CN101781345B

CN101781345B - 田蓟苷的制备方法

Info

Publication number: CN101781345B
Application number: CN2010101123710A
Authority: CN
Inventors: 王新春; 邢建国; 袁勇; 王鲁妹
Original assignee: First Affiliated Hospital of Medical College Shihezi University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Medical College Shihezi University; Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN101781345A

Abstract

本发明涉及一种田蓟苷的制备方法，具体包括以下步骤：将香青兰地上部分，用10～40重量倍数的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；浓缩、干燥所述提取液，得到浸膏粉；使用有机溶剂萃取所述浸膏粉，得到萃取液；浓缩所述萃取液后，进行硅胶柱层析，流动相采用复合洗脱剂，所述复合洗脱剂由A组分和B组分构成，所述A组分选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮或丁醇，所述B组分选自下述组中的至少一种：氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A组分与B组分的体积比为90∶10～10∶90，进行梯度洗脱得到洗脱液；以及合并相同组分洗脱液，浓缩，得到所述田蓟苷。根据本发明所提供的方法制备的田蓟苷纯度高，同时田蓟苷的得率也较高。

Description

田蓟苷的制备方法

技术领域

本发明属于中药提取物制备和应用领域，具体涉及一种田蓟苷的制备方法及其应用。

背景技术

香青兰为唇形科植物香青兰(Dracocephalum Moldevica L.)的干燥地上部分，夏季盛花期采割，除去杂质，晒干。花多萎缩，蓝紫色。气清香，叶微辛。香青兰含有大量的黄酮类化合物，如田蓟苷(Tilianin)、藿香苷(Agastachoside)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside)、木犀草素(Luteolin)、山奈酚(Kaempferol)、异鼠李素(Isorhamnetin)等。文献报道，其中，黄酮苷类化合物田蓟苷含量较高。

田蓟苷(tilianin)有显著扩张冠状动脉的作用，可用于制备治疗心血管疾病，特别是抗心肌缺血的药物。虽然黄酮苷类化合物中田蓟苷含量较高，但目前还没有得到很好的分离和提纯，也无市售的田蓟苷纯品。

综上，需要提供一种田蓟苷的制备方法，增加其纯度。

发明内容

为解决上述至少一个技术问题，本发明提供了一种制备高纯度田蓟苷的方法，同时提高了从香青兰中提取田蓟苷的得率。

为实现上述发明目的，本发明提供的田蓟苷的制备方法，包括以下步骤：(a)将香青兰地上部分，用10～40重量倍数的20～60vol％的醇溶液提取，得到提取液；(b)浓缩、干燥所述提取液，得到浸膏粉；(c)使用有机溶剂萃取所述浸膏粉，得到萃取液；(d)浓缩所述萃取液后，进行硅胶柱层析，流动相采用复合洗脱剂，所述复合洗脱剂由A组分和B组分构成，所述A组分选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮或丁醇，所述B组分选自下述组中的至少一种：氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，所述A组分与B组分的体积比为90∶10～10∶90，进行梯度洗脱得到洗脱液；以及(e)合并相同组分洗脱液，浓缩，得到所述田蓟苷。

本发明所提供的方法操作简便，提取效率高，所得田蓟苷的纯度不低于98％，可用于制备治疗心血管疾病的药物，如治疗冠心病、心肌梗死、心肌缺血等症，特别是对缺血心肌的保护，药效明显，质量可控性强。

根据本发明所提供的方法，步骤a所述醇溶液选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇或丙醇，提取时间为1～7h。

黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。黄酮苷类以及极性稍大的苷元(如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等)，一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。经反复实验发现，本发明所述田蓟苷难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，在对香青兰进行提取时，可以用20～60vol％的醇溶液进行提取，其中，以乙醇溶液的提取效果较好。

根据本发明，步骤b所述浓缩为减压浓缩，所述干燥为真空干燥，在此条件下浓缩和干燥的效果均可在不破坏田蓟苷有效成分的前提下达到最佳。

根据本发明的实施方式之一，步骤c所述有机溶剂选自下述组中的至少一种：乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，萃取次数为2～6次。

利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。研究人员发现，在制备田蓟苷的过程中，上述有机溶剂均能达到分离田蓟苷的效果，其中，选用乙酸乙酯进行萃取效果较好，在除去杂质的同时，还起到了分离苷和苷元、极性苷元与非极性苷元的效果，从而使得田蓟苷分离效果较好。

根据本发明所提供的方法，步骤d中采用的硅胶为100～200目的层析用硅胶H。根据本发明实施方式之一，浓缩后的所述萃取液与所述层析用硅胶H的重量比为1∶30～70。

硅胶H不含粘合剂，根据实验结果用于田蓟苷的分离效果最好，分离度较高。

硅胶柱层析流动相，依据所分离的提取物极性不同，可选用乙酸乙酯-丙酮、环己烷-丙酮、乙酸乙酯-石油醚、甲醇-氯仿、正丁醇-醋酸、四氯化碳-乙腈等，经研究发现，田蓟苷的分离中，采用乙酸乙酯-丙酮、氯仿-甲醇作为流动相分离效果较好。

根据本发明的实施方式之一，当步骤d中所述复合洗脱剂中A组分为甲醇且B组分为氯仿时，氯仿和甲醇的体积比依次为95∶5、9∶1、8∶2。此时能提高香青兰中田蓟苷组分的分离能力，得率高，同时缩短分析周期。

当流动相被设置为上述比例时，田蓟苷的组分主要在流动相氯仿-甲醇体积比为9∶1时被洗脱。因此，根据本发明实施方式之一，步骤e中所述相同组分洗脱液为氯仿和甲醇的溶剂体积比在9∶1时流出的洗脱液。此时的洗脱液中，田蓟苷有效成分最集中，因而合并这部分洗脱液，其分离效果最好，收率最高。

根据本发明所提供的方法，所述步骤e进一步包括用醇溶液对田蓟苷进行重结晶的步骤。根据本发明的实施方式之一，重结晶步骤中使用的所述醇溶液为40～60vol％甲醇-水溶液。

在提取分离田蓟苷过程中，为了进一步纯化所得田蓟苷，滤去杂质，可对田蓟苷进行重结晶。所用试剂可以包括甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿、乙酸乙酯等。根据实验结果，以50vol％甲醇-水溶液进行重结晶效果较好，所得产品纯度高。

本发明通过上述制备方法，首次从少数民族药物香青兰中得到了高纯度的田蓟苷，与现阶段对田蓟苷组分分离鉴定的提取工艺相比，提取纯度明显提高，可高达98％以上。同时，本发明所采用的流动相浓度梯度配比缩短了分析周期，增加了分离灵敏度，从而提高了各组分的分离能力，使得田蓟苷的得率提高。

附图说明

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的上述和其他目的、特征和优点作出进一步详细的说明。

图1为本发明提供方法的工艺流程图；

图2为根据本发明一个实施例所制备的田蓟苷的紫外光谱(UV)图；

图3为根据本发明一个实施例所制备的田蓟苷的红外光谱(IR)图；

图4为根据本发明一个实施例所制备的田蓟苷的电喷雾质谱(ESI-MS)图；

图5为根据本发明一个实施例所制备的田蓟苷的核磁共振氢谱(¹H-NMR)图；

图6为根据本发明一个实施例所制备的田蓟苷的核磁共振碳谱(¹³C-NMR)图。

具体实施方式

本发明提供的一种田蓟苷的制备方法，包括获得香青兰的提取物，以及对提取物进一步萃取、层析、结晶等步骤。下面结合附图，详述本发明所提供的方法。

如图1所示，首先，将1份重量的香青兰干燥的地上部分粉碎，用10～40重量倍数的20～60vol％的醇溶液提取，例如可以选用乙醇或甲醇或丙醇或它们的任意混合物回流提取1～5次，每次提取1～7h。然后，将提取液浓缩，例如可以采用减压浓缩的方法，浓缩后提取液呈膏状。之后再将膏状物干燥，例如可以采用真空干燥的方法，将膏状物制成浸膏粉。

将浸膏粉用有机溶剂萃取，得到萃取液。萃取用的有机溶剂包括，但不限于乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、乙醚、氯仿、溴苯或二氯甲烷，以及它们的任意组合。优选乙酸乙酯，萃取的次数一般为2～6次。

将萃取液浓缩后，进行硅胶柱层析。层析的步骤可以为：将浓缩后的萃取液中拌入硅胶，例如可以采用100～200目的层析用硅胶H，拌入的比例为浓缩后的萃取液与层析用硅胶H的重量比为1∶30～70。上柱完毕后，按梯度比例通入流动相进行洗脱。流动相采用复合洗脱剂，该复合洗脱剂由A组分和B组分构成，A组分可选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮或丁醇，B组分可选自下述组中的至少一种：氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷，A组分与B组分的体积比为90∶10～10∶90。例如流动相可以采用氯仿-甲醇或乙酸乙酯-丙酮，优选氯仿-甲醇。当流动相采用氯仿-甲醇时，氯仿和甲醇的梯度洗脱的溶剂体积比依次为95∶5、9∶1、8∶2，此时田蓟苷的组分主要在流动相氯仿-甲醇体积比为9∶1时被洗脱。最后，合并相同组分洗脱液并浓缩，得到田蓟苷提取物。

进一步地，为了提高田蓟苷的收率，还可利用醇溶液，例如40～60vol％、特别是50vol％的甲醇-水溶液，再对上述田蓟苷提取物进行重结晶，即得到淡黄色粉末状结晶，为田蓟苷成品，其纯度可达98％以上。经UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR对所得组分的结构进行鉴定，可知其为田蓟苷。

图2、图3为根据本发明的制备方法制备的田蓟苷的UV图谱和IR图谱。

图4为根据本发明的制备方法制备的田蓟苷的ESI-MS图谱，根据田蓟苷的ESI-MS的分析可知，ESI-MS特征峰在m/z 447[M⁺](正离子)，m/z 481[M+CL^-](负离子)，m/z 285.33[M+H-glc]，m/z 233.84[M⁺-CH₃]。再结合图5、图6所示的根据本发明的制备方法制备的田蓟苷的NMR图谱分析，可确定其分子量为446，分子式为C₂₂H₂₂O₁₀，其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO)图谱中表现出典型的黄酮苷类化合物的氢谱特征，通过耦合常数及化学位移可确定每个氢的归属，¹³C-NMR(DMSO，400MHz)图谱中呈现出22个碳信号，为1个CH₃，12个CH，8个季碳。δc表明分子中含一个羰基(δ182.9)。以上数据与文献报道数据基本一致，因此，可确定所得化合物为田蓟苷。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

首先，取2kg香青兰干燥的地上部分粉碎，用20重量倍数的40％vol的乙醇回流提取1次，提取时间为3h。然后，将提取液减压浓缩成膏状，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取3次。随后，将萃取液浓缩拌硅胶，所用提取物样品与层析用100目的硅胶H按重量比1∶50上样，进行柱层析，流动相采用氯仿-甲醇，以浓度梯度配比95∶5-9∶1-8∶2进行梯度洗脱，其中，田蓟苷组分在9∶1浓度范围内流出。最后，合并相同组分并浓缩，析出田蓟苷，再用50vol％甲醇-水溶液重结晶，得到淡黄色粉末状结晶。

(1)结构鉴定：取所得样品分别进行UV、IR、MS、NMR分析鉴定，确定实施例1所提纯的样品为田蓟苷。

(2)纯度鉴定：

熔点(mp)测定：255℃～257℃。

薄层色谱检测：采用三种展开体系进行检测，薄层板用硅胶HF₂₅₄板。展开剂A为氯仿-甲醇(体积比为8.5∶1.5)，R_fA为0.42；展开剂B为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶4∶1)，R_fB为0.45；展开剂C为甲苯-甲酸乙酯-甲酸(体积比为5∶4∶1)，R_fB为0.45；紫外254nm下见棕黑色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC归一化法测定含量，选定324nm和350nm为检测波长。选用甲醇-0.4％磷酸水溶液(48∶52，V/V)和甲醇-0.5％甲酸水溶液(27∶73，V/V)两种溶剂系统做归一化含量测定，以两种测定方法结果的平均值作为含量测定结果。将实施例1制备的田蓟苷结晶用甲醇溶解，经分析型高效液相色谱检测，采用归一化法定量，其纯度为99％。

经检测，实施例1提取得到的田蓟苷纯度为99％，得率为78.2％。

实施例2

首先，取1kg香青兰干燥的地上部分粉碎，用10重量倍数的50％vol的乙醇回流提取4次，提取时间为3h。然后，将提取液减压浓缩成膏状，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取3次。随后，将萃取液浓缩拌硅胶，所用提取物样品与层析用120目硅胶H按重量比1∶40上样，进行柱层析，流动相采用氯仿-甲醇，以浓度梯度配比17∶1-8∶1-3∶1进行梯度洗脱，其中，田蓟苷组分在8∶1浓度范围内流出。最后，合并相同组分并浓缩，析出田蓟苷，再用50vol％甲醇-水溶液重结晶，得到淡黄色粉末状结晶。

按照实施例1中方法对所得组分进行结构鉴定和纯度分析，可确定实施例2所提纯的样品为田蓟苷，其纯度为98％，得率为75.0％。

实施例3

首先，取3kg香青兰干燥的地上部分粉碎，用40重量倍数的60％vol的乙醇回流提取5次，提取时间为2h。然后，将提取液减压浓缩成膏状，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取4次。随后，将萃取液浓缩拌硅胶，所用提取物样品与层析用150目硅胶H按重量比1∶60上样，进行柱层析，流动相采用乙酸乙酯-丙酮，以浓度梯度配比16∶1-10∶1-4∶1进行梯度洗脱，其中，田蓟苷组分在10∶1浓度范围内流出。最后，合并相同组分并浓缩，析出田蓟苷，再用50vol％甲醇-水溶液重结晶，得到淡黄色粉末状结晶。

按照实施例1中方法对所得组分进行结构鉴定和纯度分析，可确定实施例3所提纯的样品为田蓟苷，其纯度为98％，得率为75.5％。

实施例4

首先，取2kg香青兰干燥的地上部分粉碎，用60重量倍数的20％vol的乙醇提取1次，提取时间为7h。然后，将提取液减压浓缩成膏状，再真空干燥成浸膏粉，用醋酸乙酯萃取6次。随后，将萃取液浓缩拌硅胶，所用提取物样品与层析用200目硅胶H按重量比1∶40上样，进行柱层析，流动相采用乙酸乙酯-丙酮，以浓度梯度配比15∶1-8∶1-3∶1进行梯度洗脱，其中，田蓟苷组分在8∶1浓度范围内流出。最后，合并相同组分并浓缩，析出田蓟苷，再用50vol％的甲醇-水溶液重结晶，得到淡黄色粉末状结晶。

按照实施例1中方法对所得组分进行结构鉴定和纯度分析，可确定实施例4所提纯的样品为田蓟苷，其纯度为99％，得率为76.3％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种田蓟苷的制备方法，具体包括以下步骤：

(a)将香青兰地上部分，用10～40重量倍数的体积百分比为20～60的醇溶液提取，得到提取液；所述醇溶液选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇或丙醇，提取时间为1～7h；

(b)浓缩、干燥所述提取液，得到浸膏粉；

(c)使用有机溶剂萃取所述浸膏粉，得到萃取液；所述有机溶剂选自乙酸乙酯；萃取次数为2～6次；

(d)浓缩所述萃取液后，进行硅胶柱层析，采用的硅胶为100～200目的层析用硅胶H，流动相采用复合洗脱剂，所述复合洗脱剂为氯仿-甲醇或乙酸乙酯-丙酮，所述洗脱剂中两组分的体积比为90∶10～10∶90，进行梯度洗脱得到洗脱液；以及

(e)合并相同组分洗脱液，浓缩，得到所述田蓟苷。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤b所述浓缩为减压浓缩，所述干燥为真空干燥。

3.如权利要求1所述的方法，其中，浓缩后的所述萃取液与所述层析用硅胶H的重量比为1∶30～70。

4.如权利要求1所述的方法，其中，当步骤d中所述复合洗脱剂为甲醇-氯仿时，步骤e中所述相同组分洗脱液为氯仿和甲醇的溶剂体积比在9∶1时流出的洗脱液。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤e进一步包括用醇溶液对田蓟苷进行重结晶的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述醇溶液为体积百分比40～60甲醇-水溶液。