CN108753865A - 一种用于生产afg1的培养基及其制备afg1标准品的方法 - Google Patents

一种用于生产afg1的培养基及其制备afg1标准品的方法 Download PDF

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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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Abstract

本发明提出了一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；本发明通过变温培养提高了次级代谢产物真菌毒素的产量；原料易得，生产成本低，工艺操作更安全；通过密封袋的引入，模拟了自然微氧潮湿条件，提高了毒素的转化率，减少了转接过程污染风险；提取方法简单；溶剂回收利用成本迪；通过氮气吹干AFG1结晶，加己烷重结晶纯度提高到99％以上。

Description

一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法
技术领域
本发明涉及生物制备技术领域，尤其是涉及一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法。
背景技术
黄曲霉毒素污染是农作物、食品和饲料中主要的质量安全问题之一，是全世界共同关注和需要攻克的难题，因此对于黄曲霉毒素标准物质的需求十分广泛。其中，AFG1被认为是一种致癌力最强的天然物质。世界各国都制定了严格的限量标准，然而黄曲霉毒素产生条件受地域、气候、种植作物、储存条件等一系列因素的影响，其特性使防控成为世界性的难题。黄曲霉毒素属于霉菌次级代谢产物，不是其繁殖必须的代谢物，产量少，基质复杂，培养和提取纯化有较高的工艺要求，造成其价格昂贵。
我国对真菌毒素的研究自上世纪80年代，起步较晚，随着检测技术的发展和食品安全意识的不断提高，我国政府监管部门高度重视真菌毒素防控工作，于2016年6月在北京召开了第一届中国真菌毒素大会，并由中国农业科学院农产品加工研究所在北京牵头成立了国家真菌毒素防控科技创新联盟。联盟主题是“合作研究、联合攻关、成果共享”构建长效合作机制，为农产品质量安全真菌毒素防控科技交流提供开放的平台。虽然我国的检测技术和设备与国外相比，已没有差距，但在黄曲霉毒素标准物质的研制和生产方面尚未起步。目前，黄曲霉毒素标准物质的生产和研制被国外大型生物公司垄断，我国使用的黄曲霉毒素标准品主要依靠进口，国外比较知名的公司有德国的SIGMA公司、美国的ROMER公司，美国的ALEXIS公司，奥地利的Biopure公司，新加坡的Pribolab公司，以及以色列的FERMENTEK公司。
目前，在黄曲霉毒素标准物质的研制方法检索到文献两篇，刘综河在1983年报道，通过大米培养基可以生产AFG1，其工艺简单，用氯仿或石油醚提取，柱层析纯化，但污染大，产量低，培养基配方原始，没有商业价值。另外，专利号2015102106062为一种黄曲霉毒素B1的制备方法，利用花生壳、花生渣和蔗糖等培养基制备黄曲霉毒素，通过乙酸乙酯提取，基质复杂，真菌毒素生长缓慢，干扰因素和固体废弃物较多，提取方式单一，制约商品化生产。
发明内容
本发明提出一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法，工艺简便，生产成本低，过程安全可控，收率高，特别适于商品化生产。
本发明的一种技术方案是这样实现的：
AFG1主要结构为二氢呋喃环和香豆素，分子式为C17H12O7，难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速，其纯品为无色结晶，耐高温，熔点为244-246℃，结构式如下：
一种用于生产AFG1的培养基，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；
其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每195g-205g土豆加入495-505mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入15-25g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；
所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉975-985g，鸡蛋175-185g，酵母粉10-20g，蛋白胨30-40g，蔗糖180-190g，玉米浆575-585g，氯化钠3-7g，花生饼粉75-85g，水575-585g；
所述二级培养基的制备包括如下步骤：
S1、成分一的制备：将975-985g玉米粉、175-185g鸡蛋、5-10g蔗糖和10-20g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；
S2、成分二的制备：将30-40g蛋白胨，175-180g蔗糖，575-585g玉米浆，3-7g氯化钠，75-85g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；
S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。
本发明的另一种技术方案是这样实现的：一种利用上述培养基制备AFG1标准品的方法，包括如下步骤：
a、一级培养：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台接种到PDA液体培养基，培养温度28℃，转速180转/分钟摇床培养2天；
b、将步骤a培养好的菌种超净台全部接种到步骤S3的烧杯中，无菌搅拌均匀，转移至洁净一次性密封袋，每100g一袋，袋口不封；温箱中26℃培养3天，升高温度到31℃继续培养6天，袋口封死四分之三，保持温箱湿度在80％左右；
c、将步骤b样品袋放置大烧杯里，在121℃灭菌30min，灭活存活菌种；
d、在步骤c烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液1；重复以上操作一次，收集上清液2，备用；
e、将步骤d中的上清液1减压浓缩，添加三种QuEChERS净化粉，包括C18粉、氨丙基粉和氧化钙粉，振荡5分钟，离心后将上清液过0.22μm的有机滤膜；
f、将步骤e溶液移入洁净试管，30℃氮气吹干，收集底部结晶；
g、将步骤f结晶转移至洁净试管，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶；
h、收集结晶，经液相色谱质谱检测含量。
作为一种优选的技术方案，步骤d中，上清液2用于再次实验时第一次提取。
作为一种优选的技术方案，步骤e中，C18粉0.2g，用于吸附蛋白和脂类；氨丙基粉0.1g，用于吸附色素；氧化钙粉2g，用于吸水。
采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明通过变温培养提高了次级代谢产物真菌毒素的产量；原料易得，生产成本低，工艺操作更安全；通过密封袋的引入，模拟了自然微氧潮湿条件，提高了毒素的转化率，减少了转接过程污染风险；提取方法简单；溶剂回收利用成本低；通过氮气吹干AFG1结晶，加己烷重结晶纯度提高到99％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明黄曲霉毒素B1的标准曲线图；
图2为本发明样品黄曲霉毒素B1的提取离子流图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于生产AFG1的培养基，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；
其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每195g土豆加入495mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入15g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；
所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉975g，鸡蛋175g，酵母粉10g，蛋白胨30g，蔗糖180g，玉米浆575g，氯化钠3g，花生饼粉75g，水575g；
所述二级培养基的制备包括如下步骤：
S1、成分一的制备：将975g玉米粉、175g鸡蛋、5g蔗糖和10g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；
S2、成分二的制备：将30g蛋白胨，175g蔗糖，575g玉米浆，3g氯化钠，75g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；
S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。
一种利用上述培养基制备AFG1标准品的方法，包括如下步骤：
a.接种：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台放置到室温，将菌丝体接种到一级培养基。
b.一级菌种：将步骤b接种后培养基放置到密闭式摇床培养，温度控制28℃，转速180转/分钟，培养时间2天。
c.二级接种：将步骤c菌种在超净台每20mL转移到二级培养基密封袋中，搅拌均匀，袋口不封。
d.将接菌的密封袋放置在霉菌培养箱，控制温度26℃培养3天，袋口封死四分之三，升温度到31℃继续培养6天，保持温箱湿度在80％左右。
温度初始控制在26℃目的是初期利于3.6156菌丝体快速繁殖生长。然而，AFG1为3.6156的次级代谢产物，不是其生长所必须，菌体的生长适宜温度不等同于二次代谢产物的适宜温度。因此，在培养3天后将温度升高到31℃，模拟自然条件，维持高温高湿的培养环境更有利于AFG1的生长。
e.灭菌：将步骤e样品袋放置大烧杯里，121℃高压灭菌30min，确保产毒霉菌和孢子死亡，防止其扩散污染环境；同时有利于毒素的提取纯化。
f.提取：在步骤f烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液(清液1)；重复以上操作一次，收集上清液(清液2)，备用。清液2用于再次实验时第一次提取。
g.浓缩净化：合并所有的清液1，减压浓缩到50mL左右，用电子天平分别称取C18粉0.2g，氨丙基粉0.1g，氧化钙粉2g，与浓缩液混合后振荡涡混5分钟，10000转/分离心后上层清液过0.22μm的滤膜，得到浓缩净化液45mL。
步骤f中减压浓缩的甲醇回收得到1500mL，加入活性炭7.5g，氧化钙粉5g，振荡摇匀后滤纸过滤，下次试验重复使用。
h.将步骤g净化后的45mL溶液转移至洁净试管，30℃水浴氮气吹干。氮吹时应保持氮气管口离液面1cm左右，控制好气体流速，避免试管中溶液液面起泡或飞溅。
i.收集底部结晶，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶。得到AFG1成品0.12g，经液相色谱串联质谱检测，含量为99.0％。
实施例2
一种用于生产AFG1的培养基，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；
其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每200g土豆加入500mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入20g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；
所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉980g，鸡蛋180g，酵母粉15g，蛋白胨35g，蔗糖185g，玉米浆580g，氯化钠5g，花生饼粉80g，水580g；
所述二级培养基的制备包括如下步骤：
S1、成分一的制备：将980g玉米粉、180g鸡蛋、5g蔗糖和15g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；
S2、成分二的制备：将35g蛋白胨，180g蔗糖，580g玉米浆，5g氯化钠，80g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；
S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。
一种利用上述培养基制备AFG1标准品的方法，包括如下步骤：
a.接种：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台放置到室温，将菌丝体接种到一级培养基。
b.一级菌种：将步骤b接种后培养基放置到密闭式摇床培养，温度控制28℃，转速180转/分钟，培养时间2天。
c.二级接种：将步骤c菌种在超净台每20mL转移到二级培养基密封袋中，搅拌均匀，袋口不封。
d.将接菌的密封袋放置在霉菌培养箱，控制温度26℃培养3天，袋口封死四分之三，升温度到31℃继续培养6天，保持温箱湿度在80％左右。
温度初始控制在26℃目的是初期利于3.6156菌丝体快速繁殖生长。然而，AFG1为3.6156的次级代谢产物，不是其生长所必须，菌体的生长适宜温度不等同于二次代谢产物的适宜温度。因此，在培养3天后将温度升高到31℃，模拟自然条件，维持高温高湿的培养环境更有利于AFG1的生长。
e.灭菌：将步骤e样品袋放置大烧杯里，121℃高压灭菌30min，确保产毒霉菌和孢子死亡，防止其扩散污染环境；同时有利于毒素的提取纯化。
f.提取：在步骤f烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液(清液1)；重复以上操作一次，收集上清液(清液2)，备用。清液2用于再次实验时第一次提取。
g.浓缩净化：合并所有的清液1，减压浓缩到50mL左右，用电子天平分别称取C18粉0.2g，氨丙基粉0.1g，氧化钙粉2g，与浓缩液混合后振荡涡混5分钟，10000转/分离心后上层清液过0.22μm的滤膜，得到浓缩净化液46mL。步骤f中减压浓缩的甲醇回收得到1500mL，加入活性炭7.5g，氧化钙粉5g，振荡摇匀后滤纸过滤，下次试验重复使用。
h.将步骤g净化后的46mL溶液转移至洁净试管，30℃水浴氮气吹干。氮吹时应保持氮气管口离液面1cm左右，控制好气体流速，避免试管中溶液液面起泡或飞溅。
i.收集底部结晶，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶。得到AFG1成品0.13g，经液相色谱串联质谱检测，含量为99.2％。
实施例3
一种用于生产AFG1的培养基，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；
其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每205g土豆加入505mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入25g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；
所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉985g，鸡蛋185g，酵母粉20g，蛋白胨40g，蔗糖190g，玉米浆585g，氯化钠7g，花生饼粉85g，水585g；
所述二级培养基的制备包括如下步骤：
S1、成分一的制备：将985g玉米粉、185g鸡蛋、8g蔗糖和20g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；
S2、成分二的制备：将40g蛋白胨，182g蔗糖，585g玉米浆，7g氯化钠，85g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；
S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。
一种利用上述培养基制备AFG1标准品的方法，包括如下步骤：
a.接种：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台放置到室温，将菌丝体接种到一级培养基。
b.一级菌种：将步骤b接种后培养基放置到密闭式摇床培养，温度控制28℃，转速180转/分钟，培养时间2天。
c.二级接种：将步骤c菌种在超净台每20mL转移到二级培养基密封袋中，搅拌均匀，袋口不封。
d.将接菌的密封袋放置在霉菌培养箱，控制温度26℃培养3天，袋口封死四分之三，升温度到31℃继续培养6天，保持温箱湿度在80％左右。
温度初始控制在26℃目的是初期利于3.6156菌丝体快速繁殖生长。然而，AFG1为3.6156的次级代谢产物，不是其生长所必须，菌体的生长适宜温度不等同于二次代谢产物的适宜温度。因此，在培养3天后将温度升高到31℃，模拟自然条件，维持高温高湿的培养环境更有利于AFG1的生长。
e.灭菌：将步骤e样品袋放置大烧杯里，121℃高压灭菌30min，确保产毒霉菌和孢子死亡，防止其扩散污染环境；同时有利于毒素的提取纯化。
f.提取：在步骤f烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液(清液1)；重复以上操作一次，收集上清液(清液2)，备用。清液2用于再次实验时第一次提取。
g.浓缩净化：合并所有的清液1，减压浓缩到50mL左右，用电子天平分别称取C18粉0.2g，氨丙基粉0.1g，氧化钙粉2g，与浓缩液混合后振荡涡混5分钟，10000转/分离心后上层清液过0.22μm的滤膜，得到浓缩净化液47mL。步骤f中减压浓缩的甲醇回收得到1500mL，加入活性炭7.5g，氧化钙粉5g，振荡摇匀后滤纸过滤，下次试验重复使用。
h.将步骤g净化后的47mL溶液转移至洁净试管，30℃水浴氮气吹干。氮吹时应保持氮气管口离液面1cm左右，控制好气体流速，避免试管中溶液液面起泡或飞溅。
i.收集底部结晶，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶。得到AFG1成品0.14g，经液相色谱串联质谱检测，含量为99.4％。
需要说明的是，步骤e研磨仪每次使用后要清理干净，用消毒酒精擦拭干净，紫外灯消毒；步骤g温箱湿度在80％不能低于75％；步骤h三种QuEChERS净化粉要振荡均匀，充分吸附净化；氮气吹干时氮气针口不能和液面接触。
本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于生产AFG1的培养基，其特征在于，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；
其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每195g-205g土豆加入495-505mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入15-25g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；
所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉975-985g，鸡蛋175-185g，酵母粉10-20g，蛋白胨30-40g，蔗糖180-190g，玉米浆575-585g，氯化钠3-7g，花生饼粉75-85g，水575-585g；
所述二级培养基的制备包括如下步骤：
S1、成分一的制备：将975-985g玉米粉、175-185g鸡蛋、5-10g蔗糖和10-20g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；
S2、成分二的制备：将30-40g蛋白胨，175-180g蔗糖，575-585g玉米浆，3-7g氯化钠，75-85g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；
S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。
2.一种利用权利要求1所述培养基制备AFG1标准品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、一级培养：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台接种到PDA液体培养基，培养温度28℃，转速180转/分钟摇床培养2天；
b、将步骤a培养好的菌种超净台全部接种到步骤S3的烧杯中，无菌搅拌均匀，转移至洁净一次性密封袋，每100g一袋，袋口不封；温箱中26℃培养3天，升高温度到33℃继续培养6天，袋口封死四分之三，保持温箱湿度在80％左右；
c、将步骤b样品袋放置大烧杯里，在121℃灭菌30min，灭活存活菌种；
d、在步骤c烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液1；重复以上操作一次，收集上清液2，备用；
e、将步骤d中的上清液1减压浓缩，添加三种QuEChERS净化粉，包括C18粉、氨丙基粉和氧化钙粉，振荡5分钟，离心后将上清液过0.22μm的有机滤膜；
f、将步骤e溶液移入洁净试管，30℃氮气吹干，收集底部结晶；
g、将步骤f结晶转移至洁净试管，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶；
h、收集结晶，经液相色谱质谱检测含量。
3.如利用权利要求2所述的制备AFG1标准品的方法，其特征在于，步骤d中，上清液2用于再次实验时第一次提取。
4.如利用权利要求2所述的制备AFG1标准品的方法，其特征在于，步骤e中，C18粉0.2g，用于吸附蛋白和脂类；氨丙基粉0.1g，用于吸附色素；氧化钙粉2g，用于吸水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113234604A (zh) * 2021-04-30 2021-08-10 裕菁科技(上海)有限公司 一种用于真菌毒素生产的混合培养基的配制方法

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