CN107641607A - 一种增效型抗病菌及其培养方法和应用 - Google Patents
一种增效型抗病菌及其培养方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种增效型抗病菌及其培养方法和应用，该增效型抗病菌为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，其微生物保藏登记号为：CGMCC No.7847；其培养方法选用SD23菌株作为第一轮筛选的出发菌株，制备菌悬液，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，并将高浓度申嗪霉素培养基培养筛选得到的菌株作为下一轮筛选的出发菌株，重复该过程多轮，最终得到目标菌株。与现有技术相比，本发明的增效型抗病菌对申嗪霉素耐药性好，与申嗪霉素配置成复配剂，使用安全，能够提高水稻纹枯病及西瓜枯萎病的防治效果，增加产量，又能降低申嗪霉素的使用量，从而降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种增效型抗病菌及其培养方法和应用。
背景技术
防治水稻、蔬菜、水果等真菌性病害，目前以化学农药为主，对环境及人体带来了许多不良影响，申嗪霉素是一种新型高效低毒的生物农药，目前由于成本还相对较高，从而造成使用面积还比较小，如何提高申嗪霉素对水稻纹枯病等真菌性病害的防治郊果，及降低使用成本，开发新型制剂，使之能更为广泛的用于农作物生产中，已经成为技术人员的攻关方向。
目前市场上有一些芽孢杆菌作为一种生物农药在销售，但是要想达到理想的效果还是比较难，而且不能与一些抗菌性农药一起施用。申嗪霉素本身做为一种农用抗生素，不仅对真菌性病害有很好的效果，而且还对细菌性病害也有较好的效果，因此，普通的芽孢杆菌在浓度不高的申嗪霉素下就可能被抑制甚至杀死，所以要找到一株能够耐受高浓度申嗪霉素的菌株，而且该菌株要与申嗪霉素能够互相增效，才能很好的用于农业生产上。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种增效型抗病菌及其培养方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种增效型抗病菌，为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，其微生物保藏登记号为：CGMCC No.7847；保藏时间：2013年7月3日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
选用SD23菌株作为第一轮筛选的出发菌株，制备菌悬液，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，并将高浓度申嗪霉素培养基培养筛选得到的菌株作为下一轮筛选的出发菌株，重复该过程多轮，最终得到目标菌株。
所述的自然分离筛选采用将出发菌株接种于斜面培养基上，于32℃下培养2-3天后将得到的芽孢冲洗下来制成芽孢悬液，用生理盐水稀释成不同位数的稀释液，将稀释液在平板上涂布，于30-37℃培养2-4天，挑选出菌株。
所述的诱变处理包括紫外线处理、紫外线/氯化锂复合处理、快中子处理、X光处理和Co60处理。
所述的紫外线处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，并将菌悬液置于培养皿中，在10-15W的紫外灯下距离5-50cm避光照射0.5-5min后，稀释涂布；
所述的紫外线/氯化锂复合处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，进行紫外线处理，稀释，稀释后的菌悬液在0.1-1wt％的氯化锂的天冬素-葡萄糖培养基中于25-35℃下培养5-10天，稀释涂布；
所述的快中子处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，放在静电加速器产生快中子的减速剂铍旁，处理剂量为20krad-6krad，处理时间为0.1-2min，稀释涂布；
所述的X光处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，以2000-50000伦琴剂量处理0.5-50s，稀释涂布；
所述的Co60处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，以0.5-10万伦琴剂量的γ射线照射处理0.5-2s，稀释涂布。
所述的高浓度申嗪霉素培养基培养筛选采用将诱变处理筛选后的菌株制备成菌悬液，在加有申嗪霉素的天冬素-葡萄糖培养基上涂布，于25-40℃下培养3-10天，挑选出菌株。
所述的高浓度申嗪霉素培养基中申嗪霉素的浓度为50-1000mg/L。
优选地，重复三轮筛选，得到目标菌株。
该增效型抗病菌的应用，将该增效型抗病菌与申嗪霉素制成复配剂，应用于防治水稻纹枯病及西瓜枯萎病。
所述的复配剂采用将1.0×109个/mL的增效型抗病菌悬浮液与1wt％的申嗪霉素悬浮液按照体积比为1:3～3:1复配制得。
所述的复配剂的施用量为30～80克/亩。
本发明采用的出发菌株SD23，其微生物保藏登记号为：CGMCC No.0310；保藏时间：1997年6月25日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
与现有技术相比，本发明用的出发菌株SD23已经广泛使用于农业生产上，该菌株已通过动物安全性试验、毒性试验、临床应用等，安全性高，通过耐药性实验发现，SD23菌株对申嗪霉素耐药相对好，本身对真菌性病害药效较好，且菌株对环境不会造成污染。而申嗪霉素也是一种已经推广使用的高效低毒的生物农药，在安全性方面有保障。
本发明的菌株增效型抗病菌与生物抗生素申嗪霉素配制成的复配剂，既提高了防治效果，增加了产量，又能够较大降低申嗪霉素的使用量，从而降低生产成本，让申嗪霉素这个新的产品能够更广泛的使用于更多的农作物上，为我国发展绿色食品和无公害农业及替代化学农药开辟了一条新的途径。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
一种增效型抗病菌，为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，其微生物保藏登记号为：CGMCC No.7847；保藏时间：2013年7月3日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
本发明选用SD23菌株作为第一轮筛选的出发菌株，制备菌悬液，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，并将高浓度申嗪霉素培养基培养筛选得到的菌株作为下一轮筛选的出发菌株，重复该过程多轮，最终得到目标菌株。
将所述的增效型抗病菌与申嗪霉素制成复配剂，用于防治水稻纹枯病及西瓜枯萎病。
实施例1
抗病增效型芽孢杆菌筛选及培养方案如下：
出发菌株：SD23蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)
斜面、平板培养基培养基：
牛肉膏5克、蛋白胨10克、氯化5克、琼脂10-15克、水1000ml、PH7.0-7.5、121℃灭菌20分钟
摇瓶培养基：豆粕粉30克、玉米粉10克、蛋白胨3克、酵母粉5克、发酵温度32℃。
摇床：振荡式
(1)将出发菌株SD23接种于斜面培养基上，32℃培养2-3天，将斜面芽孢冲洗下来，制成菌悬液；
选育方法：
(1)自然分离
菌种单孢悬浮液制备：培养好斜面用0.85％生理盐水洗在加有玻璃珠的三角瓶，振荡数分钟，经过灭菌漏斗(内有棉花)过滤去除杂质，即得单孢悬浮液。
将单孢悬浮液用生理盐水稀释成不同位数，一般为102-108倍，以每一种稀释液取0.1ml于平板上涂布，在37℃下培养3天左右即可挑选菌株再经(2)-(6)的诱变处理筛选和(7)的高浓度申嗪霉素培养基培养筛选。
(2)紫外线处理
将自然分离筛选得到的部分菌株制备成菌悬液，于9cm培养皿中，在10-15W紫外灯下距离5-50cm避光照射0.5-5分钟稀释涂布于平板上。
(3)紫外线与氯化锂复合处理
将自然分离筛选得到的部分菌株制备成菌悬液，进行紫外线处理，稀释，稀释后的菌悬液在0.1-1％氯化锂的天冬素葡萄糖培养基中25-35℃下培养5-10天。
(4)快中子处理
将自然分离筛选得到的部分菌株制备成菌悬液，放在静电加速速器产生快中子的减速剂铍旁，处理剂量为20krad-6krad，处理0.1-2分钟，稀释涂布。
(5)X光处理
将自然分离筛选得到的部分菌株制备成菌悬液，以2000-50000伦琴处理0.5-50秒，稀释涂布。
(6)Co60处理
将自然分离筛选得到的部分菌株制备成菌悬液，每支试管取菌悬液2ml分别放于γ射线中照射，分别用0.5-10万伦琴处理0.5-2秒，照射后稀释涂布。
(7)高浓度申嗪霉素培养基培养后自然分离筛选
将经过诱变处理筛选后的菌株制成菌悬液，在天天冬素-葡萄糖培养基中加入申嗪霉素，使申嗪霉素浓度分别在50-1000mg/l，做不同浓度的20个处理，将菌悬液涂布于加有申嗪霉素的培养上，于25-40℃下培养3-10天，挑选出增效型抗病菌菌株，测定活性和耐药性。
三轮筛选过程中：
第一轮出发菌株的选择：通过多次耐药性实验，选择出了SD23这个对申嗪霉素耐药相对好，且本身对真菌性病害药效较好的菌株，作为出发菌株。
将出发菌株SD23作为第一轮的出发菌株，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，诱变处理筛选过程中，用5种不同诱变剂及不同剂量，进行诱变处理，选出300个菌株，进行初筛，选出50个菌株，再进行复筛，选出5个菌株。
将上述5个菌株再次作为第二轮的出发菌株，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，诱变处理筛选过程中，用5种不同诱变剂及不同剂量，进行诱变处理，每种处理得到40个菌株，然后经过初筛得到50个菌株，再经过复筛选出5个菌株。
将再次选出的5个菌株再次作为出发菌株，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，诱变处理筛选过程中，用5种不同诱变剂及不同剂量，进行诱变处理，每种处理得到40个菌株，然后经过初筛得到50个菌株，再经过复筛选出5个菌株。
适应性菌株的培养
(1)配制不同浓度申嗪霉素的培养基
申嗪霉素浓度分别为
(2)找出菌株在不同浓度中的生长关系
以相同含量的菌株稀释液同剂量置于以上培养基中观察分析生长情况，生长情况如表1所示：
表1
| 培养基号 | 平板上菌落数量 |
| 1 | 150 |
| 2 | 50 |
| 3 | 23 |
| 4 | 12 |
| 5 | 3 |
注：平板菌落数量为每次三只平板的，三次重复后的单只平板菌落平均数。
(3)采用阶梯培养法筛选出适应性菌株
将菌株置于不同浓度的申嗪霉素培养基中，定向培养，经过多世代强制性适应，采用理化诱变方法，终于得到适应性较强的抗病型菌株。
经过阶梯培养法筛选出适应性菌株，在生产中显示了良好的效果。
菌株在不同申嗪霉素浓度培养基中的试验结果如表2：
表2
抗病增效型沙福芽孢杆菌的鉴定
经过上述培养方法得到的抗病型增效菌株具有如表3所示的特性：
表3
抗病型增效菌菌株保藏
将菌株制成甘油管超低温保藏，或砂土管及冷冻管保藏
与现有农药相比，本发明用的出发菌株SD23已经广泛使用于农业生产上，该菌株已通过动物安全性试验、毒性试验、临床应用等，安全性高，且菌株对环境不会造成污染。而申嗪霉素也是一种已经推广使用的高效低毒的生物农药，在安全性方面有保障。
本发明的抗病型增效菌株与生物抗生素申嗪霉素配制成的复配剂，既提高了防治效果，增加了产量，又能够较大降低申嗪霉素的使用量，从而降低生产成本，让申嗪霉素这个新的产品能够更广泛的使用于更多的农作物上，为我国发展绿色食品和无公害农业及替代化学农药开辟了一条新的途径。
应用效果实例：
以下实例均使用申嗪霉素1wt％悬浮剂和本发明抗病型增效菌(1.0×109个/ml)悬浮剂来配制成复配剂，使用量为50克/亩，试验对象为水稻纹枯病和西瓜枯萎病，进行五个实例的实验，实例1-5的防治效果依次对应表4-8所示：
表4
表5
表6
表7
表8
由上表数据可以看出，申嗪霉素中加入本发明的增效型抗病菌后，使用正常剂量的防治效果对水稻纹枯病和西瓜枯萎病都有增效10％左右。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中的复配剂的施用量为30克/亩。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中的复配剂的施用量为80克/亩。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施中，自然分离筛选过程中，将出发菌株接种于斜面培养基上，于32℃下培养2-3天后将得到的芽孢冲洗下来制成芽孢悬液，用生理盐水稀释成不同位数的稀释液，将各稀释液在平板上涂布，于30℃培养4天，挑选出菌株。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施中，自然分离筛选过程中，将出发菌株接种于斜面培养基上，于32℃下培养2-3天后将得到的芽孢冲洗下来制成芽孢悬液，用生理盐水稀释成不同位数的稀释液，将各稀释液在平板上涂布，于37℃培养2天，挑选出菌株。
Claims (10)
1.一种增效型抗病菌，其特征在于，为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，其微生物保藏登记号为：CGMCC No.7847。
2.如权利要求1所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，选用SD23菌株作为第一轮筛选的出发菌株，制备菌悬液，依次进行自然分离筛选、诱变处理筛选及高浓度申嗪霉素培养基培养筛选，并将高浓度申嗪霉素培养基培养筛选得到的菌株作为下一轮筛选的出发菌株，重复该过程多轮，最终得到目标菌株。
3.根据权利要求2所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，所述的自然分离筛选采用将出发菌株接种于斜面培养基上，于32℃下培养2-3天后将得到的芽孢冲洗下来制成芽孢悬液，用生理盐水稀释成不同位数的稀释液，将稀释液在平板上涂布，于30-37℃培养2-4天，挑选出菌株。
4.根据权利要求2所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，所述的诱变处理包括紫外线处理、紫外线/氯化锂复合处理、快中子处理、X光处理和Co60处理。
5.根据权利要求4所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，
所述的紫外线处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，并将菌悬液置于培养皿中，在10-15W的紫外灯下距离5-50cm避光照射0.5-5min后，稀释涂布；
所述的紫外线/氯化锂复合处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，进行紫外线处理，稀释，稀释后的菌悬液在0.1-1wt％的氯化锂的天冬素-葡萄糖培养基中于25-35℃下培养5-10天，稀释涂布；
所述的快中子处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，放在静电加速器产生快中子的减速剂铍旁，处理剂量为20krad-6krad，处理时间为0.1-2min，稀释涂布；
所述的X光处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，以2000-50000伦琴剂量处理0.5-50s，稀释涂布；
所述的Co60处理的条件为：将自然分离筛选得到的菌株制备成菌悬液，以0.5-10万伦琴剂量的γ射线照射处理0.5-2s，稀释涂布。
6.根据权利要求2所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，所述的高浓度申嗪霉素培养基培养筛选采用将诱变处理筛选后的菌株制备成菌悬液，在加有申嗪霉素的天冬素-葡萄糖培养基上涂布，于25-40℃下培养3-10天，挑选出菌株。
7.根据权利要求6所述的一种增效型抗病菌的培养方法，其特征在于，所述的高浓度申嗪霉素培养基中申嗪霉素的浓度为50-1000mg/L。
8.如权利要求1所述的一种增效型抗病菌的应用，其特征在于，将该增效型抗病菌与申嗪霉素制成复配剂，应用于防治水稻纹枯病及西瓜枯萎病。
9.根据权利要求8所述的一种增效型抗病菌的应用，其特征在于，所述的复配剂采用将1.0×109个/mL的增效型抗病菌悬浮液与1wt％的申嗪霉素悬浮液按照体积比为1:3～3:1复配制得。
10.根据权利要求9所述的一种增效型抗病菌的应用，其特征在于，所述的复配剂的施用量为30～80克/亩。
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Date of cancellation: 20230223 Granted publication date: 20200911 Pledgee: Fengxian Branch of Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANGHAI NONG LE BIOLOGICAL PRODUCTS CO.,LTD. Registration number: Y2021310000091 |
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Effective date of registration: 20230831 Granted publication date: 20200911 |