CN101491310A

CN101491310A - 降解黄曲霉毒素的方法

Info

Publication number: CN101491310A
Application number: CNA2009100787088A
Authority: CN
Inventors: 哈益明; 杨静; 王�锋; 周洪杰; 范蓓; 李彦杰
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2009-07-29

Abstract

本发明公开一种降解黄曲霉毒素的方法。该方法是用γ射线对含有黄曲霉毒素的样品进行辐照。其中，γ射线是由放射性物质⁶⁰Co产生的，辐照剂量为0－10kGy，但不包括0；优选2－10kGy，更优选4－10kGy，尤其优选6－10kGy，最优选10kGy。上述含有黄曲霉毒素的样品为含有黄曲霉素的农产品或农产品加工得到的制品，如食品或饲料等。该方法尤其适用于降解黄曲霉毒素B₁。该方法既可杀死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不会产生任何工业污染。

Description

降解黄曲霉毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种降解黄曲霉毒素的方法，特别是涉及一种利用γ射线辐照降解黄曲霉毒素B₁的方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称为AF)，是对人类和动物危害大的真菌毒素之一。大量资料证实，黄曲霉毒素对人及动物的肝脏组织有很强的毒害作用，严重时可导致肝癌，甚至死亡。黄曲霉毒素污染食品比较严重，尤其是对花生、核桃、玉米及其制品的污染最为严重和普遍。此外，在大豆、稻谷、通心粉、牛奶及其制品、食用油等食品中也经常发现黄曲霉毒素。黄曲霉毒素不仅降低农产品和饲料品质，使经济遭受巨大损失，还可通过污染或残留黄曲霉毒素的肉、乳等动物源性食品进入人体，对人类健康造成威胁。其中毒性最强的是黄曲霉毒素B₁(C₁₇H₁₂O₆，分子量312)，为氰化钾的10倍，其化学结构式如式I所示。(高桥治男；花生曲霉毒素污染途径与防除；花生科技，2000，1：37。)

(式I)

现有去除黄曲霉毒素的方法，主要分为物理化学法和生物化学法。其中，物理化学去毒法对食品的色、香、味及营养成分如维生素或蛋白质等均有不同程度的破坏和不良影响。生物化学去毒法成本较高，很难在工业化水平制备高活性黄曲霉毒素解毒活性物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解黄曲霉毒素的方法。

本发明提供的降解黄曲霉毒素的方法，是用γ射线辐照含有黄曲霉毒素的样品。

该方法中，γ射线是由放射性物质⁶⁰Co产生的，辐照剂量为0-10kGy，但不包括0；优选2-10kGy，更优选4-10kGy，尤其优选6-10kGy，最优选10kGy。上述含有黄曲霉毒素的样品为含有黄曲霉素的的农产品或农产品加工得到的制品，如食品或饲料等。该方法尤其适用于降解黄曲霉毒素B₁。

本发明提供了一种利用辐照技术降解黄曲霉毒素的方法，该方法在去毒处理过程中具有明显的优势，既可杀死病原微生物，又能降解其中的生物毒素，且不会产生任何工业污染。

附图说明

图1为黄曲霉毒素B₁的标准曲线。

图2为黄曲霉毒素B₁的选择离子色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

本发明各实施例中所用的仪器与试剂如下所示：

Agilent1100液相系统(美国Agilent公司)；API3000三级四极杆质谱系统(美国应用生物系统)；FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；LD4-2低速离心机(北京医用离心机厂)；固相萃取装置(美国Supelco公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60mg，Waters公司)；甲醇(色谱纯Fisher)；甲酸(分析纯)；正己烷(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；氯化钠；超纯水。

黄曲霉毒素B₁标准品10mg(购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度≥97％)；

黄曲霉菌(Aspergillusflavus)ATCC11498(购自美国菌种保藏中心ATCC，11498号菌株)。

本发明中所用分析检测条件如下所示：

1)色谱条件：

Agilent1100液相系统

G1312A二元泵系统、G1367A型自动进样器

色谱柱：Agela Technologies Inc.Venusil ASB-C18、柱内径×柱长2.1×150mm，填料直径5μm

流速：200μl/min

流动相：甲醇∶水(甲酸的体积百分比浓度为0.1％)＝7∶3

进样体积：50μl；

2)质谱条件：

API3000三级四极杆质谱系统

扫描方式：多反应监测(MRM)，正离子分析模式

离子源：Turbo Spray离子源

前级离子m/z＝313.0，二级离子m/z＝241.1、269.1

参数设置：

雾化气(Nebulizer Gas，NEB)：氮气，10ml/min

窗帘气(Curtain Gas，CUR)：氮气，12ml/min

电离电压(Ionspray Voltage，IS)：5500V

加热温度(Temperature，TEM)：500℃

碰撞气(Collision Gas，CAD)：氮气，8ml/min

去集簇电压(Declustering Potential，DP)：70V

聚焦电压(Focusing Potential，FP)：300V

入口电压(Entrance Potential，EP)：10V

碰撞能(Collision Energy，CE)：45V

碰撞池出口电压(Collision Cell Exit Potential，CXP)：9V。

第一部分、制作标准曲线

1)标准溶液的配制

用甲醇将黄曲霉毒素B₁(AFB₁)配制成100mg/L标准储备液，4℃避光保存。用体积比为50∶50的甲醇与水的混合液稀释标准储备液，配制成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50μg/L的AFB₁标准工作溶液。

2)样品的提取

称取5g粉碎后的花生样品于100ml离心管，加入50ml甲醇-水(6∶4)，5gNaCl，20ml正己烷，摇匀，放入离心机中离心提取30min。提取后，用定量滤纸过滤，入分液漏斗静置分层，取5ml下层溶液待用。

3)样品的净化

将OASIS HLB固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，加2ml甲醇活化，待甲醇至OASIS小柱吸附剂上层时，再加2ml纯水平衡小柱，然后加样品过滤液5ml过柱，流速为1ml/min，加入3ml纯水淋洗OASIS小柱两次，后用2ml体积比为3∶7的甲醇与水的混合液淋洗OASIS小柱以除去杂质，用真空泵抽干。最后以1ml甲醇洗脱，洗脱液用纯水定容至2ml，待分析。

4)花生接种黄曲霉菌产毒培养

将黄曲霉菌ATCC11498接种于察氏培养基(该培养基的具体配方为：硝酸钠2g，磷酸氰二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15-20g，水1000ml)121℃灭菌20min。斜面，温度28℃，湿度50％，培养7天，待斜面长满黄绿色菌丝，菌丝上略生孢子时，用无菌水制成孢子悬浮液(10⁷cfu/ml，其中cfu/ml为每毫升样品中含有的细菌群落总数)。将5g花生在紫外灯下照射30min灭菌后，加入5ml无菌水(121℃，20min)，然后加入孢子悬浮液1ml。温度28℃，湿度50％，培养7天。

5)标准曲线及检测限

准确吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50μg/LAFB₁标准溶液50μl，HPLC-MS/MS分析，得到黄曲霉毒素B₁峰面积对浓度进行线性回归，即得标准曲线，如图1所示。该标准曲线为线性方程为y＝10494x+3041.9。

按3倍信噪比计算，当样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度即可作为最低检测限。当样品组分的响应值等于基线噪声的10倍时，该样品的浓度即可作为最低定量限。

由图1可知，当黄曲霉毒素B₁浓度为0.03μg/kg时，S/N＝3.2，故方法的最低检测限约为0.03μg/kg。当黄曲霉毒素B₁浓度为0.1μg/kg时，S/N＝10.2，故方法的最低定量限约为0.1μg/kg。

第二部分、γ射线辐照降解花生中的黄曲霉毒素及测定结果

本实施例提供的对花生中的黄曲霉毒素进行降解的具体方法是：

称取5g染菌花生样品，置于100ml聚丙烯离心管(材质为99.9％生物级聚丙烯，耐辐射)中密封，放入⁶⁰Coγ射线辐射场(中国农业辐照中心)内进行辐照处理，辐照剂量分别设定为0kGy、2kGy、4kGy、6kGy、8kGy或10kGy。实验设三次重复。

之后按照下述步骤对上述辐照后的花生样品进行测定；

1)提取

取辐照后的花生样品离心管，加入50ml体积比为6∶4的甲醇与水的混合液，5gNaCl，20ml正己烷，摇匀，放入离心机中离心提取30min。提取后，用定量滤纸过滤，入分液漏斗静置分层，取5ml下层溶液待用。平行样品2个。

2)净化

将OASIS HLB固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，加2ml甲醇活化，待甲醇至OASIS小柱吸附剂上层时，再加2ml纯水平衡小柱，然后加步骤1)得到的样品过滤液5ml过柱，流速为1ml/min，加入3ml纯水淋洗OASIS小柱两次，后用2ml体积比为3∶7的甲醇与水的混合液淋洗OASIS小柱以除去杂质，用真空泵抽干。最后以1ml甲醇洗脱，洗脱液用纯水定容至2ml，待分析。

3)测定

分别注入50μL适当浓度的黄曲霉毒素B₁标准溶液及样品提取物溶液于高效液相色谱串联质谱仪中，按照前述分析检测条件进行分析，记录峰面积。图2为黄曲霉毒素B₁的选择离子色谱图。根据标准样品的保留时间进行定性分析，利用外标法进行定量分析。

将上述染菌花生样品经提取、净化、进LC-MS分析后，样品中黄曲霉毒素B₁的峰面积，结合图1所示的标准曲线换算成样品溶液的浓度，计算溶质的质量，再除以称取的花生的质量，得到辐照降解后的折合浓度。降解率由不同γ射线吸收剂量下的折合浓度与未辐照时的折合浓度相比得出。上述结果均列于表1中。另外，已计算得到未辐照的染菌花生中黄曲霉毒素B₁的污染浓度为64μg/kg。上述计算数据均为三次重复的平均值。

由表1可知，经γ射线辐照后，黄曲霉毒素B₁可达59.61％。我国GB2761-2005《食品中真菌毒素限量》规定黄曲霉毒素B₁的限量为＜20μg/kg；而国际上关于总黄曲霉毒素的含量一般都小于15μg/kg，对黄曲霉毒素B₁的限量要求更低。花生中黄曲霉毒素B₁的污染水平为6-400μg/kg，利用本发明提供的γ射线辐照降解方法，在辐照剂量为10kGy时，降解率可达59.61％，对出口贸易具有现实的利用价值。

表1、染菌花生中黄曲霉毒素B₁的辐照降解

吸收剂量	折合浓度/μg/kg	降解率/％
吸收剂量	折合浓度/μg/kg	降解率/％	0	64	0
2	58.78	8.15	0	64	0
2	58.78	8.15	4	50.44	21.18
6	39.92	37.63	4	50.44	21.18
6	39.92	37.63	8	33.18	48.15
10	25.85	59.61	8	33.18	48.15

Claims

1、一种降解黄曲霉毒素的方法，是用γ射线辐照含有黄曲霉毒素的样品。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述γ射线是由放射性物质⁶⁰Co产生的。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述辐照剂量为0-10kGy，但不包括0。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述辐照剂量为2-10kGy。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述辐照剂量为4-10kGy。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述辐照剂量为6-10kGy。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述辐照剂量为10kGy。

8、根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。

9、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述含有黄曲霉毒素的样品为含有黄曲霉素的的农产品或农产品加工得到的制品。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述含有黄曲霉素的的农产品或农产品加工得到的制品为花生或花生制品。