120％之间的目标物在过柱体积为1.0L时为93.9％，1.5L和2.0L时分别为75.6％和69.1％。也即，待测水样的体积为1.0L时的回收率和灵敏度最高。

本实施例在样品前处理过程中需要往待测水样中加入Na₂EDTA，以养殖淡水和海水为基质，在1.0L待测水样中加入0.5g Na₂EDTA(以0g和1.0g作为对照)，加入混合标准品至理论浓度为50ng/L，按照样品前处理步骤进行操作，考察在不同的Na₂EDTA添加量下各目标物的回收率情况。结果发现，添加0.5g Na₂EDTA的目标项目回收率得到了较大的提升，在0.5g和1.0g的添加量条件下，两者的回收率并未有显著性差别，因此，最终选用在1.0L水样富集前添加0.5g的Na₂EDTA，可减少试剂用量，更加经济适用。

本实施例在样品前处理过程中采用6mL甲醇、6mL含0.1％甲酸(v/v)的甲醇和8mL二氯甲烷的混合溶剂进行洗脱，对比了单一溶剂甲醇、含0.1％甲酸(v/v)的甲醇、二氯甲烷和乙腈分别在4mL、8mL、12mL、16mL体积下的洗脱效果。结果表明，甲醇、含0.1％甲酸(v/v)的甲醇和乙腈均在12mL洗脱体积时达到最高的洗脱效率，二氯甲烷在8mL时达到最高洗脱效率，再增大体积洗脱效率并无显著提高，但是采用单一溶剂的洗脱效率均远远低于本发明以6mL甲醇、6mL含0.1％甲酸(v/v)的甲醇和8mL二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱溶剂的洗脱方式。此外，还对比了采用6mL甲醇、6mL含0.1％甲酸(v/v)的甲醇、8mL二氯甲烷和4mL乙腈的混合溶剂进行洗脱的效果。结果表明，采用6mL甲醇、6mL含0.1％甲酸(v/v)的甲醇、8mL二氯甲烷和4mL乙腈的混合溶剂进行洗脱的基质干扰效益增大，不利于准确定量分析。

由于水质具有不同的酸碱度，需要考察水质酸碱度对实验结果的影响。分别用甲酸、氨水调节纯水的pH值至5和9，再与纯水样品一同进行前处理并检测。结果发现，水样的酸碱度对所有目标物回收率的影响并不显著，因此无需对水样的酸碱进行调节。

由于养殖淡水、养殖海水、养殖咸淡水存在盐度不同的情况，需要考察水质盐度对实验结果的影响。分别选择了纯水、调节至1.5％盐度和3.5％盐度的水样进行前处理并检测。结果发现，水样的盐度对目标物的影响不显著，因此无需对水样的盐度进行调整。

测定方法的回收率和精密度：以养殖淡水和养殖海水为基底进行低、中、高三个浓度的加标实验，同时做平行试验(n＝4)，其中测定回收率及相对标准偏差(RSD)见表4。结果显示，淡水基质回收率在45.8％～117.9％，RSD在0.9％～18.3％；海水基质的回收率在39.5％～122.7％，RSD在2.6％～15.6％，测定结果符合检测准确度与精密度的要求。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品前处理

将HLB柱依次用甲醇和超纯水进行活化，得到活性HLB柱；将待测水样经0.4～0.6μm滤膜过滤之后加入Na₂EDTA和同位素替代物，然后以4～6mL/min的流速通过活性HLB柱进行上样，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测水样的比例为1g:(12～24mL):(1.0～2.0L)；上样结束后，将HLB柱用超纯水淋洗，再用隔膜真空泵抽干，之后用甲醇、甲酸和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱溶剂进行洗脱，所得洗脱液在35～45℃下氮吹至干，再加入磺胺噻唑-D₄作为内标物，用甲醇、甲酸和水的混合溶液定容，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；

(2)配制标准溶液

将真菌毒素标准品、同位素替代物和磺胺噻唑-D₄分别用溶剂稀释并最终配制成具有0.05～100ng/mL浓度梯度的真菌毒素标准品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液；

(3)样品检测

将真菌毒素标准品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用内标法定量，并将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测水样中各待测成分的含量。

2.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，相对于1L待测水样，所述Na₂EDTA的用量为0.5～1g。

3.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合溶剂中甲醇、甲酸和二氯甲烷的体积比为(11～13):(0.005～0.01):8。

4.根据权利要求3所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合溶剂为6mL甲醇、6mL含0.1％v/v甲酸的甲醇和8mL二氯甲烷的混合液。

5.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合溶液中甲醇、甲酸和水的体积比为(18～20):(0.01～0.05):(75～85)。

6.根据权利要求5所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合溶液为含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按照体积比2:8配成的混合液。

7.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述同位素替代物同时含有AFB1-¹³C₁₇、AFG2-¹³C₁₇、DON-¹³C₁₅、HT-2-¹³C₂₂和OTA-¹³C₂₀。

8.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述真菌毒素标准品同时含有串珠镰刀菌素、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、杂色曲霉素、赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B。

9.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为菲罗门五氟苯基柱Titank F5，柱温为30℃，流速为0.25mL/min，进样量为5μL，流动相以含0.1％v/v甲酸的超纯水作为A相且以含0.1％v/v甲酸的甲醇作为B相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～2min的流动相为85％A相和15％B相的混合溶液，4～6min的流动相为55％A相和45％B相的混合溶液，8～14min的流动相为40％A相和60％B相的混合溶液，19～23min的流动相为30％A相和70％B相的混合溶液，25～30min的流动相为10％A相和90％B相的混合溶液，30.01～40min的流动相为85％A相和15％B相的混合溶液。

10.根据权利要求1所述的养殖水体中真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定过程中质谱条件包括：采用Agilent 6490串联质谱仪，电喷雾离子源，多反应离子选择监测模式；鞘气温度为400℃，流速为12L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35psi；喷嘴电压为1500V；毛细管电压为4000V；破碎电压为380V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气。

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