CN105061381B - 一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：(A)将花生红衣预处理后，超声浸提得到浸提液，将所述浸提液经过滤、减压蒸馏后得到浓缩液；(B)将所述浓缩液加水稀释经过大孔树脂进行层析吸附分离，流经大孔树脂的流速为0.3‑0.5mL/min，再用体积百分比浓度为3‑40％的乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为3‑5mL/min，收集洗脱液蒸发浓缩，即可。本发明实施例的去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法操作条件温和，成本低，既能保证提取得到的原花青素的品质还能很好的去除其中的黄曲霉毒素，提高了从花生红衣提取得到的原花青素后续应用的食品安全性，对人体健康没有任何危害，非常适合广泛应用推广。

Description

一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术提取领域，具体而言，涉及一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法。

背景技术

原花青素具有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病等多种生理和药理活性，是国际公认的天然抗氧化剂。它是由儿茶素、表儿茶素聚合而成，包括单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和高聚体，其中二聚体到五聚体称为低聚原花青素。在各种聚合物中，低聚原花青素的抗氧化活性最高，其抗氧化能力是维生素E的50倍。因其高效、低毒、高生物利用率而广泛用于食品、饮料、化妆品和保健品行业。目前原花青素的提取方法主要有溶剂萃取法、水提法、膜过滤法、层析法、液相色谱制备法等等。树脂柱层析法因其具有操作技术简单、再生方便、选择性好等优点，应用较为广泛。

目前，用于提取原花青素的原料多为葡萄籽或松树皮，以花生红衣为原料提取原花青素的报道相对较少。花生红衣是花生加工产品的副产物，属于低附加值产品，除了少量用于制药外，其余都用作饲料。花生红衣中含有丰富的原花青素，若能加以利用，可以大大提高花生红衣的综合价值和经济效益。但花生红衣容易污染黄曲霉毒素，在提取原花青素的过程中会同时被提取出来。

从1993年开始，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的物质，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。现有技术中如申请公开号为CN 103880805 A、CN 103214448 A和CN 104277025 A的专利中，均记载了一种从花生红衣中提取原花青素的工艺，但是均忽略了黄曲霉毒素残留在原花青素中，后续对人的危害性，可见以花生红衣为原料提取原花青素必须要考虑黄曲霉毒素的去除。申请公开号为CN 102532085 A的专利中公开了一种用次氯酸钠和氢氧化钠去除原花青素溶液中黄曲霉素的方法，虽然能把黄曲霉毒素去除，但这两种试剂,前者是强氧化剂，后者是强碱，原花青素易发生化学反应而失活。

因此，寻求一种既能得到高品质的原花青素又能去除其中黄曲霉毒素的方法是现如今亟待解决的技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，所述的去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法具有方法简单、操作条件温和，成本低，既能保证提取得到的原花青素的品质还能很好的去除其中的黄曲霉毒素，提高了从花生红衣提取得到的原花青素后续应用的食品安全性，对人体健康没有任何危害，非常适合广泛应用推广。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例提供了一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：

(A)将花生红衣预处理后，超声浸提得到浸提液，将所述浸提液经过滤、减压蒸馏后得到浓缩液；

(B)将所述浓缩液加水稀释经过大孔树脂进行层析吸附分离，流经大孔树脂的流速为0.3-0.5mL/min，再用体积百分比浓度为3-40％的乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为3-5mL/min，收集洗脱液蒸发浓缩，即可。

现有技术中，用于提取原花青素的原料多为葡萄籽或松树皮，很少以花生红衣为原料进行提取原花青素，因为采用花生红衣提取的过程中会伴有黄曲霉毒素同时被提取出来，而现有技术的提取方法并没有切实解决如何去除原花青素中的黄曲霉毒素的问题，如果采用普通的药剂进行处理在将黄曲霉毒素去除的同时也破坏了原花青素本身的结构，原花青素会因被氧化而失活，失去了原有的价值。

鉴于以上问题的出现，本发明提供了一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，这种方法不仅简单有效，而且在彻底的去除了黄曲霉毒素的同时，还能很好的保留原花青素不被破坏，保证了其后续的应用价值。

首先将花生红衣预处理，预处理也就是先将花生红衣充分烘干后去除其中的水分然后进行粉碎，为了后续提取步骤的顺利进行，粉碎的目粒度最好在60目以上，这样颗粒度相对细腻均匀，使得其中的有效成分充分提炼出，不会有浪费。预处理过后，就是采用现有技术中常用的超声浸提、过滤以及减压蒸馏等步骤处理，经过减压蒸馏后得到的浓缩液中是含有黄曲霉毒素的。将浓缩液继续进行处理的步骤是本发明要保护的重点。首先需将浓缩液加水稀释经过大孔树脂进行层析吸附分离，加水稀释的倍数最好控制在3-5倍，浓度小吸附的更加完全，但是浓度也不易太小会影响操作时间。流经大孔树脂的上样流速为0.3-0.5mL/min，再用体积百分比浓度为3-40％的乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为3-5mL/min。这里流经大孔树脂的流速以及洗脱的流速均是发明人通过大量的实验优化出来的参数范围，上样流速太大，会影响目标物向树脂内表面的扩散，导致大孔吸附树脂的吸附率有所降低，不利于原花青素的纯化，浪费样品，流速太小，纯化时间会太长，综合考虑来说最好控制在上述上样流速范围内，相应的洗脱流速越小效果越好，目标物洗脱的越完全，但是流速太慢操作时间太长，流速太大会导致原花青素解吸不完全，得率偏低，因此也需要控制在合适的洗脱流速范围内。

具体洗脱时，在用体积百分比浓度为3-40％的乙醇水溶液洗脱之前先采用纯化水洗脱后并将洗脱液弃掉，洗脱的流速为3-5mL/min，采用纯化水而不是普通的水是防止杂离子的污染，而且在采用乙醇洗脱之前先采用纯化水洗脱的目的是为了除杂、多糖以及蛋白质。用乙醇洗脱时最好也分两个步骤进行，先用3-8％的乙醇水溶液洗脱后将洗脱液弃掉，此操作可以将原花青素中的单体去除，再用30-40％的乙醇水溶液洗脱后将洗脱液收集，可以得到高纯度的原花青素低聚体，原花青素低聚体的抗氧性效果最佳，因此得到的原花青素最好以低聚体为主，如果乙醇浓度再高可能会将原花青素的高聚体以及部分的黄曲霉毒素洗脱下来，因此最好将乙醇水溶液的浓度控制在合适的范围内。

另外，需要注意的是，纯化水洗脱的用量为2-3倍柱体积，3-8％的乙醇水溶液洗脱用量为2-3倍柱体积，30-40％的乙醇水溶液洗脱用量为2-3倍柱体积；优选地，纯化水洗脱的用量为2倍柱体积，3-8％的乙醇水溶液洗脱的用量为2倍柱体积，30-40％的乙醇水溶液洗脱的用量为3倍柱体积。因为上样液与洗脱液的体积也与大孔树脂本身的吸附率密切相关，针对不同类型的大孔树脂，上样液与洗脱液的体积与大孔树脂的柱体积有个合适的比例，再控制一定的流速，从而使得吸附效果达到最佳。采用的大孔树脂可选择AB-8、ADS-7、D101、D3520、NKA-Ⅱ、DM130以及X-5中的其中一种，最好选择AB-8。

当然，对于一些辅助步骤比如浸提以及减压蒸馏操作，也有一些具体操作要求，比如超声浸提的步骤最好按照如下操作进行：每千克花生红衣采用10-15L的体积百分比浓度为60-80％的乙醇水溶液在温度为40-60℃、功率为200-300W的条件下超声处理10-20min。在这个操作条件下s超声浸提，对于花生红衣中的原花青素提取的更加完全。

浸提后减压蒸馏的步骤最好在40-50℃、压力为-0.09～-0.08MPa的条件下蒸馏操作，优选采用真空旋转蒸发仪操作，最后洗脱液蒸发浓缩的步骤与以上操作步骤大同小异，在温度为40-50℃、压力为-0.09～-0.08MPa的条件下蒸馏操作，也是优选采用真空旋转蒸发仪操作，从而达到回收溶剂以及浓缩目标物的双重目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，方法简单有效，在彻底的去除了黄曲霉毒素的同时，还能很好的保留原花青素不被破坏，保证了其后续的应用价值；

(2)本发明实施例得到的原花青素的纯度高，只会有少量的多糖等杂质，并不影响产品的质量，不仅能将花生红衣很好的利用变废为宝，原料来源广，成本低，而且提取的原花青素品质也很高，较现有技术的提取方法得到的原花青素的各项指标均较优；

(3)得到的原花青素的聚合度低、纯度高，大孔树脂柱和提取溶剂可重复利用，节约生产成本，实用性强。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

以花生红衣为原料提取不含黄曲霉毒素的原花青素的方法采用以下工艺步骤：

1)预处理和浸提将200g的花生红衣(黄曲霉毒素B1含量200μg/kg)烘干并粉碎过60目筛，加入2L的体积百分比浓度为80％的乙醇水溶液，功率为240W、温度50℃超声浸提20min，得到含有原花青素和黄曲霉毒素的浸提液；

2)过滤和浓缩将上述浸提液真空抽滤得到澄清滤液，在温度45℃、压力为-0.08MPa下操作蒸发后得到浓缩液150mL；

3)柱层析将上述浓缩液加水稀释至300mL，然后上样至AB-8树脂柱，径高比为1:7，柱体积150mL，保持流速0.35mL/min至上样结束。本实施例中采用AB-8弱极性树脂，可以选择性吸附溶液中的原花青素和黄曲霉毒素，由于两者分子结构不同，与树脂的结合力不同，可据此将两者分离；

4)梯度洗脱先用300mL纯化水洗脱，流速5mL/min，弃去洗脱液，再用体积百分比浓度为5％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速5mL/min，弃去洗脱液，然后用体积百分比浓度为40％的乙醇水溶液450mL洗脱，流速5mL/min，收集洗脱液，为不含黄曲霉毒素的原花青素溶液。本实施例中采用5％的乙醇水溶液洗脱可以将原花青素中的单体去除，用40％的乙醇水溶液洗脱可以得到高纯度的原花青素低聚体，而黄曲霉毒素与AB-8树脂结合力较强不会被洗脱下来，仍留在树脂柱上；

5)浓缩和冻干将收集的洗脱液在温度50℃，压力-0.09Mpa的条件下进行真空旋转蒸发，然后进行冷冻干燥，得到所述不含黄曲霉毒素的原花青素。原花青素纯度为98％，得率为9.58％，黄曲霉毒素未检出。

实施例2

以花生红衣为原料提取不含黄曲霉毒素的原花青素的方法采用以下工艺步骤：

1)预处理和浸提将200g的花生红衣(黄曲霉毒素B1含量50μg/kg)烘干并粉碎过70目筛，加入3L的体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液，功率300W、温度60℃超声浸提10min，得到含有原花青素和黄曲霉毒素的浸提液；

2)过滤和浓缩将上述浸提液真空抽滤得到澄清滤液，在温度50℃、压力-0.09MPa的条件下旋转蒸发后得到浓缩液150mL；

3)柱层析将上述浓缩液加水稀释至450mL，然后上样至DM130树脂柱，径高比为1:8，柱体积150mL，保持流速0.5mL/min至上样结束；

4)梯度洗脱先用450mL纯化水洗脱，流速3mL/min，弃去洗脱液，再用体积百分比浓度为3％的乙醇水溶液450mL洗脱，流速3mL/min，弃去洗脱液，然后用体积百分比浓度为30％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速3mL/min，收集洗脱液，为不含黄曲霉毒素的原花青素溶液；本实施例中采用3％的乙醇水溶液洗脱可以将原花青素中的单体去除，用30％的乙醇水溶液洗脱可以得到高纯度的原花青素低聚体，而黄曲霉毒素与DM130树脂结合力较强不会被洗脱下来，仍留在树脂柱上；

5)浓缩和冻干将收集的洗脱液在温度40℃，压力-0.08MPa下进行真空旋转蒸发，然后进行冷冻干燥，得到所述不含黄曲霉毒素的原花青素。原花青素纯度为99％，得率为9.72％，黄曲霉毒素未检出。

实施例3

以花生红衣为原料提取不含黄曲霉毒素的原花青素的方法采用以下工艺步骤：

1)预处理和浸提将200g的花生红衣(黄曲霉毒素B1含量70μg/kg)烘干并粉碎过60目筛，加入2L的体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液，功率200W、温度50℃超声浸提15min，得到含有原花青素和黄曲霉毒素的浸提液；

2)过滤和浓缩将上述浸提液真空抽滤得到澄清滤液，在温度45℃、压力-0.09MPa的条件下旋转蒸发后得到浓缩液150mL；

3)柱层析将上述浓缩液加水稀释至300mL，然后上样至DM130树脂柱，径高比为1:7，柱体积150mL，保持流速0.3mL/min至上样结束；

4)用体积百分比浓度为35％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速4mL/min，收集洗脱液，为不含黄曲霉毒素的原花青素溶液；本实施例中用35％的乙醇水溶液洗脱可以得到高纯度的原花青素低聚体以及少量的原花青素单体以及多糖等杂质等，而黄曲霉毒素与DM130树脂结合力较强不会被洗脱下来，仍留在树脂柱上；

5)浓缩和冻干将收集的洗脱液在温度45℃，压力-0.08MPa下进行真空旋转蒸发，然后进行冷冻干燥，得到所述不含黄曲霉毒素的原花青素。原花青素纯度为96％，得率为9.87％，黄曲霉毒素未检出。

实施例4

以花生红衣为原料提取不含黄曲霉毒素的原花青素的方法采用以下工艺步骤：

1)预处理和浸提将200g的花生红衣(黄曲霉毒素B1含量50μg/kg)烘干并粉碎过80目筛，加入2.5L的体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液，功率300W、温度60℃超声浸提10min，得到含有原花青素和黄曲霉毒素的浸提液；

2)过滤和浓缩将上述浸提液真空抽滤得到澄清滤液，在温度50℃、压力-0.09MPa的条件下旋转蒸发后得到浓缩液150mL；

3)柱层析将上述浓缩液加水稀释至450mL，然后上样至DM130树脂柱，径高比为1:8，柱体积150mL，保持流速0.4mL/min至上样结束；

4)梯度洗脱先用300mL纯化水洗脱，流速5mL/min，弃去洗脱液，再用体积百分比浓度为8％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速3mL/min，弃去洗脱液，然后用浓度为38％的乙醇水溶液450mL洗脱，流速5mL/min，收集洗脱液，为不含黄曲霉毒素的原花青素溶液；本实施例中采用8％的乙醇水溶液洗脱可以将原花青素中的单体去除，用38％的乙醇水溶液洗脱可以得到高纯度的原花青素低聚体，而黄曲霉毒素与DM130树脂结合力较强不会被洗脱下来，仍留在树脂柱上；

5)浓缩和冻干将收集的洗脱液在温度40℃，压力-0.08MPa下进行真空旋转蒸发，然后进行冷冻干燥，得到所述不含黄曲霉毒素的原花青素。原花青素纯度为99％，得率为9.92％，黄曲霉毒素未检出。

比较例1

操作步骤基本与实施例4完全相同，只是步骤4)中洗脱时，先用300mL纯化水洗脱，流速5mL/min，弃去洗脱液，再用体积百分比浓度为8％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速3mL/min，弃去洗脱液，然后用浓度为50％的乙醇水溶液450mL洗脱，流速5mL/min，收集洗脱液。后续经测定，原花青素纯度为96％，得率为9.92％，黄曲霉毒素B1含量21μg/kg。

比较例2

操作步骤基本与实施例4完全相同，只是步骤4)中洗脱时，先用300mL纯化水洗脱，流速5mL/min，弃去洗脱液，再用体积百分比浓度为8％的乙醇水溶液300mL洗脱，流速3mL/min，弃去洗脱液，然后用浓度为60％的乙醇水溶液450mL洗脱，流速5mL/min，收集洗脱液。后续经测定，原花青素纯度为96％，得率为9.92％，黄曲霉毒素B1含量271μg/kg。

由上述实施例与比较例的具体操作步骤也可以看出，所采用的洗脱液的具体体积百分比浓度也需要严格控制在所要求范围内，如果体积百分比浓度过大，则黄曲霉素也会有少量的残留。本发明实施例的去除花生红衣黄曲霉毒素的方法不仅操作简单，而且得到的原花青素的纯度高，只会有少量的多糖等杂质，并不影响产品的质量，不仅能将花生红衣很好的利用变废为宝，原料来源广，成本低，而且提取的原花青素品质也很高，较现有技术的提取方法得到的原花青素的各项指标均较优。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (11)

1.一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将花生红衣预处理后，超声浸提得到浸提液，将所述浸提液经过滤、减压蒸馏后得到浓缩液；

超声浸提的步骤包括：每千克花生红衣采用10-15L的体积百分比浓度为60-80％的乙醇水溶液在温度为40-60℃、功率为200-300W的条件下超声处理10-20min；

(B)将所述浓缩液加水稀释经过大孔树脂进行层析吸附分离，流经大孔树脂的流速为0.3-0.5mL/min，采用纯化水洗脱后并将洗脱液弃掉，洗脱的流速为3-5mL/min；用3-8％的乙醇水溶液洗脱后将洗脱液弃掉，再用30-40％的乙醇水溶液洗脱后将洗脱液收集，洗脱流速为3-5mL/min，收集洗脱液蒸发浓缩，即可。

2.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，预处理的步骤包括：将花生红衣烘干后粉碎。

3.根据权利要求2所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，粉碎的目粒度在60目以上。

4.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，减压蒸馏的步骤包括：在温度为40-50℃、压力为-0.09～-0.08MPa的条件下蒸馏操作。

5.根据权利要求4所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述蒸馏操作采用真空旋转蒸发仪操作。

6.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，采用的大孔树脂为AB-8、ADS-7、D101、D3520、NKA-Ⅱ、DM130以及X-5中的其中一种。

7.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，将所述浓缩液加水稀释3-5倍。

8.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，纯化水洗脱的用量为2-3倍柱体积，3-8％的乙醇水溶液洗脱用量为2-3倍柱体积，30-40％的乙醇水溶液洗脱用量为2-3倍柱体积。

9.根据权利要求8所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，纯化水洗脱的用量为2倍柱体积，3-8％的乙醇水溶液洗脱的用量为2倍柱体积，30-40％的乙醇水溶液洗脱的用量为3倍柱体积。

10.根据权利要求1所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，蒸发浓缩的步骤包括：在温度为40-50℃、压力为-0.09～-0.08MPa的条件下将洗脱液采取蒸馏操作。

11.根据权利要求10所述的一种去除花生红衣中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述蒸馏操作采用真空旋转蒸发仪操作。